Биопленки. 
Методы изучения

Курсовая работа

Биопленки. Методы изучения

Введение

Глава 1 Общее представление о биоплёнках

1.1 Механизмы и этапы формирования биоплёнок

1.2 Ультроструктура биоплёнок

1.3 Микробный состав и взаимодействие микроорганизмов в биоплёнке

1.4 Чувство кворума

1.5 Клиническое значение биоплёнок

Глава 2 Методы изучения биоплёнок

2.1 Методы культивирования биоплёнок

2.2 Генетические методы изучения биоплёнок

2.3 Методы выявления биоплёнок

Заключение

Список литературы

Приложения

Введение

Вплоть до конца прошлого века микробиология развивалась главным образом на основе исследований чистых культур микроорганизмов. Этот традиционный путь, сложившийся на общепринятых представлениях о том, что в природных условиях бактерии существуют как свободно плавающие

(планктонные) клетки, позволил получить сведения об основных жизненно важных процессах, происходящих в микробных клетках. Другими словами, все знания о морфологии, физиологии, генетике, адаптационных возможностях бактерий были получены при изучении планктонных форм бактерий. В настоящее время известно, что более 99% бактерий существуют в природных экосистемах не в виде свободно плавающих клеток, а в виде прикрепленных к субстрату биопленок (Biofilms).

Образование биопленкок и их функционирование — пример сложного социального поведения бактерий, регулируемого и управляемого не только сигналами из окружающей среды, но и межклеточными связями.

В настоящее время считается общепринятым представление о том, что развитие биопленочных сообществ — одна из основных стратегий выживания микроорганизмов не только в окружающей среде, но и в организме человека и животных. Поэтому одной из главных проблем является лечение инфекций, ассоциированных с биопленками, и она представляет значительные трудности. Связано это с тем, что в составе биопленок бактерии приобретают качественно новые свойства по сравнению с микроорганизмами в планктонной форме. Это касается, в первую очередь, способности биопленочных бактерий защищаться от стрессовых воздействий, включая устойчивость к антибиотикам, дезинфектантам и эффекторам (гуморальным и клеточным) иммунной системы человека.

Прогресс в изучении феномена биопленок связан в основном с совершенствованием техники микроскопирования и, в первую очередь, с применением конфокального сканирующего лазерного микроскопа и атомно-силового микроскопа. Однако стоит отметить тот факт, что механизмы образования биопленок до настоящего времени во многом не ясны.

Дальнейшее изучение механизмов формирования биопленки и ее функций открывает новые возможности для лечения и профилактики целого ряда заболеваний.

Глава 1 Общее представление о биоплёнках

1.1 Механизмы и этапы формирования биоплёнок Биопленка — микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, и демонстрируют изменение фенотипа, выражающееся в изменении параметров роста и экспрессии специфичных генов. Это определение позволяет отличить микробные сообщества биопленок от похожих на них лишь внешне структур, например, колонии бактерий, растущих на поверхности агара, которые не проявляют ни одной из характеристик, свойственных истинной биопленке. 1]

Для того, чтобы доказать присутствие именно биопленки, а не других бактериальных структур, используют разнообразные методические подходы, направленные на обнаружение:

1) элементов биопленочного внеклеточного матрикса;

2) генов, контролирующих биопленкообразование;

3) сложных архитектурных структур, специфичных для биопленки. [8]

Образование биопленок — это сложный комплексный динамический процесс, состоящий из нескольких этапов.

Выделяют пять стадий развития биопленки (Приложение 1):

1. Сначала происходит первичное прикрепление микроорганизмов к поверхности (адгезия, сорбция) из окружающей среды (обычно жидкости). Эта стадия обратима.

2. Окончательное (необратимое) прикрепление, иначе называемое фиксацией. На этой стадии микробы выделяют внеклеточные полимеры, обеспечивающие прочную адгезию.

3. Созревание (в англоязычной литературе — созревание-I). Клетки, прикрепившиеся к поверхности, облегчают прикрепление последующих клеток, внеклеточный матрикс удерживает вместе всю колонию. Накапливаются питательные вещества, клетки начинают делиться.

4. Рост (в англоязычной литературе — созревание-II). Образована зрелая биопленка, и теперь она изменяет свой размер и форму. Внеклеточный матрикс служит защитой клеток от внешних угроз.

5. Дисперсия (выброс бактерий): в результате деления периодически от биопленки отрываются отдельные клетки, способные через некоторое время прикрепиться к поверхности и образовать новую колонию. 5]

Изначальное прикрепление микробной клетки к поверхности субстрата осуществляется за счет действия электростатических, гидрофобных сил, сил Ван дер Ваальса, неспецифической адгезии. По результатам опытов in vitro установлено, что степень адгезии с последующим формированием биопленок наиболее выражена к таким материалам, как латекс, силикон, поливинилхлорид. Адгезия к тефлону, полиуретану, нержавеющей стали и титану проявляется в меньшей степени. Все вышеперечисленные материалы широко применяются в медицинской практике, что является дополнительным риском появления биопленок.

Адгезия к биологическим поверхностям (к клеткам тканей, стенкам сосудов) обусловливается специфическим взаимодействием белков-адгезинов или лектинов фимбрий экзоплазматического компартмента бактериальной клетки с рецепторами или определенными доменами поверхности мембран хозяйских клеток.

