2.2.
Актуальность темы
.
Одно из центральных мест в инфекционной патологии крупного рогатого скота занимает некробактериоз. Некробактериоз — инфекционная болезнь, проявляющаяся гнойно-некротическими поражениями всех органов и тканей организма. Это заболевание наносило и продолжает наносить значительный экономический ущерб.
Кроме того, в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической ситуации по некробактериозу, что связано с усложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения животноводства.
Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных, потерей продуктивности и других расходов, обусловленных мероприятиями по ликвидации болезни. Некробактериоз поражает все виды домашних и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека. Наиболее чувствительны к данной инфекции олени и овцы, а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Географически некробактериоз распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством. В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно до 7% крупного рогатого скота и 16% мелкого рогатого скота, занимая, таким образом третье по распространенности место после лейкоза и туберкулеза. Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50−70 тыс. оленей погибает 30−35% животных. Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот.
В настоящее время для выявления и идентификации возбудителя некробактериоза применяют серологические, биохимические, микробиологические методы, а также постановку биопробы на лабораторных животных.
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) с успехом используют для обнаружения микробных антигенов в различных патологических материалах. Предложены и применяются несколько вариантов РИФ.
Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность, применяемых в настоящее время методов, заставляет исследователей обратить особое внимание на разработку и внедрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов диагностики некробактериоза. В этой связи актуальным является внедрение методов диагностики на основе иммуноферментного анализа (ИФА). Основными достоинствами ИФА являются высокая чувствительность, возможность анализа соединений с различной молекулярной массой, строго инструментальный учет результатов, что позволяет увеличить число проб, унифицировать методы и реагенты, а также вести прямую обработку информации.
Таким образом, создание тест-систем для ускоренной диагностики некробактериоза на сегодняшний день является важной и актуальной задачей.
1.2. Целью настоящей работы являлась разработка диагностикумов на основе очищенного антигена F. necrophorum, определение белкового состава и изучение иммуногенных свойств его отдельных компонентов для использования их при создании иммуноферментной и люминесцентной тест-систем для диагностики некробактериоза при определении уровня антител в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F. necrophorum в гнойно-некротических очагах.
Решались следующие задачи*.
1.2.1. разработать метод получения очищенного антигена F. necrophorum и изучить белковый состав антигена F. necrophorum',.
1.2.2. изучить клеточный и гуморальный иммунитет КРС при некробактериозе;
1.2.3. выделить IgG КРС, получить анти-IgG КРС сыворотки на кроликах;
1.2.4. выделить awm-F.necrophorum антитела из сывороток клинически больных животных;
1.2.5. изготовить коньюгат пероксидазы из хрена с анти-IgG КРС и кролика, коньюгаты анти F. necrophorum IgG с ФИТЦ и ПХ;
1.2.6. провести сравнительную оценку эффективности определения уровня аши-F.necrophorum антител и антигена F. necrophorum в патологическом материале традиционными методами и ИФА;
1.2.7. разработать тест-систему для диагностики некробактериоза при определении уровня антинекробактериозных антител в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F. necrophorum в гнойно-некротических очагах методом иммуноферментного анализа.
1.3. Научная новизна.
— разработан метод получения очищенного антигена F. necrophorum',.
— определен белковый состав F. necrophorum и изучены иммуногенные свойства его отдельных компонентов;
— установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК;
— показана возможность выделения антинекробактериозных антител из сыворотки переболевших животных с помощью аффинной хроматографии на нерастворимой фракции бактериальных клеток;
— впервые в Российской Федерации разработана иммуноферментная тест-система для диагностики некробактериоза КРС на основе очищенного антигена F.necrophorum.
1.4. Практическая значимость работы.
Разработана иммуноферментная, люминесцентная и гистохимическая тест-системы, предназначенные для диагностики некробактериоза КРС.
Созданы «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С», «Набор для иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» и «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л». Материалы работы использованы при составлении научно-технической документации (НД) которая утверждается в установленном порядке. Наборы предназначается для индикации антигенов F. necrophorum и количественного определения антиF. necrophorum антител в сыворотках крови КРС.
Внедрение в практику указанных наборов позволит проводить диагностику некробактериоза КРС в племенных и пользовательских хозяйствах при первых проявлениях клинических признаков, что будет способствовать оздоровлению хозяйств, обеспечению эпизоотологического благополучия, повышению сохранности и продуктивности поголовья, улучшению качества продукции.
