Роль каннабиноидных рецепторов в регуляции устойчивости миокарда к действию ишемии-реперфузии

Актуальность. Согласно статистическим данным, в России сред лиц трудоспособного возраста от' сердечно-сосудистых заболеваний^ умирает 34% мужчин и 39% женщин [Оганов Р.Г. и др., 1994]. В структуре смертности от заболеваний, связанных с атеросклерозом, на долю ишемической болезни сердца (ИБС) у мужчин приходится 60% летальных исходов, а у женщин — 41% [Оганов Р.Г. и др., 1994]. Главной причиной смерти при ИБС является острый инфаркт миокарда (ОИМ) [Калинина A.M. и др., 1996; Сыркин A.C., 2003]. Такое положение дел связано с тем, что меры профилактики и лечения этой патологии несовершенны. Единственным эффективным методом лечения ОИМ является возобновление коронарного кровотока ишемизированного участка сердца (тромболизис, стентирование, коронарное шунтирование), которое, к сожалению, приводит к развитию реперфузионного синдрома. Лекарственных средств, способных радикально повысить устойчивость кардиомиоцитов к действию ишемии-реперфузии, в настоящее время не существует. Применяемые при лечении ОИМ фармакологические препараты (лидокаин, ß—адреноблокаторы, нитраты, антагонисты кальция) неспособны эффективно предотвратить ишемические и реперфузионные повреждения сердца, обладают узким спектром действия и приводят к развитию побочных эффектов [Марков В.А. и др., 1996; Преображенский Д. В. и др., 1998; Шалаев, C.B. и др., 2002; Moukarbel G.V. et al., 2004]. Причиной подобного положения дел является-ограниченность наших знаний о внутриклеточных сигнальных механизмах, регулирующих устойчивость кардиомиоцитов к патогенному действию ишемии-реперфузии. Таким образом, приходится констатировать, что до настоящего времени не созданы эффективные препараты, способные увеличить выживаемость кардиомиоцитов при инфаркте миокарда и обладающие минимумом нежелательных эффектов. В связи с этим, весьма актуален поиск новых кардиопротекторных препаратов, способных эффективно предупреждать развитие ишемических и реперфузионных повреждений.

После открытия феномена ишемического прекондиционирования [Jennings R. B, 1997; Murry С.Е. et al., 1986, 1990], в кардиологии получило развитие новое направление, суть которого заключается, в стимуляции эндогенных защитных механизмов при ишемии и реперфузии сердца. Суть названного феномена заключается в повышении толерантности сердца к патогенному действию длительной" ишемии после нескольких предварительных сеансов кратковременной > ишемиии реперфузии. Основными проявлениями ишемического прекондиционирования (ИП) являются: а) ограничение зоны инфаркта [Гурин A.B. и др., 1997; Каган-Пономарев М.Я., 1998; Кузнецов В. А. и Тодосийчук В: В., 1998; Литвицкий П. Ф., 1994; Сидоренко Г. И. и др, 1997; Хаткевич А. Н. и др., 1998; Bains С.Р. et al., 1999; Downey J.M. и Cohen V., 1995; Jennings R.B. и Reimer K.A., 1997; Kloner R.A. и Jennings R.B., 2001; Post H. и Heusch G., 2002; Schultz J.E.J, et al., 2001; Van, Winkle D.W. et ah, 2001]- 6) быстрое восстановление сократимости при реперфузии [Коркина О. В1 и др., 2001; Писаренко O. Ht и др., 1997; Cave A.C. 1992; Laurikka J. et al., 2002; Pantos C.I. et al., 1999; Takano H. et al., 2000; Tang X.L., 2002]- в) снижение выраженности ишемических и реперфузионных нарушений ритма сердца [Edwards R.J. et al., 2002; Kolar F. и Parratt J.R., 1997; Lawson C.S. et al., 1993; OkruhlicovaL., 1999; 2000; Sakamoto J. et al., 1999; Zhu J. Zhu и Ferrier G. R'., 1998]. Следовательно, феномен ишемического прекондиционирования представляет собой¡настолько эффективный способ защиты миокарда, что логично" было предположить — раскрытие механизмов, его развития позволит создать новые лекарственные препараты, способные предотвратить повреждения^ сердечной мышцы при ишемии-реперфузии.