Рассмотрим некоторые примеры механизмов прикрепления у грамположительных и грамотрицательных бактерий. Важнейшим элементом в процессе адгезии стафилококков является (Polysaccharide Intercellular

Adhesin) (PIA) — полисахарид, который участвует как в клеточной субстратной адгезии, так и в последующем формировании клеточных кластеров (клеточно-клеточная адгезия). PIA инициирует гемагглютинацию и препятствует фагоцитозу за счет активации бактериальной агрегации. Еще один изученный компонент экзоплазматического компартмента это б-токсин стафилококков, кодируемый геном hla. Этот токсин, помимо основной своей функции — образования поровых каналов в мембранах клеток эукариот (один из факторов вирулентности), — обладает еще и свойствами адгезина. Мутанты с нарушенным биогенезом б-токсина и / или PIA не способны формировать полноценные биопленки. Также на первых стадиях формирования биопленок стафилококков значительную роль играют BAP-белки (biofilm associated protein), тейхоевые кислоты, n-ацетилглюкозамин. За процессы адгезии, синтеза PIA и прочих структурных компонентов матрикса биопленок отвечает ica-оперон, находящийся в сложной системе генетической регуляции, охватывающей также экспрессию факторов вирулентности. icaADBC-локус обнаружен у многих видов стафилококков, а также среди некоторых других грамположительных микроорганизмов. Все вышеуказанные синтезируемые компоненты специфически взаимодействуют с субстратами, они осуществляют якорную функцию и инициируют дальнейшие процессы образования биопленки.

У грамотрицательных микроорганизмов важную роль в адгезии и клеточной агрегации играют жгутики и фимбрии IV типа. Движение, обусловленное жгутиками, способствует распространению и образованию клеточного монослоя на субстрате, а фимбрии IV типа участвуют в клеточной агрегации за счет лектинового взаимодействия. Обнаружено, что в начальные фазы образования биопленок, у P. aeruginosa, активируются crc-гены, ответственные за биосинтез фимбрий. Также экспрессируется ген pilA, кодирующий белок пилин, являющийся структурной единицей фимбрий. В опытах с P. aeruginosa было показано, что мутантные штаммы по генам, участвующим в биогенезе жгутиков и фимбрий IV типа, не способны в полной мере формировать биопленки. [3]

1.2 Ультроструктура биоплёнок С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии показано, что биопленки — не структурно гомогенные монослои микробных клеток на поверхности. Скорее они могут быть описаны как гетерогенные во времени и в пространстве структуры. У большинства биопленок можно наблюдать некоторый уровень структурной разнородности, когда совокупность клеток, вкрапленных в экзополисахаридный матрикс, изменяется по плотности, создавая открытые области, где сформированы водные каналы. (Приложение 2.)

Этот матрикс состоит из смеси полисахаридов выделяемых в окружающую среду (экзополисахариды). 2] В химическом отношении матрикс различается у разных таксонов. В целом же экстрацеллюлярный слой содержит такие полисахариды как декстран, гиалуроновую кислоту, целлюлозу и другие. Эта фракция наиболее выражена и составляет порядка 40−95%. Концентрация других химических компонентов очень сильно варьирует. Доля белков может составлять до 60%, липидов до 40% и нуклеиновых кислот 1−20%. Данные соединения находятся в гидратированном состоянии, так как 80−90% объема биопленки занимает вода. Экстрацеллюлярная ДНК участвует в адгезивных процессах и межклеточных взаимодействиях, но до конца роль нуклеиновых кислот в матриксе не выяснена.

Бактериальные экзополисахариды — главный компонент матрикса биопленки, который некоторые авторы называют также гликокаликсом или слизистым чехлом. У большинства видов зкзополисахаридный матрикс состоит из альгината, являясь преобладающе анионным. Например, у P. aeruginosa в биопленках обильно синтезирует альгинат (кодирующий генный кластер — algACD), штаммы со сверхэкспрессией гена algA обычно образуют слизистые колонии с выраженными свойствами вирулентности. Альгинат химически связывает аминогликозиды за счет инактивации гидрофильных и положительно заряженных групп в молекуле. Матрикс биопленки способен препятствовать скорости диффузии некоторых антибиотиков и других биоцидных препаратов, это зависит от его биохимического состава и метаболической активности популяции. Например, аминогликозиды достаточно длительно диффундируют через матрикс, фторхинолоны, напротив, легко проникают через этот барьер. Матрикс является трехмерной структурой, которая окружает, закрепляет и защищает прикрепленные к различным поверхностям микроколонии бактерий.

Клетки в слизистом матриксе располагаются не хаотически, а определенным образом. Структура многоклеточных кластеров представлена в виде грибоподобных, столбоподобных образований, «цементированных» в экзополисахаридный слой, что позволяет задерживать и поддерживать концентрацию питательных веществ, необходимых для роста популяции, а также служит защитой клеток от дегидратации, гуморальных и клеточных факторов резистентности макроорганизма. [3]

Матрикс разделен каналами, наполненными водой, а также имеет полости и пустоты. Поры и каналы, пронизывающие всю биопленку — очень важная часть ее структуры. Образно их можно сравнить с кровеносной системой ткани биопленки. При использовании гранулометрических методов было доказано движение потока жидкости через эти каналы. Каналы позволяют свободно распространяться по всей толщине биопленки низкомолекулярным веществам, таким, как, например флуоресцеин, из чего следует, что эти вещества примерно одинаково доступны всем клеткам биопленки. Таким образом, каналы — жизненно важный элемент структуры биопленки, непосредственно влияющий на ее функции, однако механизмы их формирования и поддержания еще не вполне ясны. Каналы обеспечивают распространение питательных веществ и обмен продуктами метаболизма с окружающей жидкостью. 2]

Однако, исследование с использованием микроэлектродов показало, что периферические слои более аэрированы по сравнению с центральными частями, где образуется анаэробная микрониша. Используя микроэлектроды, удалось установить, что на глубине около 30 мкм от поверхности биопленки концентрация кислорода резко снижается. В связи с этим немалый интерес представляют изменения метаболического фенотипа в глубинных слоях биопленки. Хорошо изучен процесс переключения метаболизма с аэробного дыхания на нитратное дыхание у изолятов P. aeruginosa, выделенных от больных муковисцидозом. Такое переключение метаболизма обусловлено заменой конечного акцептора кислорода дыхательной цепи на молекулы нитратов и нитритов. В связи с этим в клетке происходит регуляторная перестройка экспрессии генов, и начинается синтез специфических для нитратного дыхания ферментов: Napпериплазматической нитратредуктазы, NarGHI, NarZYV — мемранносвязанных нитратредуктаз и других. Ключевая роль в переключении аэробного метаболизма на анаэробный принадлежит регулятору транскрипции Fnr-белку, реагирующему на изменения концентрации молекулярного кислорода Анаэробные субпопуляции биопленок синегнойной палочки обладают более выраженной устойчивостью к факторам окружающей микросреды, а также приобретают устойчивость к действию антимикробных препаратов.