1.5. На защиту выносятся следующие положения:
1.5.1. результаты разработки оптимальных условий очистки антигена F. necrophorum;
1.5.2. результаты исследования белкового состава антигена F. necrophorum',.
1.5.3. результаты испытания антигенов F. necrophorum, полученных на базе очищенных препаратов, в качестве компонентов в серологических реакциях (РТГА и ИФА);
1.5.4. результаты исследования напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе КРС;
1.5.5. результаты разработки тест — системы ИФА для определения уровня антиF. necrophorum антител в сыворотках вакцинированных, больных и переболевших животных и проведения сравнительной оценки определения уровня антител в РТГА и ИФА;
1.5.6. результаты разработки тест — системы ИФА для детекции антигенов F. necrophorum в различных патологически материалах и сравнения чувствительности и специфичности с традиционными методами;
1.5.7. результаты разработки люминесцентной тест — системы для детекции антигенов F. necrophorum в различных патологически материалах и сравнения чувствительности и специфичности с традиционными методами;
1.5.8. результаты испытания и промышленного изготовления наборов для иммуноферментной и люминесцентной диагностики некробактериоза КРС.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1. Некробактериоз.
Некробактериоз — инфекционная болезнь, проявляющаяся гнойно-некротическими поражениями всех органов и тканей организма. Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных на мясо, потерей продуктивности и других расходов, обусловленных мероприятиями по ликвидации болезни.
Некробактериоз поражает все виды домашних (72) и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека (114, 86, 148, 126). Наиболее чувствительны к данной инфекции олени и овцы, а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Географически некробактериоз распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством. В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно до 7% крупного рогатого скота и 16% мелкого рогатого скота, занимая, таким образом, третье по распространённости место после лейкоза и туберкулёза (57, 35, 53). Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50 — 70 тыс. оленей погибает 30 — 35% животных (21). Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот. Даже, несмотря на то, что поголовье скота за последние годы резко сократилось, заболеваемость не только не имеет тенденции к снижению, но и даже несколько возросла (57).
Основным источником каждой вновь начинающейся эпизоотии среди крупного рогатого скота в первую очередь следует считать здоровых животных микробоносителей, а не больных, которые присоединяются позднее, так как бактерия представляет собой нормального обитателя пищеварительного тракта. Заселение желудочно — кишечного тракта.
F.necrophorum происходит в первые дни жизни. Поэтому по месту обитания возбудителя некробактериоз следует отнести к факторным инфекциям (50).
В основном некробактериоз не заносится в хозяйство с больными животными, а возникает при появлении соответствующих условий, ведущих к нарушению существующего биологического равновесия между микрои макроорганизмом. Нарушение рубцового пищеварения, вследствие дефицита микроэлементов и витаминов, влекущее за собой нарушение обменных процессов и снижение естественной резистентности организма, сырость в помещениях и недостаточно качественная очистка стойл, создающая агрессивную среду и ведущая к размягчению копытного рога и мацерации кожи, травмирование тканей разного рода колющими и режущими предметами — все это является предпосылкой для вспышки заболевания (50, 12). Следствием многообразия клинических форм болезни и полиморфностью возбудителя стало сравнительно недавнее присвоение некробактериозу статуса самостоятельной нозологической единицы. В 1932 году А. Г. Ревнивых своими опытами на северных оленях доказал, что возбудителем заболевания является F. necrophorum (42), хотя установлено, что в этиологии некробактериоза помимо основного возбудителя огромную роль играет гнойно-некротическая микрофлора: Clostridium petfringens, Staphilococcus aureus, Corynebacterium pyogenes и др. Микробные ассоциации своими ферментативными системами усиливают действие основного возбудителя, тем самым существенно повышая его вирулентность (54, 138).
У животных F. necrophorum вызывает абсцессы внутренних органов, аборты, копытную гниль, некротический ларингит (дифтерия телят) и другие поражения (123, 137). У человека некробактериоз клинически проявляется некротическим тонзиллитом, септицемией, стоматитом, периодонтитом, абсцессами печени и внутренних органов, эндокардитами (125, 131, 144, 46,.
71,74).
Возможные факторы патогенности F. necrophorum — лейкотоксин, липополисахаридный эндотоксин, гемолизин, гемагглютинин, ферменты (ДНКазы, лецитиназа, фосфатидаза, коллагеназа, фибринолизин, стрептокиназа, декарбоксилаза, щелочная фосфатаза, липаза) (159, 67).