Известно, что ишемическое прекондиционирование связано с активацией G-белок-сопряженных рецепторов GPCR (G-protein coupled receptor) [Вaines С.Р. et al., 1999; Downey J. и Cohen M.V., 1997; Post H. и Heusch G., 2002; Schulz J. E. J. et al, 2001]. Наиболее известными медиаторами ИП считают аденозин, брадикинин, опиоиды [Liu Y. et al., 1991; Goto M. et al., 1995; Chien G. L. et al.,.

1999; Miki Т. et al., 1998; Schultz J.E. J. et al., 1997]. Однако аденозин может усугублять течение кардиогенного шока за счет выраженного гипотензивного эффекта [Easton* A. R. et al., 2005], а опиоиды могут вызывать формирование опиатной’Зависимости-[Пятницкая И.Н. и др., 1994]. Недавно были получены доказательства того, что феномен ИИ способны воспроизводить каннабиноиды [Крылатов А. В: и др., 2002; Угдыжекова Д. С. и др., 2002; Маслов JT. Hи др., 2003; Ласукова О. В. и др., 2008; Bouchard JiF. et al., 2003; Ribuot С. et al., 2004]. Кроме того, данные литературы и ранее полученные нами результаты позволяли надеяться, что в развитии кардиопротекции важная роль принадлежит каннабиноидным (СВ) рецепторам. Группой канадских ученых под руководством P. Lepicier показано снижение реперфузионного выброса креатинкиназы и лактатдегидрогеназы из миокарда под влиянием эндогенных каннабиноидов'2-арахидонилглицерола и пальмитоилэтаноламида [Lepicier Р. et al., 2003]. Ранее нами было показано, что селективный агонист каннабиноидных рецепторов HU-210 при профилактическом применении может оказывать кардиопротекторный эффект, ограничивая размер инфаркта миокарда при коронароокклюзии-реперфузии, то есть имитирует феномен прекондициони-рования [Угдыжекова Д.С. и др., 2002аКрылатов A.B. и др., 20 026]. Вместе с тем, оставалось неизвестным, активация каких субтипов каннабиноидных рецепторов обеспечивает цитопротекторное действие HU-210 и где расположены эти рецепторы. Все вышесказанное послужило основой для исследования кардиопротекторных свойств лигандов* известных субтипов СВ-рецепторов и выявления рецепторной специфики полученных эффектов.

Наряду с повреждением целостности мембран кардиомиоцитов, ишемическое воздействие сопровождается развитием сократительной дисфункции миокарда во время ишемии и реперфузии [Ostadal В. и Kolar F., 1999]. В этой связи следует отметить, что каннабиноиды способны влиять на силу и частоту сокращений сердца при системном введении [Маслов JI.H. и др., 2006; Ford et al., 2002; Smiley et al., 1976; Vidrio et al., 1996] и в экспериментах на изолированном перфузируемом сердце [Маслов JI.H. и др., 2006]. Однако до настоящего времени нет единого мнения о роли этих соединений в регуляции инотропной функции сердца при ишемии/реперфузии.

Одним из опасных осложнений реперфузии, приводящих к серьезным нарушениям работы сердца, является возникновение желудочковых аритмий [Ostadal В*, и Kolar F., 1999]: Учитывая ранее полученные нами данные о способности, каннабиноидов повышать > устойчивость сердца к аритмогенному действию адреналина и аконитина [Угдыжекова и др., 2000, 2001; Крылатов и др. 2001, 2002], мы сочли целесообразным продолжить исследование антиаритмических свойств этих соединений в условиях ишемии/реперфузии изолированного сердца.

Характерным проявлением ишемических и реперфуз ионных повреждений миокарда является дисфункция эндотелия коронарных артерий, которая приводит к феномену неполного восстановления* коронарной перфузии (по-reflow phenomenon) [Ostadal Ви Kolar F., 1999]. В 2003 году J.F. Bouchard и соавт. обнаружили [Bouchard J.F. et al., 2003], что ишемическое прекондиционирование предупреждает нарушение эндотелий-зависимой вазодилатации, вызванное ишемией и реперфузией изолированного сердца. Прекондиционирование воспроизводили с помощью 5-минутной ишемии за 5 мин до глобальной ишемии изолированного сердца. Защитный эффект прекондиционирования не проявлялся в условиях блокады как СВ Г-рецепторов, так и после ингибирования СВ2-рецепторов [Bouchard J.F. et al., 2003]. Эндогенные каннабиноиды пал ьмитоилэтаноламид и 2-арахидонилглицерол (2-АГ) имитировали* вазопротекторный эффект прекондиционирования [Bouchard J.F. et al., 2003]. Представленные факты говорят о том, что* эндогенные каннабиноиды предупреждают повреждение эндотелия коронарных сосудов, вызванное ишемией-реперфузией изолированного сердца'. Однако было неясно, могут ли экзогенные каннабиноиды защищать эндотелий от действия ишемии-реперфузии. Эти факты послужили основанием для проведения нами фраг.