Колебания кислорода, уровня кислотности, параллельно с колебаниями концентраций питательных веществ, метаболитов клеток, обусловливают, следовательно, образование разнородных областей в биопленках. Адаптируясь к таким гетерогенным микронишам, бактерии в биопленке образуют множество фенотипов с широкими метаболическими и репликативными свойствами. Такое сообщество (популяция) обладает громадными способностями к сопротивлению стрессовым факторам[3]

1.3 Микробный состав и взаимодействие микроорганизмов в биоплёнке Поскольку биопленки, как правило, представляют собой гетерогенные сообщества, состоящие из микроорганизмов разных физиологических групп, необходимо остановиться на основных типах взаимоотношений (прежде всего трофических), возникающих между их компонентами. Взаимодействие между компонентами начинается уже в процессе формирования биопленки. Многократно было показано, что биопленки, состоящие из микроорганизмов разных таксонов, прочнее и толще, чем биопленки, состоящие из микроорганизмов одного вида. Взаимодействие происходит, по-видимому, на стадии формирования внеклеточного матрикса.

В «зрелых» биопленках, в отличие от планктонных культур, конкуренция между видами обнаруживается редко. И даже в том случае, когда один из видов, благодаря более высокой скорости роста занимает господствующее положение, второй сохраняет жизнеспособность и высокую численность. Подобные взаимоотношения обнаружены, например, в бинарных (состоящих из культур двух видов) биопленках между популяциями быстро растущей культуры Klebsiella pneumoniae и культурой P.aeruginosa.

Более редкая разновидность конкуренции — амменсализм может быть обусловлен образованием одним из микроорганизмом агентов, ингибирующих других членов сообщества, а также созданием неблагоприятных физико-химических условий (например, величины рН). Такая ситуация обнаружена в бинарной биопленке, сформированной двумя видами Ruminococcus, один из которых образует бактерицин, активный против другого вида.

Наиболее часто встречающимися взаимоотношениями между микробными компонентами биопленок являются комменсализм и протокооперация.

Комменсализм выражается в одностороннем влиянии одного из компонентов биопленки на жизнедеятельность другого ее компонента. Обычный пример — потребление кислорода аэробным микроорганизмом, способствующее росту микроаэрофильных или анаэробных «сожителей». Этот тип взаимодействия играет важную роль в микробной коррозии с участием сульфатредукторов, локализованных в анаэробных микронишах.

Протокооперация приводит к взаимному положительному влиянию компонентов биопленок друг на друга. Такие взаимоотношения существуют, например, в биопленках, содержащих фототрофные и гетеротрофные микроорганизмы. Характерным примером протокооперации служит также взаимодействие целлюлолитических бродильщиков и метаногенов. Последние, утилизируя молекулярный водород, а также формиат, образованные в процессе брожения, сдвигают термодинамическое равновесие, предотвращая накопление восстановленных коферментов в клетках бродильщиков и стимулируя синтез ими АТФ.

Предыдущий случай является примером, когда протокооперация переходит в синергизм, поскольку оба компонента биопленки получают выгоду от сотрудничества, а образование или потребление какого-либо продукта в биопленке превышает величину, характерную для индивидуальных популяций. Типичным примером служит гидролиз целлюлозы в биопленке, содержащей как целлюлолитические, так и неспособные к расщеплению целлюлозы микроорганизмы. Последние стимулируют гидролиз целлюлозы и рост целлюлолитиков путем потребления низкомолекулярных продуктов гидролиза, которые репрессируют биосинтез целлюлаз. 4]

Заметную роль в межклеточных взаимодействиях в биопленках играет обмен генетической информацией, что в определенной степени обусловлено высокой плотностью микробной популяции. Существует множество доказательств того, что горизонтальный перенос генов в биопленках происходит с большей интенсивностью, чем в планктонных культурах. 3] В биопленках, в частности, реализуется механизм защиты плазмид от элиминирования по типу «токсин-антитоксин». Принцип такой защиты состоит в кодировании плазмидой стабильного белка-токсина и лабильного белка-антитоксина. Если дочерние клетки после деления не содержат плазмид и не способны осуществлять ресинтез антитоксина, то после распада остаточного антитоксина стабильный токсин убивает такие клетки. Эффективность горизонтального переноса генов in situ убедительно доказана применением сканирующей конфокальной лазерной микроскопии (SCLM) с помощью генов-репортеров, кодирующих флуоресцирующие белки: зеленый, красный, голубой, желтый и синий. Более того, удается не только определить пространственную локализацию мигрирующих плазмид в популяции, но и изолировать соответствующую субпопуляцию методами сортирования клеток. 4]

1.4 Чувство кворума Формирование, рост, миграция планктонных форм клеток для колонизации в биопленках регулируются на уровне популяции посредством механизмов межклеточной коммуникации. «Quorum sensing» (QS) — это процесс коллективной координации экспрессии генов в популяции бактерий, опосредующий специфическое поведение клеток. Механизм работы QS основан на сложной иерархической регуляции целевых локусов генома бактериальной клетки. При этом регуляция осуществляется на разных уровнях воздействия: транскрипционном, трансляционном, посттрансляционном. 3]

На конкретный клеточный сигнал клетки в популяции отвечают специфическим ответом. На сегодняшний день установлено, что клеточно-клеточные взаимосвязи влияют на внутрипопуляционную дифференцировку клеток, на экспрессию генов вирулентности, регулируют ростовые процессы, характер и направление подвижности (таксис), а также бактериальный апоптоз и токсинообразование.

