Поиск веществ с ноотропной и нейропротективной активностью с использованием традиционных методов скрининга и аналитической компьютерной программы

Актуальность темы

: В последние годы в связи с ростом числа заболеваний, протекающих с нейродегенеративными изменениями и сопровождаемых нарушениями когнитивных функций (инсульты, сенильные деменции, в том числе болезнь Альцгеймера, старческое слабоумие, травмы мозга, интоксикации, инфекционные поражения центральной нервной системы) осуществляется активный поиск новых эффективных препаратов с ноотропным и нейропротективным действием. Одним из наиболее распространенных методов поиска является модификация структуры пирацетама (родоначальника группы ноотропов), путем изменения размеров цикла, строения боковой цепи, заместителей при экзоциклическом азоте (Воронина Т.А., 2000; Gumine, 1987), поиск среди антагонистов NMDA (Chazot and Hawkins, 1999; Brauner-Osborne, 2000; Hatton, 2001) и AMPA (Filial et. al., 1998; Brauner-Osborne, 2000) рецепторов глутаматергической системы, модуляторов AMPA рецепторов (ампакины) (Раевский К.С., 2002; Ingvar et. al., 1997; Hampson, 1998), среди лигандов мускариновых и никотиновых рецепторов холинергической системы (Levin, 1998; Hglen, 2001; Lachowicz et. al., 2001). Исследуются вещества, влияющие на различные стадии глутамат — кальциевого каскада, вызванного инсультом (Скворцова В.И., Гусев Е. И., 2001; Takasago et. al., 1998; Danbolt, 2001; Floyd et. al., 2002), в том числе антагонисты глутаматергической системы, блокаторы кальциевых каналов L-типа (Taya et. al., 2000; Cano-Abad et. al., 2001; Bogaert et. al., 2001), ингибиторы кальцийактивируемых нейрональных протеиназ (Wang and Yuen, 1994; Kinloch et. al., 1999), ингибиторы цитокинов (Kinloch et. al., 1999), вещества, влияющие на нейротрофил ингибирующий фактор (Yiang et. al, 1999) и др.

В ГУ НИИ фармакологии в течение ряда лет осуществляется поиск веществ с ноотропным и церебропротективным типом действия (Середенин С.Б., Воронина Т. А 2000). Найдены эффективные вещества среди производных пирролидона, пептидных аналогов пирацетама, ингибиторов пролилэндопептидазы, производных 3-оксипиридина, аминокислотных производных оксиникотиноилуксусной кислоты, и ряда других химических соединений. (Воронина Т.А., 2000; Гудашева Т. А. и соавт., 2002; Островская Р. У. и соавт., 1994; Середенин С. Б., Воронина Т. А 2000). Внедрен в клиническую практику антиоксидант мексидол, обладающий ноотропной, анксиолитической и нейропротективной активностью (Дюмаев К.М. и соавт., 1994; Воронина Т. А., 2002). На стадии клинических испытаний находятся препараты нооглютил (Воронина Т.А. и соавт., 1992; Гарибова Т. Л., 2000) и дипептид ноопепт (Ostrovskaya et. al, 1994; Gudasheva, Voronina, Ostrovskaya, 1996).

Последнее десятилетие для отбора наиболее перспективных потенциальных лекарственных препаратов используются разнообразные компьютерные программы. В частности с помощью QSAR, 3D молекулярного моделирования, методов молекулярного сходства и кластеризации, успешно прогнозируют биологическую активность химических соединений. Одной из таких программ является PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances) (Авидон В.В., 1974; Поройков В. В. и соавт., 1996; Hansch, 1993; Brown et. al., 1996; Lagunin, 2000; Douglas et. al., 2001). Прогноз компьютерной системы PASS основан на анализе взаимосвязей «структура-активность» (structure-activity relationships — SAR) с использованием обучающей выборки, содержащей большое количество разнородных химических соединений с различными видами биологической активности (более 1000 видов, включая основные фармакологические эффекты, механизмы действия и нежелательные свойствамутагенность, канцерогенность, тератогенность и др.). Будучи обученной, PASS позволяет прогнозировать спектры биологической активности для новых веществ по их структурным формулам. С помощью программы PASS и биологической оценки, выявлены вещества с противоязвенным, антигипертензивным и ангиогензивным эффектами (Мартынова Н.Б. и соавт., 2000; Филимонов Д. А., 2000; Лагунин А. А, 2001).

Методология изучения фармакологической активности потенциальных ноотропов и нейропротекторов хорошо разработана и включает исследование влияния веществ на обучение и память, в том числе нарушенные различными факторамигипоксиисостояния, вызванные экспериментальными ишемическими нарушениями и травмами мозга, холинергическим дефицитом и другие (Воронина Т.А., 2000; Мирзоян Р. С., 2000; Voronina, 1994; Smith et al., 1997; Camps, 2002). Между тем, у большинства экспериментальных моделей имеются существенные недостатки, в связи с этим представляется целесообразным разработка новых методов исследования. Особенно сложно моделирование геморрагических повреждений мозга, так как они приводят к высокой летальности животных, а используемые в эксперименте субарахноидальные геморрагии, не всегда адекватны патологиям, наблюдаемым у людей с интрацеребральными геморрагиями (Choi, 1995; Hickenbottom et. al., 1998).

