Ранняя диагностика папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста методом полимеразной цепной реакции

Актуальность проблемы.

За последнее десятилетие накоплен большой фактический материал по вопросу гистофизиологии и патологии шейки матки (Кондриков Н.И., 1997, Кулаков В. И., 2000). Важное место в классификации заболеваний женских половых органов занимает раздел «Эпителиальные опухоли и связанные с ними поражения». Особой сложностью ранней диагностики характеризуются процессы, связанные с папилломавирусной инфекцией гениталий (плоскоклеточные интраэпителиальные поражения, цервикальная интраэпителиальная неоплазия) (Bosch Хау1ег, 1995, Манухин И.Б.1998, Минкина Г. Н.2004).

В настоящее время в мире отмечается неуклонный рост частоты генитальных заболеваний, вызванных вирусами папилломы человека (Роговская С.И. 2000). Папилломавирусная инфекция гениталий трансмиссивное заболевание, передающееся половым путем. Ранее наиболее известными практическим врачам, проявлениями ВПЧ инфекции гениталий являлись остроконечные кондиломы аногенитальной области. Частота их выявления по данным министерства здравоохранения РФ за 1998 год составляла 20,3 случая на 100 тысяч женщин детородного возраста (Роговская С. И. Прилепская В.Н.2003). По данным ВОЗ, в 1999 году общее число случаев генитальной папиллома-вирусной инфекции (остроконечные кондиломы) составило 30 млн. человек, а за последние годы возросло в 10 раз. В последние годы установлена четкая связь между возникновением рака шейки матки (плоскоклеточная карцинома), вульвы, и персистенцией у женщин папилломавирусов высокого канцерогенного риска (Munoz N. et al.2003, Куевда Д. А., Шипулина 0.10.2007). По данным министерства здравоохранения РФ за 1998 год, доля рака шейки матки среди злокачественных опухолей репродуктивной системы составила 16,2%. Ежегодно в России регистрируется 12,3 тысячи новых случаев рака шейки матки (Аксель Е.М., Давыдов М.И.2002).В 95% случаев выявления рака шейки матки у женщин детородного возраста регистрируется наличие папилломавирусов высокого канцерогенного риска (Прилепская В.Н.2004,Минкина Г. Н.2005). Характерной особенностью папилломавирус-ной инфекции гениталий является поражение лиц молодого возраста (Ада-скевич В.П., 2001).За последние 10 лет средний возраст заболевших раком шейки матки снизился с 58 до 55лет, а у женщин до 29 лет заболеваемость возросла в 2 раза.

Вирусы папилломы человека являются широко распространенной и гетерогенной группой вирусов. ВПЧ имеют кольцевой ДНК содержащий геном размером порядка 8 тысяч пар оснований. Таксономически вирусы папилломы делятся на роды (обозначаются греческими буквами (а, (3, у и т. д.), виды (обозначаются арабскими цифрами и буквой рода, например ос7, а9, (31 и др.), типы (обозначаются арабскими цифрами, например, 16, 18, 6, 11 и др.). Эпидемиологически выделяют «кожные», тропные к ороговевающему эпителию типы (в основном роды (3 и у) и слизистые или аногенитальные (тропные к слизистым оболочкам) типы вируса (род а). Среди последних выделяют подгруппы низкого (в основном виды а1, а8, а 10) и высокого канцерогенного риска (виды а5, а6, а7, а9) по их способности или неспособности оказывать трансформирующее воздействие на клетки эпителия. Эпидемиологическими исследованиями последних лет показано, что к группе высокого риска принадлежат типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82. Типы 26, 53 и 66 относятся к категории предположительно высокого риска. К группе низкого риска принадлежат типы 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81. Остальные типы относятся к категории неустановленного риска и чаще всего не ассоциированы с развитием патологий (Munoz N. et al. 2003 Куевда Д. А., Шипулина О.Ю.2006).

Специалисты, исследующие данную патологи, не раз обращали внимание на распространенность, частое бессимптомное течение, и сложность клинической диагностики из-за отсутствия или слабой выраженности специфических клинических проявлений, а также трудности прогнозирования отдаленных результатов вирусоносительства. Инфицированность ВПЧ в 10 раз выше, чем частота клинических проявлений инфекции (Куевда Д.А.2006).

Папилломавирусная инфекция гениталий может протекать в латентной форме (отсутствие морфологических или гистологических проявлений при обнаружении ДНК ВПЧ), субклинической форме (цитологическое подтверждение), и клинической форме (остроконечные кондиломы, внутриэпителиаль-ная неоплазия).

Папилломавирусной инфекцией гениталий занимаются врачи многих специальностей (вирусологи, онкологи, акушеры — гинекологи, дерматологи). Это обеспечивает общее снижение заболеваемости раком шейки матки. На фоне снижения общей заболеваемости нужно отметить возрастание его частоты у молодых женщин. Как, правило, это связано с неудовлетворительной ранней, диагностикой, отсутствием скрининговых программ выявления этиологического фактора (вирусной инфекции), не адекватным лечением фоновых и предраковых процессов шейки матки.