Работу QS можно сравнить с гормональной регуляцией функциональной активности различных органов и тканей в многоклеточном организме. [6]

Грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы используют различные сигнальные системы и разные химические передатчики сигналов. Первые синтезируют 7−8-членные пептиды (Enterococcus spp.), циклопептиды (Staphylococcus spp.); вторые: разнообразные ацил-гомосерин лактоны (AHL).

Рассмотрим работу QS на примере синегнойной палочки. У данного микроорганизма функционируют, по меньшей мере, три регуляторные системы. Наиболее изученная из них LasI — LasR система (в качестве химического сигнала выступают AHL с длинной ацильной цепью); RhlI — RhlR система (мессенджер — AHL c короткой ацильной цепью, C4-HSL); и хинолоновая PQS система. Взаимодействие этих трех систем позволяет регулировать экспрессию порядка 6−10% генома. В LasI — LasR системе за биосинтез сигнальных молекул отвечает AHL-синтаза, продукт гена lasI. Его экспрессия находится на базальном уровне, поэтому накопление сигнальных молекул происходит достаточно длительно, и биологический эффект начинает проявляться только в стационарной фазе роста популяции. В клетках AHL взаимодействует с LasR-белком (продукт lasR-гена, экспрессия которого также находится на базальном уровне), образуя при этом гомодимер — регулятор транскрипции. Этот регулятор активирует множество генов, участвующих в формировании вирулентности, и в процессах образования биопленок, он также активирует хромосомный регулон las Box, который отвечает за экспрессию различных факторов патогенности (протеазы, эластаза, и прочее). Комплекс LasR + AHL активирует вторую сигнальную систему. Это происходит после взаимодействия с промотором Rhl-генов. Экспрессия RhlI обусловливает образование протеина для синтеза AHL с короткими ацильными остатками (C4-HSL). Ген rhlR кодирует белок (RhlR), который взаимодействует с сигнальными молекулами C4-HSL. Образующийся протеиновый тандем RhlR + C4-HSL регулирует транскрипцию генов, кодирующих различные структурные соединения матрикса биопленок (альгината, рамнолипида и др.), а также липазы, пиоцианина. Также этот транскрипционный регулятор активирует экспрессию другого регулятора — RpoS (сигма-фактор стационарной фазы роста P. aeruginosa), который инициирует образование стрессовых белков клетки и участвует в адаптационных реакциях. Среди клинических изолятов P. aeruginosa обнаружено, что помимо функционирования AHL-сигнальных систем, параллельно вступает хинолоновая система (генный локус — pqsABCDE), мессенджерами являются гидроксиалкилхинолоны и гидроксигептилхинолоны. Эта система функционирует так же, как и вышеописанные механизмы регуляции, и опосредует увеличение экспрессии факторов вирулентности, в частности, синтез эластазы, лектинов. Взаимодействие трех сигнальных систем затрагивает большое количество генов, в связи с чем происходит глобальная регуляция транскрипции, что приводит к очень гибкой лабильности физиологических процессов клетки, и является следствием огромного адаптационного потенциала бактерий в популяции.

QS регулирует важный процесс переключения фенотипа бактериальной клетки с планктонной формы на сессильную. Это необходимый этап в образовании биопленки для биологически выгодного паразитирования макроорганизма. В самом начале инфекционного процесса первостепенной целью патогена является проникновение и адгезия в тканях макроорганизма, при этом, как отмечалось выше, ресурсы клетки направлены на биосинтез жгутиков и специфических белков — адгезинов. Однако компоненты фимбирий и жгутиков, белки адгезинов являются сильными иммуногенами, они стимулируют также образование интерлейкинов. Соответственно для дальнейшего выживания популяции внутри инфекционного очага образование жгутиков и систем адгезии будут биологически не выгодными. Поэтому на этапе созревания биопленки QS ингибирует образование жгутиков и адгезинов. Аналогичным образом происходит обратный процесс — образование подвижных форм клеток в биопленке или высвобождение целого кластера клеток (detachment cell) для колонизации окружающего субстрата. Подобный процесс переключения фенотипа, регулируемый QS, остается до конца не изученным.

Сигнальные системы работают по принципу аутоиндукции, синтезированные сигнальные молекулы действуют на свою же клетку, и по мере их накопления во внеклеточной среде происходит все большая активация зависимых промоторов, регулонов генома клеток. QS на основе AHL обнаружен у многих грамотрицательных бактерий: Acinetobacter, Aeromonas, Brucella, Burkholderia, Erwinia, Enterobacter, Chromobacterium, Hafnia, Serratia, Vibrio, Yersinia и др. AHL-коммуникация осуществляется внутри вида, специфичность и сила биологического ответа зависит от химической структуры самой сигнальной молекулы.

Но среди клинических изолятов грамотрицательных бактерий часто наблюдается и перекрестная коммуникация (cross — talk communication), обеспечивающая взаимодействие популяций разных видов в инфекционном очаге. Перекрестный QS способен как активировать, так и ингибировать работу зависимых целевых генов в бактериальных ассоциациях. Например, P. aeruginosa, Serratia liquefaciens, Aeromonas hydrophila синтезируют один тип сигнальных молекул. QS C. violaceum и A. hydrophila ингибируется AHL-молекулами с длинными ацильными остатками, которые синтезируются различными грамотрицательными микроорганизмами. Синегнойная палочка образует сигнальные молекулы с длинными и короткими ацильными остатками, и они взаимно не ингибируются, однако, мессенджеры E. coli такой же молекулярной структуры с длинными ацильными остатками способны ингибировать rhl-сигнальную систему P.aeruginosa. В смешанных биопленках P. aeruginosa и Burkholderia cepacia, буркхолдерии реагируют на сигналы синегнойной палочки (которая в свою очередь не чувствительна к сигналам B. cepacia), следовательно, популяция P. aeruginosa регулирует многие физиологические процессы своего ассоцианта. Имеются данные, что некоторые штаммы P. aeruginosa, выделенные от больных исцидозом, не способны сами синтезировать аутоиндукторы rhl-сигнальной системы, следствием чего является снижение вирулентности, и неполноценное формирование биопленок в опытах in vitro. Но, однако, in vivo, эти же штаммы синегнойной палочки формируют полноценные биопленки. Выяснено, что микрофлора, выделенная из слизи от тех же больных, синтезирует rhl-аутоиндукторы, регулируя таким образом вирулентность и формирование биопленок P. aeruginosa и инициируя инфекционный процесс. Сами AHL-молекулы неодинаково влияют на другие группы бактерий, установлено например, что аутоиндукторы синегнойной палочки блокируют работу QS у S.aureus. Сигнальные молекулы прокариот способны влиять и на поведение клеток грибов, растений, и даже животных клеток. Так, AHL P. aeruginosa подавляет процесс филаментации Candida albicans.