§ J мента исследований, в котором оценивали влияние активации СВ-рецепторов на скорость коронарной перфузии в условиях постишемической реоксигенации.

В настоящее время в научной литературе имеются лишь единичные работы, посвященные изучению сигнальных путей, опосредующих кардиопротекторные эффекты каннабиноидов [Lepicier P. et al., 2003]. В i, большинстве клеток каннабиноиды ингибируют аденилатциклазу за счёт активации 01/о-белков [Felder С.С. et al., 1993; Hillard С J. et al., 1990; Howlett A.C. et al., 1986; Sagan S. et al., 1999; Schlicker E. et al., 1997]. В тех клетках, где 1 СВ-рецепторы сопряжены с G^-белками, каннабиноиды стимулируют синтез цАМФ [Bonhaus D.W. et al., 1998; Glass M. и Felder С.С., 1997]. Относительно v роли СВ-рецепторов в регуляции уровня цАМФ в кардиомиоцитах не было полной ясности. Между тем, этот внутриклеточный мессенджер играет важную роль в аритмогенезе [Lubbe W.F., et al., 1992]. Другими возможными посредниками в сигнальном каскаде каннабиноидов могли являться протеинкиназа С, NO-синтаза. Данное предположение стало возможным благодаря имеющимся в литературе данным, доказывающим участие вышеназванных вторичных мессенджеров в механизме влияния каннабиноидов на миокард [Lepicier P. et al., 2003; 2004; Razavi Н.М. et al., 2005]. Относительно взаимодействия кардиальных СВ-рецепторов с АТФ-чувствительными К±каналами (КАтф-каналы) в литературе нет данных. Однако i известно, что эти1 каналы играют важную роль в кардиопротекторном эффекте ишемического прекондиционирования [Yellon D.M. и Downey J., 2003].

Учитывая все вышесказанное, нам представлялось целесообразным выяснить локализацию каннабиноидных рецепторов, регулирующих устойчивость сердца к ишемии-реперфузии, рецепторную специфичность и г внутриклеточные сигнальные механизмы, обеспечивающие кардиопротекторный эффект каннабиноидов при ишемии и реперфузии.

Цель исследования: исследовать роль кардиальных каннабиноидных рецепторов в регуляции устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии. Задачи:

1. Исследовать роль каннабиноидных рецепторов в формировании устойчивости изолированного сердца к патогенному действию ишемии-реперфузии.

2. Изучить влияние агонистов и антагонистов каннабиноидных рецепторов на сократимость изолированного сердца крыс в условиях нормоксии и постишемической реперфузии.

3. Выявить рецепторную специфичность кардиоваскулярных эффектов агониста каннабиноидных рецепторов Ни-210.

4. Исследовать влияние агонистов и антагонистов СВ-рецепторов на частоту возникновения аритмий и коронарный проток в условиях тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца,.

5. Оценить значение внутриклеточных сигнальных систем! цАМФ и цГМФ, протеинкиназы С, 1Ю-синтазы и КАтФ-каналов в реализации эффектов, связанных со стимуляцией каннабиноидных рецепторов.

Научная новизна.

В результате проведенных исследований впервые определена роль СВ1- и СВ2-каннабиноидных рецепторов в формировании устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии.

Приоритетными являются данные о влиянии агонистов каннабиноидных рецепторов на сократимость сердца, подвергнутого действию ишемии и реперфузии.

Новизна работы состоит в том, что в ней впервые проведено сравнительное исследование кардиопротекторных свойств селективных агонистов каннабиноидных рецепторов и выяснена рецепторная специфика полученных эффектов.

Впервые оценена роль эндогенных синтезируемых в миокарде агонистов СВ1- и СВ2-каннабиноидных рецепторов в формировании устойчивости сердца к повреждениям, вызванным ¡-действием ишемии ифеперфузии.