Целью настоящей работы является поиск веществ с ноотропной и пейропротективной активностью при использовании традиционных методов и аналитической компьютерной программы.

Были поставлены следующие задачи:

1. Осуществить поиск веществ с антиамнестическим и противогипоксическим действием среди новых N-алкильных и N-ацильных производных 4-фенилпирролидона и ингибиторов пролилэндопептидазы;

2. Исследовать ноотропную активность веществ с высокой прогностической активностью полученных с использованием программы PASS;

3. Разработать систему тестов оценки нарушений функций ЦНС при нейродегенерации, вызванной интрацеребральной посттравматической гематомой (геморрагическим инсультом);

4. Изучить нейропротективный эффект наиболее перспективных соединений на модели геморрагического инсульта;

5. Исследовать свойства веществ на модели нейродегенеративпой патологии, вызванной дефицитом холинергической системы;

6. Провести изучение эффектов нооглютила на моделях интрацеребральной посттравматической гематомы и холинергического дефицита.

Научная новизна исследования: Модификация молекулы 4-фенилпирролидона, путем введения N-алкильных и N-ацильных заместителей приводит к образованию веществ с антиамнестическим эффектом в 45% случаев. Наиболее высокой антиамнестической и противогипоксической активностью обладает соединение под шифром ГИЖ 283 — N-алкильное производное 4-фенилпирролидона-2 (анилид-2-оксо-4-фенил-пирролидин-1-уксусной кислоты).

Впервые показана высокая прогностическая значимость компьютерной программы PASS, для поиска веществ с ноотропной активностью. Показано, что из 14 синтезированных соединений, различной структуры, с выявленным при использовании PASS высоким уровнем вероятности, наличия ноотропной активности (Pi<05), 12 веществ (85,7%) обладают антиамнестическими свойствами на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамином. При этом 56% соединений удовлетворяли жесткому критерию оценки антиамнестического эффекта — достоверному увеличению процента животных с полным сохранением памятного следа.

Разработан новый методический подход к оценке поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой, вызванной деструкцией мозговой ткани в области capsula interna. Показано, что наиболее значимыми и отчетливыми нарушениями являются изменение неврологического статуса, ослабление процессов обучения, памяти и гибель животныхпри этом 7 динамика нарушений характеризуется усилением патологии с 1-го по 14-й день наблюдения. Выявлены новые соединения (AG 5, AG 29, Е 4172, ИФ 8), которые введенные однократно через 4 часа после операции обладают способностью уменьшать гибель, ослаблять неврологические дефициты, улучшать процессы обучения и памяти у животных с ИПГ, что свидетельствует об их нейропротективном эффекте. По своей активности новые соединения не уступают, а в некоторых случаях и превышают действие нимодипина.

На модели нейродегенеративных нарушений, вызванных дефицитом холинергической системы (субхроническое введение скополамина) показана способность новых соединений (ГИЖ 283, ИФ 8) улучшать когнитивные функции и устранять тревожность животных.

Впервые показано, вовлечение серотонинергической системы в нейрохимический механизм анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы ИФ8. Вещество в дозе 1 мг/кг (ноотропной) увеличивало содержание 5-ОИУК, а в дозе 5 мг/кг (анксиолитической) снижал уровень метаболита.

Впервые показано, что ноотропный препарат нооглютил обладает нейропротективными свойствами на моделях патологий: интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и дефицита холинергической системы, вызванной повторным введением скополамина.

Научно-практическая значимость работы: В результате проведенного исследования выявлены новые перспективные соединения, различной структуры (ГИЖ 283, ИФ 8, AG 4а, AG 4b), обладающие антиамнестическими свойствами. Методика оценки поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой позволяет оценить комплекс патологических изменений возникающих у животных после операции и может применяться для разработки и создания современных лекарственных средств, эффективных при лечении повреждений мозга. Получены данные, расширяющие показания для клинического применения нооглютила.

выводы.

1. Установлено, что среди новых производных 4-фенилпирролидона с N-алкильными и N-ацильными заместителями 45% соединений обладают антиамнестической активностью в дозах 1 и 10 мг/кг на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной скополамином.

2. Показано, что среди выявленных с помощью компьютерной программы PASS (версия 1,603 в интерпретации Pharma Expert) четырнадцати соединений с уровнем вероятности наличия ноотропной активности (Ра>0,5) 85,7% веществ в дозах 1 и 10 мг/кг обладают антиамнестическими свойствами.