В организме человека AHL-молекулы ингибируют пролиферацию лейкоцитов и процесс образования фактора некроза опухолей б. В высоких концентрациях AHL инициируют апоптоз разных типов иммунокомпетентных клеток. В целом, бактериальные аутоиндукторы оказывают иммуносупрессирующее действие. Именно за счет реакций QS осуществляются «социальные» отношения внутри популяции, образуется «химическая коммуникационная сеть» биопленки, которая может охватывать мультиводовое сообщество.

Не менее интересна работа сигнальных систем среди грамположительных микроорганизмов. Например, у Enterococcus spp. QS регулирует процесс переноса плазмид (от донорной к реципиентной клетке) через механизм конъюгации. Клетка-реципиент синтезирует специфический пептидный сигнал («половой» бактериальный феромон) который накапливается в среде и специфически связывается с рецепторами клеток-доноров, несущими плазмиду, которая соответствует этому феромону. Запускаемая при этом регуляторная система обеспечивает экспрессию факторов, опосредующих клеточное взаимодействие и перенос плазмиды (компоненты конъюгации). Как отмечалось выше, определенной плазмиде соответствует конкретный феромон. За счет такого строгого механизма взаимодействия осуществляется бактериальная селекция клеток внутри биопленки. Посредством такой коммуникации траслоцируются плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам, гены гемолизинов, бактериоцинов. Обычно биологически активные сигнальные пептиды закодированы в хромосоме, а рецепторные белки, обеспечивающие аффинитет к феромонам закодированы в самих плазмидах. После транслокации плазмиды в клетку реципиента, она начинает синтез ингибиторов феромонов, для каждого типа феромона соответствует свой ингибитор. Это свойство позволяет выключать сигнал для уже имеющейся плазмиды, и усиливать накопление молекул феромонов для другого типа плазмид. биоплёнка микроорганизм клетка За счет работы подобной системы в популяции биопленки постоянно происходит положительная селекция штаммов с выгодными свойствами и отрицательная селекция — элиминация штаммов, с «ненужными» фенотипами. При инфекционных поражениях такие коммуникативные механизмы передачи мобильных генетических элементов позволяют с максимальной скоростью распространять гены антибиотикорезистентности, вирулентности, дополнительные физиологические возможности.

Наибольший интерес представляет QS, участвующий в регуляции экспрессии факторов вирулентности у стафилококков. Генетической основой работы этой системы является agrABCD — хромосомный локус. В качестве передатчиков сигналов выступают циклопептиды — аутоиндукторы (AIP, auto-inducing peptide), которые классифицированы по строению и биологическому эффекту на группы и субгруппы, например, 1 и 4 субгруппы у S. aureus увеличивают экспрессию факторов вирулентности. Эти молекулы крайне специфичны, замена хоты бы одной аминокислоты в структуре соединения, ведет к потере биологической функции. Как и с примерами сигнальной — ингибиторной системы у энтерококков, стафилококковая система реагирует только на один тип аутоиндукторов, как только клетка получила специфический сигнал, активируются гены-ингибиторы, и клетка уже не способна воспринимать другие сигналы. Такой механизм обеспечивает жесткую популяционную селекцию. Синтезированные сигнальные молекулы взаимодействуют с гистидинкиназной мембранной системой (agrC), которая через каскад реакций активирует регулятор транскрипции (agrA). Этот белок осуществляет бифункциональную регуляцию двух промоторов P2 и P3. Соответственно, транскриптами этих зависимых генов является РНК II и РНК III, первая содержит основные agr-гены, таким образом проявляется аутоиндуктивный ответ системы. В свою очередь РНК III обеспечивает регуляцию синтеза факторов вирулентности (ДНКазы, фибринолизина, энтеротоксина, б-, в-, д-токсинов и др.). Интересной особенностью на данном этапе регуляции является то, что транскрипт РНК III размером в 500 пар нуклеотидов не несет кодируемой информации, за исключением одной открытой рамки считывания для д-токсина. Подавляющая часть молекулы транскрипта сама выступает как рибосомальный ингибитор. РНК III блокирует процесс трансляции фактора репрессии вирулентности Rot (repressor of toxins), регулирующий синтез стафилококковых токсинов, следствием чего является неконтролируемое образование экзотоксинов. Таким образом, agr-система обеспечивает популяционную регуляцию экспрессии факторов вирулентности стафилококков. Используя различные варианты ПЦР-исследований, установлено, что экспрессия agr-локуса в клетках наблюдается при многих стафилококковых поражениях: инфекции кожи, эндокардиты, артриты, сепсис. В популяции биопленок накапливаются сигнальные молекулы, синтезируемые подавляющим большинством клеток, являющихся метаболическим и генетическим «ядром, кворумом» популяции, они задают метаболическое поведение, фенотипические изменения для всех клеток. Это осуществляется за счет аккумуляции сигналов через свойство аутоиндукции, и ингибирование других сигналов, синтезируемыми меньшинством, либо вообще иными штаммами в биопленке за счет параллельного механизма ингибирования. 3] 1.5.Клиническое значение биоплёнок.

Представления о биопленках, подтвержденные с помощью современных методов визуализации, изменили взгляды на инфекционные заболевания. Все новые данные свидетельствуют о том, что хронические инфекции принципиально отличаются от острых образованием биопленок, а фагоциты макроорганизма неспособны поглощать биопленки в отличие от отдельных бактериальных клеток.