Несомненную новизну представляют приоритетные данные о роли протеинкиназы С и КАтФ-каналов в реализации кардиоваскулярных эффектов каннабиноидов.

Научно-практическая значимость.

Настоящая работа вносит вклад в развитие фундаментальных представлений о механизмах каннабиноидергической • регуляции сократительной, функции в условиях нормальной перфузии и в условиях моделирования ишемических и реперфузионных повреждений сердца. Результаты работы расширят представления о взаимодействии каннабиноидных рецепторов сердца с ионными каналами и внутриклеточными сигнальными системами в кардиомиоцитах.

Основные положения работы могут быть использованы, в качестве теоретической основы для прикладных исследований в области создания принципиально новых фармакологических препаратов, обладающих кардиопротекторным действием. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предварительная стимуляция СВ1-рецепторов миокарда обеспечивает значительное замедление процессов формирования необратимых повреждений мембран кардиомиоцитов в условиях тотальной ишемии и реперфузии in vitro.

2. В реализации каннабиноид-индуцированного повышения устойчивости сердца к повреждениям, вызванным действием тотальной нормотермической ишемии с последующей реперфузией, определяющую роль играет протеинкиназа С и КА1Ф-каналы.

3. Синтезируемые в миокарде эндогенные агонисты СВ1- и СВ2-рецепторов не играют существенной роли в регуляции устойчивости изолированного сердца интактных крыс к действию ишемии и реперфузии.

4. Стимуляция кардиальных СВ1-рецепторов индуцирует снижение насосной функции сердца в условиях нормоксии и постишемической реперфузии.

Апробация работы: Материалы диссертации представлены на конференциях: Всероссийской 63-й Итоговой научной студенческой конференции им. Н. И. Пирогова (Томск, 2004) — V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004) — 5 конгрессе молодых ученых Сибирского государственного медицинского университета «Науки о человеке» (Томск, 2004) — на конференции «Актуальные вопросы хирургии № 1″ Красноярской государственной медицинской академии» (Красноярск, 2005) — 11 всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Наука и образование» Томского государственного педагогического университета (Томск, 2007) — всероссийской конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» Санкт-Петербургской академии последипломного образования (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, из них — 10 в центральных журналах, 5 — в материалах международных, российских и региональных конференций.

Гранты.

• Государственный контакт № 02.740.11.0714 с Федеральным агентством по науке и инновациям на выполнение научно-исследовательских работ по лоту «Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров в области фундаментальной медицины и физиологии» шифр «2010;1.1−143−044» по теме: «Рецепторная природа и сигнальный механизм феномена посткондиционирования, индуцированного каннабиноидами» (шифр заявки «2010;1.1−143−44 005» 2010;2012 гг.

• Грант Министерства образования и науки РФ Регистрационный № 2.1.1/530 «Вклад каннабиноидных рецепторов в регуляцию устойчивости сердца к ишемическим и реперфузионным повреждениям» 2009;2010 гг.

• Государственный контакт № 02.512.11.2163 с Федеральным агентством по науке и инновациям на выполнение научно-исследовательских работ лот «Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований с участием иностранных научных организаций в области живых систем» шифр «2007;2−1.2−00−02−013» по теме: «Разработка на основе каннабиноидов нового лекарственного средства, увеличивающего устойчивость сердца к ишемии и реперфузии».

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям профессору Л. Н. Маслову и д.м.н. Д. В. Рыжковой, а также член-корр. РАМН проф. Лишманову Ю. Б. за неоценимую помощь при работе над диссертационной работой.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Проблема повышения устойчивости сердца к повреждающему действию ишемии и реперфузии является одной из наиболее важных задач современной кардиологии. Долгое время было неизвестно, можно ли вообще повысить устойчивость сердца к действию ишемии и реперфузии. Однако после открытия в 1986 г С. Murry и соавт. феномена ишемического прекондиционирования появилась надежда на разработку нового высокоэффективного метода профилактики повреждений кардиомиоцитов, возникающих при инфаркте миокарда [Murry С. et al., 1986]. Установлено, что фармакологическими агентами, имитирующими прекондиционирование помимо аденозина, брадикинина, опиоидов, могут являться и каннабиноиды [Joyeux-Faure М. et al., 2003; Lepicier P. et al., 2003]. Однако роль конкретных типов СВ-рецепторов в формировании повышенной устойчивости сердца к действию ишемии и реперфузии была изучена недостаточно, а также неизвестна локализация каннабиноидных рецепторов и внутриклеточные механизмы, опосредующие каннабиноидергическую устойчивость миокарда к повреждающему действию ишемии-реперфузии. В связи с этим, настоящая работа была разделена на следующие этапы:

• скрининг каннабиноидов на кардиопротекторную активностью;

• изучение инотропных и хронотропных эффектов каннабиноидов;

• выяснение рецепторной природы исследуемых эффектов агонистов каннабиноидных рецепторов;

• исследование роли каннабиноидов в регуляции коронарного протока и формировании аритмий;

• изучение сигнальных механизмов кардиотропных эффектов каннабиноидов.

Первоначальной задачей было определение значимости СВ-рецепторов в формировании устойчивости кардиомиоцитов к повреждающему действию ишемии и реперфузии. С этой целью в экспериментах на изолированном сердце мы изучили влияние агонистов СВ1- и СВ2-рецепторов на активность креатинкиназы, известного маркера повреждения мембран кардиомиоцитов, в перфузате за период реперфузии. В результате были получены данные о том, что целый ряд каннабиноидов, независимо от структуры их молекул, оказывают заметное цитопропротекторное действие в условиях ишемии и реперфузии миокарда. Антинекротический эффект проявлялся снижением реперфузионного выброса КФК в перфузат, оттекающий от сердца. По степени выраженности кардиопротекции исследуемые каннабиноиды располагались следующим образом: HU-210 > СР 55,940 > АСРА. Эти факты позволили нам предположить, что защитный эффект агонистов СВ-рецепторов был связан с активацией каннабиноидных рецепторов, так как наибольшее сродство к каннабиноидным рецепторам проявляет HU-210 [Pertwee R. et al., 1999].

Поскольку кардиопротекторный эффект проявлял селективный агонист СВ1-рецепторов АСРА, то можно было полагать, что цитопротекторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ1-рецепторов. Однако по кардиопротекторной активности этот СВ1-агонист значительно уступал HU-210. Кроме того, антинекротический эффект АСРА отмечался только при использовании препарата в концентрации 1 мкМ/л, в которой он может активировать и СВ2-рецепторы [Pertwee R. et al., 1999]. Исходя из сказанного, нельзя было исключить возможность того, что кардиопротекторный эффект каннабиноидов связан с активацией СВ2-рецепторов. Однако агонист СВ2-рецепторов JWH 133 не проявил кардиопротекторных свойств на модели тотальной ишемии и реперфузии изолированного сердца. Следовательно, для окончательного решения вопроса о рецепторной природе кардиопротекторного действия каннабиноидов необходимо было проведение дополнительных экспериментов с использованием высокоселективных антагонистов СВ-рецепторов. Эксперименты с использованием антагонистов каннабиноидных рецепторов показали, что кардиопротекторный эффект HU-210 in vitro связан с активацией СВ1-рецепторов.

Учитывая данные литературы об участии эндогенных каннабиноидов в патогенезе инфаркта миокарда [Batkai S. и Pacher Р. et al., 2009; Rosenson R.S. et al., 2009] и способности эндогенных каннабиноидов синтезироваться из мембранных фосфолипидов в сердце и сосудах [Hiley C.R. et al., 2009], были выполнены эксперименты с использованием селективных блокаторов каннабиноидных рецепторов 1-го и 2-го типов. Однако в результате оказалось, что эндогенные агонисты каннабиноидных рецепторов не играют существенной роли в регуляции устойчивости сердца интактных животных к действию ишемии и реперфузии.