3. Разработан новый методический подход оценки поведения и состояния животных с интрацеребральной посттравматической гематомой (геморрагическим инсультом). Показано, что у крыс после инсульта, вызванного деструкцией мозговой ткани в области capsula interna, наиболее выраженными нарушениями являются дефициты неврологического статуса, ослабление процессов обучения и памяти и гибель животных. При этом динамика нарушений характеризуется усилением патологии с 1-го по 14-й день наблюдения.

4. Выявлено, что новые соединения под шифрами AG 5, AG 29, Е 4172, ИФ 8, а также нимодипин снижают гибель, ослабляют неврологический дефицит, улучшают процессы обучения и памяти у животных с интрацеребральной посттравматической гематомой, что свидетельствует об их нейропротективном эффекте.

5. Установлено, что соединения ГИЖ 283, ИФ 8 позитивно влияют на нарушения когнитивных функций в условиях методики амнезии условного рефлекса активного и пассивного избегания, а также на тревожность в приподнятом крестообразном лабиринте у крыс с дефицитом холинергической системы.

6. Показано вовлечение серотонинергической системы в нейрохимический механизм реализации анксиолитического и ноотропного эффектов ингибитора пролилэндопептидазы ИФ 8.

7. Экспериментально установлено, что ноотропный препарат нооглютил обладает нейропротективными свойствами на моделях интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и дефицита холинергической системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В проведенном исследовании были использованы три подхода для поиска веществ и ноотропной и нейропротективной активностью. Это модификация молекулы родоначальника группы ноотропов пирацетама, исследование ингибиторов пролилэндопептидазы — веществ, воздействующих на одно из патогенетических звеньев нарушений мнестических и эмоционально — поведенческих функций, а именно пептидергического механизма, а также поиск эффективных веществ на основе компьютерного прогнозирования с использованием программы PASS.

Показано, что модификация молекулы 4-фенилпирролидона с введением N-алкильных и N-ацильных заместителей приводит к образованию веществ с выраженной антиамнестической активностью. Установлено, что 7 из 9 (77%) изученных соединений обладают в дозах от 1 до 10 мг/кг антиамнестическим эффектом на модели амнезии УРПИ, вызванной скополамииом. При исследовании побочных, нежелательных эффектов в диапазоне доз от 1 до 50 мг/кг у соединений не было выявлено угнетения ориентировочно-исследовательского поведения, двигательной активности, нарушений координации движений. Наиболее высокой антиамнестической активностью, способностью улучшать обучение УРАИ и противогипоксическим эффектом обладало вещество ГИЖ 283 — анилид 2-оксо-4-фенилпирролидин-1-уксусной кислоты. Эффект этого вещества как потенциального ноотропа выявлялся в дозе 1−5 мг/кг, что значительно превосходит эффект пирацетама и не уступает анирацетаму.

Исследование ингибиторов пролилэндопептидазы показало, что вещества под шифрами ИФ 8 и ИФ 11 в дозах 0,5 и 1 мг/кг обладают выраженным антиамнестическим эффектом, а при увеличении дозы до 5 мг/кг антиамиестические свойства вещества ослабевают, а выявляется анксиолитическая активность. В отличие от бензодиазепиновых анксиолитиков соединения ИФ 8 и ИФ 11 в дозах превышающих эффективные в 2−20 раз не проявляют седативного и миорелаксантного эффектов. Более эффективным по антиамнестическому и анксиолитическому действию оказалось соединение ИФ 8. Подобное сочетание антиамнестического и анксиолитического действия отмечается и у ряда других препаратов. Например, антиоксидант производное 3-оксипиридина мексидол (Дюмаев и соавт., 1995), дипептид ноопепт (Островская Р.У., 2001; Гудашева Т. А., 2002). Механизм ноотропного и нейропротективиого действия мексидола, в значительной степени определяется его антиоксидантными свойствами, а анксиолитический эффект связан с модулирующим влиянием на ГАМК бензодиазепиновый рецепторный комплекс за.

105 счет мембранотроиного действия препарата (Воронина Т.Л., 1998). Известно, что серотонинергическая система участвует в реализации анксиолитического эффекта ряда препаратов. В проведенных исследованиях показано, что соединение ИФ 8 повышало содержание норадреналина и дофамина в коре и серотонина в стриатуме. Однако это повышение, хотя и было отчетливо регистрируемым, имело низкий уровень достоверности. Наиболее выраженный дифференцированный по дозам эффект вещества выявлялся в гипиокампе. Так, в малой дозе, 1 мг/кг ИФ 8 достоверно увеличивал, а в дозе 5 мг/кг снижал содержание серотонина и его метаболита 5-ОИУК. Полученные данные свидетельствуют о вовлечении серотонинергической системы в нейрохимический механизм реализации анксиолитического и ноотропного эффектов ИФ 8.