Существование биопленок при хронических инфекциях требует совершенно новых подходов к их диагностике и лечению. Кроме того, традиционные бактериологические методы не выявляют большинство бактерий, участвующих в инфекционном процессе. Новейшие молекулярные, геномные, транскрипционные и протеомные методы позволили определить, что при выделении чистой культуры определяется лишь около 1% клеток патогенного микробиоценоза. В результате лечение нацелено лишь на 1−2 вида бактерий из множества штаммов, присутствующих в составе биопленки (в том числе, возможно, и грибов). 5]

К настоящему времени достоверно доказана роль микробных биопленок в возникновении и развитии таких распространенных заболеваний, как инфекции, связанные с катетеризацией сосудов, вызванные Staphylococcus aureus и другими грамположительными микроорганизмами; инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, вызываемые стафилококками; пародонтит, обусловленный рядом микроорганизмов полости рта; инфекции мочевых путей, определяемые Е. coli и др. патогенами; инфекции среднего уха — причина, например, Haemophilus influenzae, муковисцидоз, вызываемый P. Aeruginosa и др.

Все эти заболевания трудны для лечения, имеют высокую частоту рецидивов и некоторые из них могут явиться причиной летальных исходов. Далеко не до конца ясны механизмы, по которым микроорганизмы, образующие биопленки, вызывают патологические процессы в макроорганизме. 7]

Кроме тканей организма хозяина, микробные биопленки колонизируют различные медицинские устройства небиологической природы, внедряемые в организм человека (катетеры, водители ритма, сердечные клапаны, ортопедические устройства). Исследования имплантированных медицинских устройств с применением электронной микроскопии показали присутствие бактериальных биопленок.

Возрастающая антибиотикорезистентность и развитие бактериальных биопленок являются основными проблемами в лечении инфекций мочевых путей.

Установлено, что в основе повышенной устойчивости лежат свойства клеток и внеклеточного матрикса. Матрикс биопленки может связывать или не пропускать, и/или инактивировать антибиотики. Устойчивость, обусловленную свойствами клеток биопленки, объясняют уменьшением их свободной поверхности за счет контактов друг с другом и формированием особых бактерий, получивших название персистеров. 5]

Персистеры это альтруистические клетки, которые образуются в стационарной фазе роста, они метаболически не активны и обеспечивают выживание материнской популяции в присутствии летальных, для всех клеток, факторов. В биопленках эта субпопуляция составляет 1−5% от всей клеточной массы. Формирование таких клеток зависит от степени роста популяции, в лог-фазе культура не образует или образует очень небольшую долю персистеров, их количество увеличивается к стационарной фазе. Образование субпопуляции обратно зависимо от уровня метаболической активности всех клеток биопленки, а также от действия экзогенных неблагоприятных факторов. Фенотип персистеров характеризуется интересной биологией, они замедляют все физиологические процессы и становятся толерантными к действию разных факторов, в том числе и к воздействию антимикробных препаратов.

Свойство антибиотикотолерантности отличается от механизмов резистентности. Действиевсех механизмов устойчивости бактерий, по существу, можно свести к одному явлению — это предотвращение взаимодействия антибиотика с его мишенью (за счет изменений самих мишеней, или с помощью синтеза ферментов, нейтрализующих антибиотики). Толерантность же опосредуется способностью микробной клетки выживать в присутствии антибиотика за счет замедления метаболизма и «выключения» основных биологических процессов клетки. 3]

Основными же механизмами повышения устойчивости бактерий к антибиотикам в биопленках являются:

1. ограничение проникновения антибиотиков через биопленки;

2. ограничение питания и измененная микросреда в биопленке приводят к уменьшению скорости деления бактерий, вследствие чего остается меньше мишеней для действия антибиотиков;

3. адаптивные реакции;

4. генная изменчивость у персистирующих в биопленке бактерий.

Исходя из накопившихся данных, следует, что антибиотики по действию набактерии биопленок разделяются на два типа. К первому относят антибиотики, проникающие в биопленки и угнетающие или убивающие образующие их микроорганизмы. Второй тип — антибиотики, практически не проникающие в биопленки, но эффективно препятствующие их расселению за счет мигрирующих бактерий. Таким образом, некоторые антибиотики не проникают в биопленки и не уничтожают существующие сообщества, а только препятствуют увеличению их числа и распространению в организме человека. В связи с этим в последние годы началось изучение способности антибиотиков проникать в биопленки различных микробов.

Установлено, что в биопленки Klebsiella pneumoniae плохо проникает ампициллин, а в сообщества Enterococcus faecalis — ампициллин, ко-тримаксозол и ванкомицин. В биопленки ряда микробов плохо проникает широко используемый амоксициллин .

К числу антибиотиков, хорошо проникающих через липиды клеток, относятся фторхинолоны. Эта группа антимикробных препаратов способна действовать на основные возбудители урологических заболеваний, в достаточной концентрации проникает в очаг инфекции. Имеющийся опыт использования антибиотиков свидетельствует, что с инфекционным процессом, прежде всего с его клиническими проявлениями, можно справиться с помощью антибиотиков, как проникающих, так и не проникающих в биопленки. Однако разница между ними существует, и она достаточно существенна. Показано, что различия антибиотиков, проникающих и непроникающих в биопленки, могут проявляться в отдаленных результатах лечения. Использование антибиотиков, плохо проникающих в биопленку, очень быстро приводит к формированию и отбору устойчивых штаммов. Кроме того, при этом чаще возникают рецидивы и формируются очаги хронических процессов.