Наряду с повреждением целостности мембран кардиомиоцитов, ишемическое воздействие приводит к развитию сократительной дисфункции миокарда и нарушению сердечного ритма во время реперфузии. В связи с этим, в дальнейшем мы изучили значение кардиальных каннабиноидных рецепторов в регуляции сердечного ритма и сократимости миокарда в условиях реперфузии. Было установлено, что все исследуемые каннабиноиды вызывают снижение ЧСС, причем максимальным отрицательным хронотропным действием обладает HU-210. Отрицательный хронотропный эффект HU-210 исчезал после блокады СВ1-рецепторов препаратом SR141716A и сохранялся после селективного ингибирования СВ2-рецепторов с помощью СВ2-антагониста SR144528 (рис. 31). Сами ингибиторы каннабиноидных рецепторов не влияли на ЧСС (рис. 31). Полученные факты свидетельствуют о том, что каннабиноидергическая брадикардия вызвана активацией СВ1-рецепторов, а синтезируемые в миокарде эндогенные агонисты этих рецепторов не участвуют в регуляции ЧСС интактных животных. Сходные данные были получены нами ранее в экспериментах in vivo, в которых агонисты каннабиноидных рецепторов оказывали отрицательный хронотропный эффект при их внутривенном введении [Маслов JI.H. и др., 2006]. Полученные результаты не противоречат данным других исследователей. Так, Н. Vidrio и соавт. было обнаружено, что отрицательный хронотропный эффект HU-210 сохраняется в условиях ваготомии, а химическая симпатэктомия даже усиливает HU-210-индуцированную брадикардию. [Vidrio Н. et al., 1996]. Согласно полученным нами ранее данным, отрицательный хронотропный эффект HU-210 сохраняется в условиях блокады симпатических и парасимпатических ганглиев гексаметонием, что служит веским доказательством прямого действии каннабиноидов на синусовый узел [Маслов JI.H. и соавт., 2006]. Следовательно, результаты проведенных экспериментов на изолированном сердце дают основания утверждать, что отрицательный хронотропный эффект каннабиноидов связан с активацией именно кардиальных СВ-рецепторов.

Все изученные нами каннабиноиды оказывали отрицательный инотропный эффект, максимально выраженный у агониста СВ1- и СВ2-рецепторов HU-210. Ранее К. А. Smiley и соавт. также сообщали об отрицательном инотропном эффекте каннабиноидов [Smiley et al., 1976]. Однако эти исследователи использовали неселективные каннабиноиды в очень высоких концентрациях в диапазоне от 0,3 до 31 мг/л [Smiley et al., 1976], что существенно повышало вероятность неспецифического действия этих соединений на сердечную мышцу. Мы применяли HU-210, который по сродству к СВ-рецепторам в несколько тысяч раз превосходит каннабиноиды [Pertwee, 1999], использованные К.A. Smiley и соавт. [Smiley et al., 1976] в концентрации 100 нМ/л, обеспечивающей взаимодействие этого агониста только с указанным типом рецепторов. В другой работе, выполненной A. Bonz и соавт. [Bonz A. et al., 2003], зафиксировано снижение силы сокращений изолированных трабекул, выделенных из предсердия человека, после добавления в перфузионный раствор HU-210 в конечной концентрации 1 мкМ/л. Исходя из вышеизложенных фактов, мы считаем, что отрицательное инотропное действие каннабиноидов является результатом активации кардиальных каннабиноидных рецепторов.

Другой факт, который необходимо подчеркнуть — это отсутствие достоверных изменений конечного диастолического давления после применения каннабиноидов. Общеизвестно, что увеличение конечного диастолического давления является косвенным признаком перегрузки кардиомиоцитов ионами кальция. Подобное увеличение КДД и кальциевая перегрузка могут быть следствием избыточной мобилизации Са" из саркоплазматического ретикулума (СПР) [Thandroyen F.T. et al., 1988] или результатом нарушения аккумуляции Са2+ в СПР [Du Toit, Opie et al., 1994]. Следовательно, активация каннабиноидных рецепторов препятствует развитию перегрузки кардиомиоцитов ионами кальция. Подобный эффект каннабиноидов.

Л I может быть связан: (1) с уменьшением выброса Са в СПР- (2) с усилением работы Санасосов, удаляющих кальций из миоплазмы. К сожалению, ни литературные данные, ни результаты собственных исследований не позволяют нам с уверенностью говорить, какой именно из двух названных механизмов включается в ответ на оккупацию СВ-рецепторов каннабиноидами. По всей видимости, активация каннабиноидных рецепторов ведет к ограничению.

04- О > мобилизации Са из СПР, так как усиление работы Санасосов привело бы к увеличению скорости расслабления миокарда. Мы же, напротив, наблюдали замедление релаксации миокарда в ответ на добавление в перфузат НЦ-210.