Как отмечалось в обзоре литературы, для отбора соединений наиболее перспективных в качестве лекарственных средств используется разнообразные компьютерные методы. В частности для прогноза биологической активности и отбора веществ используют методы QSAR и 3D, методы молекулярного сходства и кластеризации. В настоящем исследовании применялась компьютерная программа PASS версия 1,603, основными составляющими которой являются: предоставление биологической активности, описание структуры химических соединений, база данных и знаний взаимосвязей структура — активность, алгоритм прогноза спектров биологической активности (Поройков и соавт., 2000). Предсказание спектра биологической активности осуществлялось группой исследователей во главе с профессором Поройковым В. В. на основе анализа взаимосвязей структураактивность, данные о которых хранятся в базе знаний SAR Base программы PASS. В рамках этой программы все соединения обучающей выборки представлены в виде набора MNA дескрипторов, и перечня видов биологической активности, проявляемых у каждого соединения. Для тестируемого соединения, в соответствии с набором его дескрипторов, вычислялись вероятности принадлежности к классу веществ, проявляющих / не проявляющих определенный вид биологической активности. Обучающая выборка PASS 1,603 включает 35 154 химических соединений, описываемых 35 712 различными MNA дескрипторами. Результат предсказания выдавался в виде списка названий видов биологической активности с соответствующими значениями вероятностей проявить (Ра) или не проявить (Pi) определенный вид активности. При этом если в прогнозе некоторый вид биологической активности был предсказан с вероятностью Ра>0,7, то, скорее всего, данное соединение проявит этот вид биологической активности в эксперименте, однако шанс, что это вещество является анатогом известного лекарственного.

106 соединения, может оказаться также значительным. Если 0,5<Ра<0,7, то существует большая вероятность, что данное соединение проявит определенный вид биологической активности в эксперименте, но она будет меньшей, чем в первом случае, и это вещество менее схоже с известными лекарственными соединениями. Если Ра<0,5, то вероятность того, данное вещество проявит заданный вид биологической активности в эксперименте — меньше, но если ее наличие экспериментально подтвердится, то такое вещество может оказаться принципиально новой базовой структурой. В качестве тестовой выборки в программе была использована база данных биологически активных соединений MDDR (MDL Drug Data Report) 99,2 фирмы MDL Information System Inc, которая содержит структуры и данные по биологической активности веществ, используемых и разрабатываемых в качестве потенциальных лекарственных средств. В MDDR представлена информация из патентов, конференций, журналов и сообщений компаний о 105 372 соединениях, которые включают 98 184 оригинальных структур. Согласно программе гранта INTAS (№ 00−711) химиками синтетиками были предложены около 1000 структур соединений, с предполагаемой иоотропной и нейропротективной активностью, а аналитики осуществили с помощью программы PASS прогноз их спектров биологической активности. Были отобраны и синтезированы 14 соединений различной структуры с заданными ноотропными и нейропротективными свойствами с Ра от 0,51 до 0,75. При изучении антиамнестического эффекта этих соединений установлено, что 98% (13 из 14) веществ обладают антиамнестическими свойствами — ослабляют амнезию УРПИ, вызванную скополамином. При этом восемь из четырнадцати соединений (56%) удовлетворяют жесткому критерию оценки эффекта в условиях этой модели — статистически достоверному увеличению количества животных, не зашедших в темную камеру установки при воспроизведении рефлекса. Показатель 56% соответствует коэффициенту вероятности биологической активности Ра>0,5.

Анализ возможного механизма, антиамнестического эффекта изученных соединений, с помощью PASS показал, что все соединения имеют структурное сходство с веществами, механизм действия которых опосредуется через холинергическую систему, с уровнем вероятности от 15 до 47%. Однако корреляционной зависимости между выраженностью антиамнестического эффекта и показателями уровня вероятности участия. холинергической системы в механизме антиамнестического действия соединений не было выявлено (г=0,25). Вместе с тем, согласно прогнозу PASS в механизме антиамнестического действия изученных соединений могут принимать участие и другие системы, ответственные за процессы обучения и памяти, например ГАМК-ергическая и глутаматергическая.

Как отмечалось в обзоре литературы, наиболее распространенной формой когнитивных расстройств являются деменции альцгеймеровского типа. Болезнь Лльцгеймера характеризуется хронически прогрессирующим течением и проявляется неукоснительным снижением когнитивных функций и умственных способностей. В процессе течения болезни морфологически регистрируется атрофия головного мозга, отложение сенильных бляшек, состоящих, в основном, из р-амилоида, нейрофибриллярные клубки, утрата синоптических связей, дегенерация преимущественно холинергических нейронов в ядрах базальных отделов переднего мозга. Согласно современной литературе предполагается, что процесс дегенерации нейронов запускается в результате нарушения регуляции различных нейротрофических факторов или их рецепторов, и это приводит к прекращению нейротрофической стимуляции определенных популяций нейронов. Факторы роста нейронов представляют собой белки, которые обладают способностью вызывать дифференцировку нейронов и поддерживать специфические функции нервных клеток. Отсутствие поступления в клетку таких факторов приводит к стимуляции экспрессии генов, которые запускают активный процесс клеточной смерти (апоптоз).