Терапевтическое воздействие на биопленки может быть направлено на механизмы первоначальной адгезии бактерий к поверхности, блокирование синтеза или разрушение полимерного матрикса, нарушение межклеточного обмена информацией, а также оно может сочетаться с собственно бактерицидными агентами. Подобное лечение, действующее на структуру или функции биопленок, может оказаться более эффективным, чем стандартная антибактериальная терапия. 5]

Глава 2 Методы изучения биоплёнок

2.1 Методы культивирования биоплёнок В последнее десятилетие произошло значительное расширение возможности изучения формирования микробных биопленок. Основное направление этих исследований связано с разработкой методов культивирования микроорганизмов в динамических (имитация естественных условий образования биопленок) и статических условия. 13]

К динамическим можно отнести методы с использованием лабораторных ферментеров. Общая суть методов заключается в инокулировании микроорганизмов в планктонной фазе развития в жидкие питательные среды, которые циркулируют в закрытой системе. Таким образом, создаются условия для постоянного потока жидкости, содержащей микроорганизмы. Первоначальная адгезия микроорганизмов происходит на поверхности системы фильтров и/или на внутренних частях ферментера. В последующем адгезированные микроорганизмы образуют матрикс биопленки.

Другим примером динамического метода можно считать культивирование в аппарате Робинсона и в его различных модификациях. В этом методе используют аппарат сложной конструкции, обеспечивающий ток питательной среды, которая соприкасается с пластинами из искусственного или биологического материала, на поверхности которого находятся адгезированные, физиологически адаптированные клетки микроорганизмов. В результате в условиях постоянного доступа питательных веществ и аэрации образуется биопленка.

Проточный метод можно отнести к микроциркуляторным методам. Биопленка микроорганизмов образуется на поверхности силиконовых трубок проточных ячеек (flow cells), через которые с помощью помпы постоянно подается питательная среда. Такой метод позволяет моделировать процессы образования биопленки на абиотических объектах, например на внутрисосудистых катетерах. Основным преимуществом динамических методов формирования биопленок является максимальное приближение к условиям живых систем. Постоянное поступление питательных веществ и удаление продуктов жизнедеятельности микроорганизмов позволяет значительно интенсифицировать процесс формирования биопленки. Условия, обеспечивающие жизнедеятельность микроорганизмов в биопленке, полученной такими методами, стандартизированы, а влияние посторонних факторов минимизировано.

В модификациях метода Робинсона и в проточном методе возможно изучение процесса образования или подавления биопленок в реальном времени с использованием световой микроскопии. К недостаткам данной группы методов можно отнести их ограниченное использование в связи с большими объемами потребления питательных сред, сложной конструкцией оборудования, затруднением стерилизации внутренних поверхностей аппаратов, низкой производительностью методов, высокой стоимостью эксплуатации.

Вторая группа методов основана на создании статических условий культивирования микроорганизмов. [9]

Наиболее часто используемой техникой, среди данной группы, является метод с применением 96-луночных пластиковых планшетов в различных модификациях. Метод основан на способности бактерий формировать биоплёнки на поливинилхлоридном пластике (ПВХ) Суть метода можно охарактеризовать следующим образом: суспензия бактерий вносится в лунки планшета, после инкубации в оптимальных условиях планктонная фаза популяции бактерий удаляется вместе с питательной средой, образовавшиеся биопленки окрашивают кристалл виолетом и проводят количественный учёт связанного красителя в спектрофотометре, что позволяет проводить количественные сравнения способности образования биоплёнки разными штаммами. Этот метод до сих пор не потерял своей значимости, однако научный интерес отечественных исследователей к нему в последнее время значительно снизился, а практическое значение так и не получило должной оценки в нашей стране. В первую очередь, это связано с тем, что для этого метода не разработаны стандарты, позволяющие унифицировать его в разных лабораториях.

Уже в ранних работах была отмечена разная адгезивная способность одних и тех же штаммов микроорганизмов к различным поверхностям. Данный факт связан с тем, что все микроорганизмы обладают способностью прикрепляться к органическим и неорганическим поверхностям, а адгезия является пусковым механизмом в развитии инфекционного процесса. Адгезию разделяют на неспецифическую и специфическую. Первая обусловлено физикохимическими процессами взаимодействия бактерий с поверхностью: электростатические и гидрофобные взаимодействия, броуновское движение. Неспецифическое прикрепление осуществляется к биотическим и абиотическим объектам и в большей степени обратимо. Специфическое прикрепление происходит после молекулярных взаимодействий между молекулами-адгезинами и рецепторами клеток хозяина. Немаловажную роль в адгезии микроорганизмов к различным поверхностям играют также электрические заряды. Бактериальная поверхность заряжена отрицательно, причем у грамположительных микроорганизмов это обусловлено наличием в клеточной стенке тейхоевых и липотейхоевых кислот, а у грамотрицательных — присутствием кислых липополисахаридов и белков.

Таким образом, использование планшетов даже одного производителя может приводить к получению значительно различающихся результатов, что обусловлено их физико-химическими особенностями. Так, например, некоторые производители выпускают планшеты со специфическим связыванием углеводов, аминов, ДНК, сульфгидрильных групп; со специальной обработкой поверхности для клеточной адгезии, в том числе и покрытые полилизином для белковой кристаллизации. Необходимо учитывать тот факт, что к поверхности лунок планшетов микроорганизмы прикрепляются за счет неспецифических факторов.

Помимо особенностей поверхности планшета, на формирование биопленок в данной группе методов влияют состав питательных сред (микронутриентный и электролитный) и степень аэрации.

Одной из модификаций планшетного метода исследования формирования биопленок является ALI-метод (air-liquid interface). Его суть заключается в культивировании микроорганизмов в планшете, который находится под углом 30°-50° таким образом, чтобы мениск жидкой питательной среды соприкасался с серединой дна лунки. Середина лунки является наиболее оптически чистой зоной планшета. В месте соприкосновения жидкой питательной среды с этой зоной формируются максимально благоприятные условия для формирования биопленки.

Этот метод позволяет визуализировать биопленки без необходимости использования красителей с помощью фазово-контрастной микроскопии, а мониторинг можно проводить в режиме реального времени. Его недостатком является возможное уменьшение объема питательной среды в лунке и, как следствие, высыхание места контакта адгезированных микроорганизмов со средой. По этой причине, возникает необходимость постоянного внесения питательной среды в лунки, либо уменьшения времени инкубации.