Наиболее трудным для обсуждения остается вопрос о рецепторной природе инотропного эффекта каннабиноидов. Выраженный отрицательный инотропный эффект оказывал только Ни-210, который обладает наибольшим сродством к каннабиноидным рецепторам, что говорит в пользу участия этих рецепторов в отрицательном инотропном эффекте каннабиноидов. Тот факт, что блокатор СВ-рецепторов 8Ш41 716 устранял эффект НХ1−210 на ДЛРЖ, а БШ44 528 не влиял на отрицательный инотропный эффект названного каннабиноида, говорит в пользу участия СВ1 -рецепторов в реализации отрицательного инотропного эффекта каннабиноидов. В пользу этого утверждения говорят и результаты экспериментов с агонистом СВ1-рецепторов метанандамидом, который также оказывал отрицательный инотропный эффект. Отсутствие изменений в сократимости сердца после добавления в перфузат селективного СВ2-агониста 1^¥-Н133 является аргументом против участия названных рецепторов в механизме каннабиноид-индуцированного отрицательного инотропного эффекта.

Одним из опасных осложнений ишемии и реперфузии является возникновение желудочковых аритмий. Согласно данным литературы и результатам ранее проведенных нами исследований, было известно, что каннабиноиды способны повышать устойчивость сердца к аритмогенному действию адреналина и аконитина [Угдыжекова и др. 2000, 2001; Крылатов и др. 2001, 2002]. В связи с этим, следующий раздел наших исследований был связан с изучением антиаритмического действия каннабиноидов. Однако полученные результаты указывают на то, что эндогенные каннабиноиды и экзогенные агониеты СВ1- и СВ2-рецепторов не участвуют в регуляции устойчивости сердца к аритмогенному влиянию реперфузии.

Наряду с такими проявлениями ишемических и реперфузионных повреждений миокарда, как некроз и апоптоз кардиомиоцитов, сократительная дисфункция сердца, аритмии, это патологическое воздействие сопровождается дисфункцией эндотелия коронарных артерий, которая приводит к феномену неполного восстановления коронарной перфузии (no-reflow phenomenon). В наших экспериментах наблюдалось отсутствие вазодилатирующего эффекта у всех исследуемых каннабиноидов. Поскольку литературные данные все же свидетельствовали об участии эндоканнабиноидов в регуляции функционального состояния сердца и сосудов [Ford W.R. et al., 2002; Pacher P. et al., 2005; Wagner J. et al., 1998], можно полагать, что сосудорасширяющее действие каннабиноидов реализуется путем активации СВЗ-рецепторов или анандамидовых рецепторов, на которые не действуют использованные нами каннабиноиды.

В итоге на данном этапе исследований были получены результаты, доказывающие, что активация каннабиноидных рецепторов способствует повышению устойчивости изолированного сердца к повреждениям, вызванным тотальной ишемией и реперфузией. При этом максимально выраженным кардиопротекторным и инотропным эффектом обладал СВ-агонист HU-210. Оставалось выяснить внутриклеточные сигнальные механизмы кардиопротропного действия каннабиноидов на миокард в условиях in vitro. Мы предположили, что в роли сигнальных посредников молекулярного механизма кардиопротекторного эффекта каннабиноидов могут выступать циклические нуклеотиды, КАТФ-зависимые каналы, ПКС и NO-синтаза.

Нам удалось установить, что в развитии цитопротекторного эффекта HU-210 участвует протеинкиназа С (ПКС), поскольку блокада этого энзима хелеритрином устраняла кардиопротекцию. С другой стороны, применение блокатора ПКС не влияло на отрицательный хронотропный эффект СВагониста HU-210. Кроме того, хелеритрин сам по себе снижал параметры сократимости изолированного сердца, что не позволило нам рассматривать значение этого сигнального мессенджера в качестве одного из звеньев каннабиноидергической регуляции инотропной функции миокарда. Сходные результаты получили I. Khaliulin и соавт. [Khaliulin I. et al., 2007], которые в опытах на изолированном перфузируемом сердце обнаружили, что хелеритрин устраняет антинекротический эффект ишемического прекондиционирования, но не влияет на положительный инотропный эффект прекондиционирования.

Механизм кардиопротекции с участием протеинкиназы С пока неизвестен. Это связано, прежде всего, с огромным количеством внутриклеточных белков, которые фосфорилирует данный фермент [Dempsey Е.С. etal., 2000]. Однако в настоящее время можно выделить несколько мишеней ПКС, которые участвуют в формировании адаптивной реакции сердца в ответ на чередование коротких циклов ишемии и реперфузии: это, прежде всего, АТФ-зависимые К±каналы (Катфканалы) [Fryer R.M. et al., 2001], а также тирозинкиназы [Baines С.Р. et al., 1998, 1999]. В связи с этим, мы попытались выяснить вклад Ка1ф-каналов в формирование устойчивости сердца к повреждающему действию коронароокклюзии-реперфузии.