Традиционная последовательность выполнения скрининговых исследований представлена цитологическим обследованием, кольпоскопией, проведением исследований биоптата (Куевда Д.А., Шипулина О.Ю.2006). Цитологический анализ мазка является на сегодняшний день ведущим. Наиболее типичным признаком папилломавирусной инфекции являются койлоциты и дискератоз в сочетании с гиперплазией базального и парабазального слоев эпителия. Цитологический метод сложен, не объективен и не стандартизирован. Неадекватный забор материала (в случае не правильного забора материала в мазке могут преобладать клетки крови, бактериальная флора, и отсутствовать клетки плоского эпителия), не правильная подготовка предметного стекла и использование не подходящих цитощеток, методические ошибки — всё это может приводить к ложноотрицательным результатам. Ложноотрицательные результаты, ведут к необоснованному прекращению диагностического поиска. Наиболее информативным методом окрашивания является метод Папани-колау, менее информативными — метод Паппенгейма и Лейшманн, не информативными (но наиболее используемыми в России) — по Романовскому-Гимза. Даже при проведении исследования с окраской по Папаниколау чувствительность цитологического анализа по отношению к тяжелой дисплазии и раку составляет в среднем 58% (вариация от 20% до 87%) при специфичности 90−97%. Однако данный тест недостаточно распространен в России, методика сложная, а стоимость исследования очень высокая.

Колъпоскопия — метод является неспецифичным для папилломавирусной инфекции, так как выявляет морфологические изменения эпителия in vivo. Являясь хорошим вторичным методом подтверждения цервикальной патологии, попытки использования кольпоскопии в качестве скринингового теста показали, что чувствительность исследования составляет порядка 75% при специфичности — 20%. Кроме того метод требует длительного времени, высокой квалификации врача-кольпоскописта, наличия специального оборудования в кабинете врача.

Гистологическое исследование — является золотым стандартом диагностики, однако не может быть методом скрининга в силу инвазивности и трудоемкости. Потому так же является вторичным методом диагностики.

Современные скрининговые методы должны обладать высокой чувствительностью, возможностью широкого охвата, простотой исполнения и низкой себестоимостью.

В этих условиях важным информативным исследованием могло бы стать молекулярно-биологическое доказательство наличия папилломавирусной инфекции, и ее типирование (ДНК-гибридизация, полимеразно-цепная реакция). Эти методы молекулярной биологии позволяют выявить и дифференцировать различные типы вирусов с высокой точностью. Четкое определение принадлежности к группе риска с использованием молекулярных тестов позволило бы сфокусировать внимание на отдельных пациентах и тем самым значительно повысить эффективность установления стадии инфекции клиническими методами.

Развитие рака шейки матки не является молниеносным процессом. По данным ВОЗ переход тяжелой дисплазии в рак in situ длится в среднем 3−8 лет. Таким образом, врач располагает достаточным временем для обнаружения начальных форм поражения, вот почему проблема ранней диагностики папилломавирусной инфекции остается одной из актуальных задач практической гинекологии.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ASCUS — atypical squamous cells of undetermined significance, атипичные плоскоэпителиальные клетки неясного значения (АПКНЗ).

CIN — cervical intraepithelial neoplasia, обозначает степень дисплазии эпителия: 1 легкая, 2 средняя, 3 тяжелая.

HPV — human papillomavirus, вирус папилломы человека.

PCR — polymerase chain reaction, полимеразная цепная реакция.

HSIL — high grade squamous intraepithelial lesion, высокая степень внутриэпи-телиального поражения (В — ПИП), соответствует в гистологической классификации средней и тяжелой дисплазии CIN 2, CIN 3.

LSIL — low grade squamous intraepithelial lesion, низкая степень внутриэпите-лиального поражения (Н — ПИП), соответствует в гистологической классификации легкой дисплазии CIN1.

ВПЧ — вирус папилломы человека.

ПВИ — папилломавирусная инфекция.

ПЦР — полимеразная цепная реакция.

РШМ — рак шейки матки.

NK — natural killers, естественные киллеры.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

.

Цель настоящей работы: Оценить значение метода полимеразной цепной реакции в ранней диагностике папилломавирусной инфекции гениталий, как основного этиопатогенетического фактора развития злокачественных новообразований шейки матки.

Для достижения данной цели поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Оценить диагностическую ценность метода полимеразной цепной реакции для раннего выявления папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста.

2. Определить чувствительность и специфичность метода полимеразной цепной реакции, для выявления ВПЧ высококанцерогенных типов, как основного этиопатогенетического фактора развития диспластических процессов и рака шейки матки.

3.Выявить частоту обнаружения папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста при использовании данного метода.

4.Установить преимущества и оценить эффективность метода полимеразной цепной реакции в рамках диагностического скрининга женского репродуктивного населения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Установлено, что использование метода ПЦР диагностики у женщин детородного возраста позволяет выявлять ВПЧ даже при отсутствии клинических признаков патологии шейки матки и существенно расширяет показания к проведению дополнительных методов обследования.