В связи с возрастающим интересом стоматологов к проблеме биопленок был разработан метод их формирования на гидроксиапатитовых дисках. Материал дисков был выбран из-за высокой пористости и схожести его строения с тканями зуба. В дальнейшем метод был стандартизирован и в нем стали использовать поликарбонатные диски.

Суть метода заключается в следующем: на поверхность плотной питательной среды помещают диск, на который наносят суспензию исследуемой культуры. Питательные вещества поступают к клеткам путем диффузии через поры поликарбонатного диска.

Таким образом, это единственный из разработанных статических методов, при котором к биопленке питательные вещества поступают из плотной среды. Этот метод рекомендуется авторами исследований как основной для выявления влияния антимикробных веществ на формирование биопленок.

Отдельно следует указать на метод, разработанный D.E. Kadouri с соавт., который занимает промежуточное положение между статическими и динамическими методами. В методе используются 6-луночные планшеты, к каждой лунке которых подведена система подачи и отвода питательной среды. После определенного времени инкубации, достаточного для адгезии бактерий на поверхности лунки, подключается система микроциркуляции, которая обеспечивает оптимальное поступление питательных веществ к формирующейся биопленке. 9]

2.2 Генетические методы изучения биоплёнок Для выявления генов, участвующих в генетическом контроле любого процесса, используются методы направленного и ненаправленного (инсерционного) мутагенезов. Для выяснения механизмов инициации образования биопленок R. Kolter с соавт. описали мутанты, дефектные в отношении образования биопленок, полученные с помощью транспозонного мутагенеза, у P. aeruginosa и Е. coli. При использовании данного метода вначале получают большое количество инсерционных мутантных клонов и подвергают их тотальной проверке на способность к образованию биопленок в сравнении со штаммом, используемым в качестве исходного для мутагенеза.

В работе J.J. Dennis и G.J. Zylstra в качестве мигрирующего генетического элемента был использован пласпозон — плазмида, в состав которой входит транспозон с антибиотико-устойчивой кассетой. Пласпозон способен полностью встраиваться в любое место хромосомы, нарушая последовательность гена и приводя к инсерционной мутации в этом гене.

Инсерция пласпозона в геном исходного штамма может привести к нарушению работы как генов, кодирующих транскрипционные регуляторы, так и любых других генов, и как следствие — к усилению или уменьшению способности бактерий к образованию биопленок. С помощью этого метода была показана роль генов cepl-cepR в QS-регуляции у В. cepacia .

Другой подход для изучения генов, контролирующих развитие биопленок у P. aeruginosa, был использован, А. Finelli с соавт, которые использовали систему исследования генов, экспрессируемых в зрелой биопленке. В основе метода лежит использование мутанта-ауксотрофа со строгой питательной потребностью, позволяющего отбирать активные промоторы в биопленках, способные восстановить прототрофность у мутанта.

Для определения факторов, влияющих на трехмерную структуру и, следовательно, на устойчивость биопленки к механическому повреждению, индивидуальные клетки должны быть помечены таким образом, чтобы их можно было визуализировать с применением эпифлюоресценции или КСЛМ. Метод мечения включает помещение последовательности ДНК, которая кодирует флуоресцентную метку, например такую, как зеленый флуоресцентный белок (green fluorescence protein — GFP), в хромосому бактерии с помощью плазмидного вектора. Для флуоресценции GFP не требуется каких-либо кофакторов или субстратов и, следовательно, возможно непосредственное in vivo наблюдение экспрессии GFP в индивидуальных клетках, клеточных популяциях или даже в целых организмах в режиме реального времени. GFP и его аналоги представляют собой исключительно удобные белки-репортеры для анализа экспрессии генов.

Известно, что инсерция в хромосому обеспечивает стабильность в поддержании гена gfp, однако, при этом существует риск нарушения нормальной генной экспрессии в области инсерции, так как ген gfp может встроиться в любое место в хромосоме. В этом случае gfp может быть использован как репортерный ген.

Столь же эффективным, но менее разрушительным, является метод использования плазмидного экспрессионного вектора, безопасно обеспечивающего клетку геном флуоресцентного белка, который используется в генно-инженерных конструкциях, применяемых для исследования экспрессии генов в живых тканях и микроорганизмах in vivo (например, при идентификации бактериальных генов с помощью метода замены генов — gene replacement).

В литературе описано множество подобных GFP экспрессионных векторов, однако только несколько из них применимы для использования в изолятах комплекса В. cepacia. M.D. Levebre и М.А. Valvano описали новые GFP-векторы для исследования регуляции генной экспрессии у В. cenocepacia, но они не были протестированы для использования в биопленках, в которых питательные вещества, pH и кислородный градиент могли отрицательно влиять на экспрессию или фолдинг GFP. С недавних пор для исследований структуры биопленок используют GFP-экспрессионный вектор, содержащий гентамиции-устойчивую кассету для мечения штамма В. cenocepacia HI 11 (5. cepacia геномовар III).

Изменения в метаболизме бактерий при их переходе к прикрепленному образу жизни изучались путем сравнительного анализа состава мРНК и белков в клетках планктонных и биопленочных бактерий. Эти исследования наряду с микроскопическими наблюдениями позволили описать различные стадии развития биопленок, в том числе их прикрепление к субстрату, образование микроколоний и каналов, созревание биопленок, а затем и дисперсию клеток.

Для выявления степени различий в экспрессии генов и, соответственно, в белковых составах клеток на разных стадиях развития биопленки применяют протеомный анализ. При этом выращенные бактерии после центрифугирования и промывания для удаления среды выращивания подвергают одномерному электрофорезу. Преимущество одномерного фореза состоит в том, что белковый портрет культуры получается более полным, чем при двухмерном, при котором обработка культуры приводит к потере некоторых мембранных фракций. Далее получают протеомные карты посредством двухмерного гельэлектрофореза и MALDI-TOF-масс-спектрометрии, основанной на лазерной десорбции и ионизации макромолекул, опосредованной матриксом и детекторами ионов, которые позволяют определять время их полета.