В связи с ключевой ролью холинергической системы в патогенезе ряда когнитивных расстройств, в экспериментальной медицине для моделирования амнезии используются различные модели нарушения функций этой системы, одной из наиболее адекватных моделей болезни Лльцгеймера может быть билатеральное повреждение ядер Мейнерта с помощью нейротоксина AF-64, различные модели скополаминовой амнезии (Prestor et al., 1988; Molchan et al., 1992). В настоящем исследовании для моделирования амнезии был использован М-холиноблокатор скополамин, который как при однократном, так и при субхроническом двухнедельном применении вызывал нарушение обучения и памяти, это согласуется с данными литературы (Izquierdo, 1989; Magnani et al., 1992). В настоящее время выявлено пять подтипов мускариновых рецепторов М1-М5 (Wess, 1996). Многие исследования, основанные на поведении животных свидетельствуют о том, что изменения обучения и памяти опосредуются через М| подтип мускариновых рецепторов (Hanter,. 1988;

Messer et al., 1990). Известно, что мускариновые М| рецепторы локализованы постсинаптически и их активация прямыми или не прямыми агонистами уменьшает ослабление когнитивных функций, связанных с ранними признаками болезни.

Лльцгеймера (Farlow et al., 1992; Soncrant et al., 1993). В ЦНС мускариновые рецепторы Мг подтипа распространены преимущественно на пресинаптических терминалях ацетилхолиновых рецепторов и являются ауторецепторами (регулируют высвобождение ацетилхолина), т. е. их стимуляция приводит к уменьшению.

108 холинергической нейропередачи (Pohorecki et.al., 1988; Stillman et.al., 1996). Альтернативный механизм через который можно осуществить усиление холинергической нейропередачи это облегчение высвобождения ацетилхолина из пресинаптических терминалей путем блокады Мг подтипа мускариновых рецепторов селективными антагонистами, в частности, ингибиторами обратного захвата. Показано, что блокада мускариновых рецепторов М2 подтипа вызывает увеличение выброса ацетилхолина и тем сильнее, чем большим аффинитетом к Мг рецептору обладает антагонист (в мозге крыс) (Billard et al., 1995). Скополамин — неселективный мускариновый антагонист в дозах (0,1−10 мг/кг, в/б.) вызывает дозо-зависимое увеличение выброса ацетилхолина в сриатуме (показано с помощью микродиализа) (Carey et al., 2001). Хотя скополамин и увеличивает выброс ацетилхолина он вызывает нарушение когнитивных функций за счет блокады постсинаптических М| рецепторов (Garey et al., 2001).

В настоящем исследовании была использована методика получения дефицита холинергической системы путем длительного двадцатидневного введения скополамина с последующей десятидневной отменой (схема 2.2, материалы и методы). Согласно данным Бурова Ю. В. и соавторы, (1991) пик снижения функций холинергической системы наблюдается только через десять дней после отмены скополамина, а непосредственно после окончания длительного введения скополамина отмечалось не ухудшение, а улучшение памятного следа. Существует предположение (Островская Р.У., 1995), что происходит это в связи с тем, что вследствие длительной блокады холинергических рецепторов, в результате включения механизмов обратной связи, развивается повышение плотности и афинности холинорецепторов, а к 10-му дню, после отмены скополамина, в результате ускоренного связывания наличного ацетилхолина развивается холинергический дефицит, приводящий к выраженному длительному нарушению познавательных функций и, как показано в нашем эксперименте, к ухудшению условно-рефлекторной деятельности. Не исключено, что в этом процессе принимают участие не только постсинаптические, но и пресинаптические М2 рецепторы, блокада которых скополамином (Carey, 2001) приводит к нарушению захвата ацетилхолина.

В проведенных исследованиях на модели длительного применения скополамина было показано, что у крыс с дефицитом холинергической системы регистрируются нарушения обучения, памяти и повышенная тревожность. Нооглютил, пирацетам и его аналог новое соединения ГИЖ 283, а также ингибитор пролилэндопептидазы ИФ 8 оказывали позитивное действие на нарушенные когнитивные функции на моделях УРПИ и УРАИ у крыс с холинергическим.

109 дефицитом. Кроме того, ИФ 8 устранял тревожность животных при тестировании в ПКЛ.