Доказано, что при проведении таких дополнительных методов исследования как кольпоскопия, цитология, биопсия, поводом к которым была положительная реакция на ДНК ВПЧ, удается выявлять предраковые процессы шейки матки на доклинических стадиях заболевания.

Установлено, что возможность селективной диагностики различных типов вирусов позволяет выявлять те из них, при которых вероятность возникновения тяжелых дисплазий и рака шейки матки наиболее высока.

В масштабах диспансерного обследования женщин детородного возраста методами скринингового отбора, включая результаты ПЦР диагностики с использованием тест — системы «АмплиСенс ВПЧ высокого риска» удается выявить патологические процессы шейки матки у значительно большего количества пациентов и применить современные методы лечение (криодест-руктивные, лазерохирургические, радиохирургические) на ранних стадиях развития заболевания, включая доклинические формы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Практическое внедрение метода ранней диагностики папилломавирусной инфекции гениталий дает возможность выявления этой патологии у женщин репродуктивного возраста на доклинических стадиях заболевания, и предупреждать развитие злокачественных процессов шейки матки.

Результаты работы существенно дополняют представления о клинических, кольпоскопических, цито и гистологических проявления ВПЧ инфекции гениталий.

Разработанный алгоритм обследования больших групп женщин детородного возраста с использованием скринингового подхода и формированием групп повышенного онкологического риска позволяет оптимизировать тактику лечения вирус положительных изменений шейки матки.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВНЕДРЕНЫ в практику работы хирургических отделений городских больниц № 40, центра молекулярной диагностики ФГУН «Центрального НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, гинекологического отделения ФГУ «Поликлиники консультативнодиагностической» УДП РФ. Положения и выводы диссертационной работы используются в программе обучения студентов 5 и 6 курсов лечебного факультета Московского государственного медицинского стоматологического университета им. Семашко.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные материалы диссертации доложены на:

1.5 -ая Всероссийская Научно — практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней» Москва 2004.

2.Научно — практическая конференция, посвященная 30 кафедры хирургических болезней № 1 с курсом оперативной хирургии и 25 — летию клинической базы (Москва МГМСУ и ГКБ№ 40).

3. 6 -ая Всероссийская Научно — практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика» Москва 2007.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНЕСЕННЫЕ НА ЗАЩИТУ. 1. По данным обследования женщин детородного возраста, с применением ПЦР диагностики, у 40% из них выявляются различные типы паплломави-русной инфекции, а у 93% из всех инфицированных выявлены типы вирусов высокого канцерогенного риска.

2.При последующем использовании клинических и лабораторных цитологических методов исследования изменения эндоцервикса под действием онко-тропных вирусов удается обнаружить на стадиях вирусоносительства.

3.Комплексное лечение патологии шейки матки обусловленное папиллома-вирусной инфекцией на ранних стадиях заболевания позволяет предупредить переход легкой степени дисплазии шейки матки в тяжелую, и развитие рака шейки матки в дальнейшем.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация выполнена на 136 страницах, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Указатель литературы включает 94 отечественных и зарубежных публикаций. Работа иллюстрирована 19 рисунками, 7 таблицами, 9 диаграммами, 1 графиком и 6 схемами, приведены примеры из историй болезни. В работе использовались молекулярно — биологические, кольпоскопические, цитологические и морфологические методы исследования.

ВЫВОДЫ.

1. Метод полимеразно-цепной реакции имеет высокую диагностическую ценность для раннего выявления папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста.

2. Метод ПЦР отличается относительно низкой себестоимостью, высокой чувствительностью и специфичностью.

3. Проведенные исследования позволили выявить высокую (41,5%) частоту обнаружения папилломавирусной инфекции гениталий у женщин репродуктивного возраста.

4. Наибольшую диагностическую значимость тест на обнаружения серо-типов ВПЧ высокого онкогенного риска имеет в старшей (более 30 лет) возрастной группе женщин.

5. Метод полимеразно-цепной реакции в рамках диагностического скрининга женского репродуктивного населения позволяет выделить группу риска по развитию рака шейки матки и повышает эффективность ранней диагностики злокачественных поражений гениталий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Для практического здравоохранения очевидна целесообразность внедрения данных тестов в программу скрининга женщин репродуктивного возраста на предмет патологии шейки матки.

Тесты по выявлению ДНК ВПЧ являются высоко информативными и могут использоваться для:

• Массового тестирования на наличие ДНК ВПЧ в рамках скрининговых программ;

• Дополнения цитологических исследований (совместное применение цитологических исследований и тестов на ДНК ВПЧ позволяет значительно повысить эффективность мероприятий;

• Уточнения сомнительных результатов цитологических и гистологических анализов;

• Окончательного решения неоднозначных результатов кольпоскопии;

• Тестирования на ВПЧ после проведенного лечения.