В наших экспериментах было показано, что КАТФ-каналы также задействованы в реализации кардиопротекторного действия этого каннабиноида, поскольку блокатор КАТФканалов глибенкламид, используемый на фоне HU-210, способствовал устранению защитного эффекта HU-210. При этом применение блокатора КАтф-каналов позволило установить, что эти ионные каналы не играют существенного значения в реализации хронотропного действия СВ-агониста. Более того, ингибирование КАТФ-каналов сопровождается снижением параметров сократимости изолированного сердца, что не позволяет рассматривать значение этого сигнального пути в механизме каннабиноидергической регуляции инотропной функции миокарда.

Учитывая данные литературы о том, что каннабиноиды могут активировать синтез оксида азота [Bilfinger T.V. et al., 1998; Fimiani С. et al., 1999a- 1999bYusifzade K. et al., 2009], который играет важную роль в повышении устойчивости миокарда к ишемическим воздействиям [Yellon D.M. et al., Downey J.M. et al., 2003], мы предположили, что обнаруженные нами защитные эффекты каннабиноидов могут быть результатом стимуляции NO-синтазы. Существует три основных сигнальных механизма, через активацию которых реализуется действие NO* на клетку: (1) стимуляция гуанилатциклазы, (2) синтез пероксинитрита, (3) S-нитрозилирование [Зенков Н.К. и др., 2001; Otani Н. et al., 2004; Crow J.P. и Beckman J.S., 2005]. Наиболее изученным является сигнальный путь, связанный с активацией растворимой гуанилатциклазы. Так, связывание NO" с гемом гуанилатциклазы приводит к увеличению активности этого фермента в 400 раз и, соответственно, к усилению синтеза цГМФ [Зенков Н.К. и др., 2001].

Однако статистически значимых изменений уровня цГМФ в миокарде в ответ на стимуляцию СВ-рецепторов нам обнаружить не удалось (рис. 36). Следовательно, защитный эффект HU-210 развивался независимо от цГМФ, т. е. без участия гуанилатциклазной сигнальной цепи. Оставалось установить роль других NO-индуцированных механизмов в реализации кардиопротекторных и инотропных эффектов HU-210. Однако в случае предварительной блокады NO-синтазы с помощью L-NAME отмеченный кардиопротекторный эффект каннабиноида HU-210 сохранялся (рис. 36). Применение L-NAME оказывало отрицательный инотропный и хронотропный эффекты, которые еще более усиливались при использовании его с HU-210. Следовательно, наблюдаемые нами кардиотропные эффекты HU-210 не были связаны с активацией индуцированных NO-синтазой сигнальных механизмов.

В дальнейшем мы предположили, что в реализации инотропного и кардиопротекторного эффектов HU-210 принимает участие цАМФ. Это предположение было основано на известных литературных данных о способности каннабиноидов ингибировать синтез цАМФ [Howlett A.C. et al., 1990]. В проведенных экспериментах нами было зафиксировано снижение уровня цАМФ в миокарде при активации СВ-рецепторов. Однако снижение параметров сократимости и реперфузионный выброс КФК, происходящие под влиянием активации СВ рецепторов, в наших опытах не коррелировали с изменения внутриклеточной концентрации цАМФ. Значит, в реализации инотропного эффекта СВ-агониста задействованы другие сигнальные пути и в роли вторичного мессенджера могут выступать, возможно, инозитолтрифосфат или диацилглицерол.

Суммируя все полученные нами данные, можно заключить, что в реализации каннабиноид-индуцированного повышения устойчивости сердца к повреждениям, вызванным действием тотальной нормотермической ишемии с последующей реперфузией миокарда, важную роль играет протеинкиназа С и КдтФ-каналы. Замедление формирования необратимых повреждений мембран кардиомиоцитов, наблюдаемое при активации СВ-рецепторов, реализуется без участия аденилатциклазы и гуанилатциклазы. NO-синтаза также не участвует в развитии кардиопротекторного эффекта HU-210. Механизм, с помощью которого активация СВ-рецепторов обеспечивает отрицательный инотропный и хронотропный эффекты, остается пока неизвестным.