Известно, что пирацетам широко применяется в комплексной терапии у больных с ишемическим инсультом (Nikenbottom, 1998; Orgagozo, 1999; Ricci et.al., 2000), черепно-мозговой травмой (Goscinsski et al., 1998) и при последующей реабилитационной терапии (Huber, 1999; Kessler et.al., 2000), а также в качестве поддерживающей терапии при некоторых нейродегенеративных процессах (старческом слабоумии, болезни Альцгеймера и др.). Экспериментальные исследования подтверждают способность пирацетама оказывать нейропротективный эффект, механизм которого, в основном, связан с увеличением под его влиянием потребления глюкозы и кислорода в ишемизированной поврежденной зоне ЦНС (Goscinski et al., 1998; Gulieave, 1998). С другой стороны предполагается, что причиной нейродегенеративных заболеваний, подобных деменциям альцгеймеровского типа могут быть нарушения энергетического метаболизма. Эта теория подтверждается тем, что у больных страдающих болезнью Альцгеймера определяется пониженный уровень экспрессии гена GLUT-1 — соединения, которое является транспортером глюкозы через гематоэнцефалический барьер. Это приводит к снижению уровня доставки глюкозы к головному мозгу, т. е., к дефициту питатеьного субстрата, который необходим для его нормального функционирования. Устойчивый дефицит энергии может привести к продолжительному высвобождению возбуждающих нейротрансмиторов, таких как глутамат. И это в свою очередь может вызвать возникновение ряда эксайтотоксических реакций, связанных, например, с внутриклеточным накоплением кальция и с избыточной продукцией свободных радикалов и, в конечном счете, может привести к гибели клеток. В связи с вышеизложенным, помимо терапии f направленной на восполнение дефицита ацетилхолина при деменциях альцгеймеровского типа используют ноотроиные препараты, в частности пирацетам и родственные ему соединения, которые повышают интенсивность церебрального метаболизма глюкозы и за счет снабжения головного мозга энергией происходит улучшение ряда когнитивных характеристик.

Клинический эффект пирацетама реализуется, как правило в больших дозах (до 24 гр./день). В экспериментальных исследованиях в опытах на животных, в основном используются дозы от 200 до 800 мг/день. Наиболее эффективным соединением из группы производных 4-фенилпирролидона было вещество под шифром ГИЖ 283. Помимо выраженных антиамнестического и противогипоксического эффектов это соединение ослабляло нарушения поведения и памяти крыс на фоне холинергического дефицита. Причем позитивный эффект регистрировался в дозе 1 мг/кг. Таким образом,.

НО полученные данные свидетельствуют о преимуществах нового соединения перед пирацетамом, как потенциального ноотропа и нейропротектора.

Известно, что процесс нейродегенерации при болезни Лльцгеймера распространяется на корковые глутаматергические нейроны, а также на различные пептидергические нервные клетки. Несмотря на то, что установлена прямая связь между утратой холинергической инервации и расстройствами обучения и памяти, есть доказательства возможности возникновения на ранних этапах болезни первичной дегенерации корковых глутаматергических нейронов, что может привести к вторичной дегенерации холинергической системы (Maragos 1987; Terry 1994; Jellinger, 1994). Вследствие этих представлений, можно предположить почему нооглютил, механизм действия которого опосредуется глутаматергической системой эффективен на модели холинергического дефицита. Эффективность ИФ 8 в этих условиях, по-видимому, обусловлена его взаимодействием с пролилэндопептидазой. Об этом свидетельствуют данные, полученные Золотовым Н. Н. и соавторами (1992, 1995) в которых показано повышение активности ПЭП в коре и гиппокампе мозга крыс, а также установлена связь между этим явлением и состоянием холинергической системы (Zolotov, 1993).

Как отмечалось в обзоре литературы, для оценки нейропротективного действия веществ разработаны и используются модели глобальной, локальной ишемии мозга, модели геморрагического инсульта, различных травм мозга. (Воронина Т.Д., 2000; Мирзоян Р. С., 2000; Yackowski et al., 1990; Smith et al., 1997). В настоящем исследовании была использована новая модель оценки нейропротективного действия веществ — модель интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта), разработанная Макаренко Л. Н. и соавторами (1990). В результате проведенных исследований показано, что у крыс с ГИ наблюдались выраженный неврологический дефицит, нарушение координации движений, ослабление процессов обучения и памяти, гибель животных. При этом отмечалось углубление патологической симптоматики к 14-му дню наблюдения. Динамика ухудшения состояния и гибели крыс с ГИ может свидетельствовать о скрытой недостаточности компенсаторных реакций организма, нарастающих в определенные критические дни (3, 7, 14 сутки) послеоперационного периода и развитии сопутствующих осложнений (отек, набухание тканей, нарушение интрацеребральной гемодинамики, повышенного внутричерепного давления, ишемии мозга), (Макаренко Л.Н., 1990; Jackowski et al., 1990). В настоящем исследовании, ложно оперированные животные демонстрировали существенные отличия почти по всем регистрируемым показателям, как от интактньгх животных, так и от крыс с ГИ что связано, по-видимому, с реакцией на травмирование покровных тканей и черепа, при проведении.

III ложной операции. Вместе с тем, при сравнении ложно оперированных животных и крыс с ГИ, у последних отмечалось существенной ухудшение состояния и нарастание тяжести симптоматики. Это подтверждает определяющее значение геморрагического компонента в общей картине моделируемой патологии. Морфологические показатели также свидетельствовали о нейродегенеративных изменениях в зоне поражения.

Нооглютил, при введении животным однократно через 3−3,5 часа после операции обладал выраженным нейропротективным действием, предотвращая гибель крыс и существенно ослабляя нарушения неврологического статуса, улучшая память животных с посттравматической гематомой. При этом в дозе 20 мг/кг препарат обладал более отчетливым эффектом, предупреждая нарушения, памяти, а в дозе 10 мг/кг — сильным протективным действием в отношении неврологического дефицита и гибели животных, что сочеталось с менее выраженным влиянием на процессы обучения и памяти. Расслоение эффектов нооглютила в зависимости от дозы у животных с ГИ может свидетельствовать об особенностях моделируемой патологии, стадийности процесса и о наличии у нооглютила широкого спектра нейропротективного действия.

В неврологической клинике фармакотерапия последствий ГИ направлена на нормализацию гемокаогуляции и гемореологии, защиту нервной ткани в условиях нарастающей гипоксии, предотвращение нейротоксического действия медиаторов, предупреждение развития дезинтеграции головного мозга, восстановление баланса нейромедиаторов и другие (Е.И. Гусев, 2001; Jackowski, 1990; Choi, 1995; Obrenovitch, 1996). Нооглютил в условиях различных моделей церебральной патологии (ишемия мозга, черепно-мозговая травма, гипоксии мозга, вызванные различными факторами) обладает противоотечным действием, нормализует кровоснабжение мозга, устраняет межполушарную асимметрию кровоснабжения, корректирует биоэлектрическую активность при ишемии (Новиков В. Е, 1997; Алиев И. И., 1999; Воронина Т. А, 2000). Совокупность имеющихся в литературе данных и полученных в настоящем исследовании результатов позволяет заключить, что нооглютил осуществляет свой нейропротективный эффект, воздействуя различные звенья патологической системы, формирующейся вследствие острых нарушений мозгового кровообращения при ишемических и геморрагических инсультах. Нейропротективное действие нооглютила подтверждено в исследованиях срезов головного мозга крыс с ГИ, получавших нооглютил.

Как отмечалось в обзоре литературы нейрохимический, механизм действия нооглютила опосредован взаимодействием с глутаматергической системой. Широкое представительство глутаматергических рецепторов в гиппокампе и новой коре.

112 структурах напрямую связанных с формированием, хранением и извлечением следа памяти и механизмами обучения, явилось основой изучения влияния глутаматергических соединений на процессы обучения и память (Абрамец И.И., 1994, Lisman, 1999; Lee et al., 2000). Показано, что преимущественная активизация не NMDA рецепторов при низкочастотной стимуляции, соответствует «нормальным» условиям деятельности мозга, в то время как высокочастотная стимуляция приводит к активации NMDA рецепторного комплекса и связанна с переходом нейрона к иному уровню функциональной зависимости, необходимому для фиксации памяти. Было установлено так же, что высокочастотная спайковая активность афферентных волокон гиппокампа наблюдается: и в естественных условиях, когда требуется пластическая перестройка нейрона (фиксация новой информации, эмоциональная реакция и т. д.). В экспериментах с использованием селективных антагонистов различных подтипов глутаматных рецепторов выявлено преимущественное участие в этом процессе NMDA рецепторного комплекса (Collingridge, 1990). Характер ответов нейронов на высокочастотную стимуляцию носит двоякий характер: часть клеток (физического типа) на длительное время (часы, минуты) переходит в состояние эпилептиформной активности, более характерное для работы в условиях отсутствия факторов, подавляющих активность NMDA рецептора (ионы Mg2+, ингибирующие влияние ГАМК). У другой части нейронов (тонического типа) после нескольких спайковых разрядов возникала стойкая деполяризация мембраны, сохраняющаяся на протяжении нескольких часов и даже суток. Этот тип реакции клеток гиппокампа получил название долговременной потенциации (LTP) и лег в основу объяснения процессов нейрональной пластичности и фиксации памятного следа (Мотин В., 2000; Burgard, 1993, Danysz et al., 1995, Parsons et al., 1998).

Позитивное фармакологическое воздействие ноотропных препаратов на когнитивные функции в опытах наповеденческих моделях имеет электрофизиологические корреляты не только в форме усиления транскаллозальных вызванных потенциалов, но и в виде облегчения потенциации и пролонгирования LTP в гиппокампе. Нооглютил, как и ряд других ноотропов (пирацетам, этимизол) в срезах гиппокампа пролонгировал NMDA — зависимую LTP в синапсах, образованных аксонами перфорантного пути и на нейронах зубчатой извилины (Абрамец И.И., 1994; Комиссаров И. В., 2001). Этими же авторами выявлен АМРА модулирующий эффект нооглютила. Так, под влиянием препарата, в концентрациях близких к эффективным антиамнестическим (4, 6, 30 мкМ) при записи возбуждающего постсинаптического потенциала нейронов зубчатой извилины, вызванного электростимуляцией перфорантного пути, регистрировался существенный прирост максимальных амплитуд.

113 потенциала. В этом отношении нооглютил сходен с рацетамами: пирацетамом, анирацетамом (Абрамец И.И., 1994; Gouliaev, 1994).

Таким образом, основной механизм действия нооглюгила опосредован влиянием на АМРА подтип глутаматных рецепторов и неспецифическим связыванием с NMDA подтипом. АМРА потенциирующий эффект ноотропов зависит от концентрации и при достижении максиматьных позитивных значений снижается. В связи с этим, в высоких концентрациях ноотропы обладают депотенциирующим действием и этим исследователи объясняют, почему эти препараты не только не усиливают, но и противодействуют нейродегенеративным (эксайтотоксическим) повреждениям мозга, наблюдаемым при избыточной функции глутаматергических процессов (Комиссаров И.В., 2001).

Согласно данным литературы вещества, механизм действия которых связан с модулирующим влиянием на АМРА рецепторы глутаматной системы ампакины, обладают в эксперименте на животных ноотропными свойствами, Улучшают процессы обучения и памяти (Arai et al., 1994; Hampson et al., 1998). Нооглютил условно можно также отнести к препаратам такого типа действия. Выявленный у нооглютила нейропротекторный эффект открывает перспективу поиска нейропротективной активности у известных ампакииов.

Показано, что выраженным нейротропным эффектном обладает и ингибитор пролилэндопептидазы, соединение под шифром ИФ 8. Вещество ослабляло, вызванные интрацеребральной посттравматической гематомой нарушения обучения и памяти и неврологический дефицит. Кроме того, ИФ 8 улучшат память и уменьшат повышенную тревожность у крыс с холинергическим дефицитом. Полученные результаты позволяют предполагать, что у этого соединения помимо ноотропного определяется и нейропротекторное действие. Согласно данным литературы релизинг фактор тиротропного гормона, являющийся одним из физиологических субстратов пролилэндопептидазы оказывает положительное влияние на течение болезни Альцгеймера через взаимодействие с холинергической системой. Взаимодействие TRH с холинергическими нейронами включает, по-видимому, как пре-, так и постсинаптические эффекты: на пресинаптическом уровне пептид облегчает холинергическую нейропередачу, стимулируя скорость оборота ацетилхолина, на постсинаптическом — TRH усиливает возбуждающий эффект ацетилхолина на уровне нейронов коры (Winokur, 1978; Renaudet al., 1979). По данным Nikajima и соавторов, (1992) стимулирующий эффект ингибиторов пролилэндопептидазы на TRHиндуцированное высвобождение ацетилхолина может оказывать положительное влияние при пониженной функции ацетилхолинергической системы мозга. В свете.

114 этих представлений, позитивный эффект ИФ 8 на модели холинергического дефицита может быть связан с его опосредованным влиянием через пролилэндопептидазы, на TRH индуцированное высвобождение ацетилхолина. Кроме того, среди препаратов, которые оказывают положительный эффект на течение болезни Альцгеймера есть и эндогенные нейропептиды — вещество Р и TRH (Kowall et al., 1990; Nakajima et al, 1992). Последние, являются еще и субстратом для пролилэндопептидазы и дипептидилпептидаз (Bauer, 1987).

В полученных в настоящем исследовании результатах существенный нейропротективный эффект отмечался на модели интрацеребральной посттравматической гематомы у известного препарата нимодипина. Нейропротективный эффект нимодипина отмечается как в клинических условиях, так и на различных экспериментальных моделях, сопровождающихся нейродегенеративными процессами (Yacewicz et al., 1990; Korenkov et al., 2000). По данным ряда авторов эффект препарата обусловлен его способностью блокировать кальциевые каналы и таким способом осуществлять нейропротекцию (Triggle, 1991; Casno-Abad et al., 2001). Эффективность нимодипина на модели интрацеребральной посттравматической гематомы может косвенно свидетельствовать об адекватности этой модели для анализа состояния и поведения животных после геморрагического инсульта.

Таким образом, проведенные исследования показали, что все три использованных подхода для поиска препаратов с ноотропным типом действия результативны и позволили выявить активные соединения, обладающие избирательным антиамнестическим эффектом. Кроме того, у ряда веществ обнаружена противогипоксическая активность, которая может быть прогностическим признаком нейропротективного действия (Воронина Т.А., 2000). Исследование возможного нейропротективного эффекта новых соединений, а также пирацетама, нооглютила и нимодипина на новой модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) и в условиях скополаминовой модели холинергического дефицита позволило выявить у новых соединений (ГИЖ 283, ИФ 8), а также пирацетама, нооглютила и нимодипина. в разной степени выраженную способность ослаблять гибель, неврологический дефицит, нарушения обучения и воспроизведения памятного следа, повышенную тревожность животных.