Результаты исследования белков методом иммуноблотинга показали, что антитела сыворотки переболевшего некробактериозом животного реагировали с большинством белков, присутствующих в объединенной фракции. Наиболее яркие полосы соответствовали полипептидам с м.м. 300, 93, 75 55 кДа.
Из практики иммуноферментного анализа известно, что внесение в систему ИФА лишь одного элемента — сыворотки крови — создает столько проблем, сколько их может не встретится в разработке метода в целом. Антитела в ИФА используют в виде высокоактивных гипериммунных сывороток. Для сорбции на твёрдую фазу используют IgG — фракцию, выделенную из иммунной сыворотки. Методы выделения иммуноглобулинов, применяемые в разных лабораториях, различны. Используя накопленный опыт различных исследователей и применив отдельные этапы их разработок, мы, комбинацией ряда иммунохимических методов получили чистые и высокоактивные препараты иммуноглобулина КРС класса G с тем же или несколько более высоким титром преципитирующей активности.
Выделение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) проводили методом аффинной хроматографии. Объем наносимой на колонку антисыворотки зависел от ее титра в РДП: чем ниже титр, тем больший объем наносили. Так, при титре 1:64 наносили 8 мл, 1:32 — 16 мл, 1:8 — 32 мл, соответственно.
Чувствительность и воспроизводимость ИФА во многом зависит от качества используемых коньюгатов. Для конъюгации ферментов с антителами или антигенами используют чаще всего глутаровый альдегид или перийодат натрия. Мы в своей работе исплдьзовали для получения коньюгатов пероксидазу из хрена (ПХ), марки A, RZ — 2,8 — 2,9. В результате был получен высокоспецифичный, стабильный коньюгат, сохраняющий свою активность после лиофильного высушивания.
Результаты, полученные в ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РПГА. 35 сывороток отрицательных в РПГА (т.е. 24,1%) были положительны в ИФА. Обе методики быстры и позволяют исследовать большое количество сывороток. Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность, чем РПГА.
Таким образом, при сравнительной оценке уровня антиF. necrophorum антител, полученных различными методами РПГА и ИФА, установлено, что результаты титрования сывороток в ИФА имеют высокую степень соответствия с результатами РПГА. Метод чувствителен, быстр в исполнении и может быть использован при определении уровня анти-F.necrophorum антител при обследовании большого количества животных.
Анти-F.necrophorum IgG получали с помощью аффинной хроматографии. Приготовление сорбента на основе очищенного видоспецифичного антигена F. necrophorum проводили по стандартной методике, предварительно очистив антигенную фракцию от низкомолекулярных продуктов на Sephadex G-25.
С иммуносорбента элюировалось 6−7 мг антигена, сорбировалось, соответственно, 37−43 мг, что составляет 74−86% от исходного. Объем сорбента был равен 12 мл, в 1 мл геля иммобилизовано 3,5 — 3,7 видоспецифичного антигена F.necrophorum.
На колонку наносили сыворотку, содержащую антитела к F. necrophorum с титром в ИФА не менее чем 1:12 800.
Специфичность и активность полученных иммуноглобулинов была проверена в тест-системе для определения анти-F.necrophorum.
Для сравнительной оценки конкурентного и «сэндвич» — вариантов ИФА был использован патматериал, полученный от больных и подозрительных животных различных хозяйств.
Явным преимуществом методов ИФА оказалась более высокая чувствительность, чем РТГА. Однако, при общей высокой чувствительности сэндвич"-вариант ИФА был более прост и быстр в исполнении чем конкурентный.
Результаты детекции антигенов F. necrophorum, полученные в гистохимическом варианте ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РТГА, непрямом и прямом вариантах РИФ. Из 130 образцов патматериала 8 образцов оказались отрицательными во всех четырех реакциях, 4 образца — отрицательными в РТГА и положительными в двух вариантах МФА и гистохимическом варианте ИФА, остальные были положительными во всех четырех сравниваемых реакциях. Таким образом, гистохимический вариант ИФА не уступает по чувствительности и воспроизводимости прямому и непрямому варианту РИФ и такому надежному методу как РТГА. Неоспоримым преимуществом гистохимического варианта ИФА являются простота и доступность для ветеринарных лабораторий не оснащенных оборудованием для люминесцентной микроскопии. Предложенная схема постановки ИФА может быть использована как в практических, так и в научных целях.
Одним из перспективных направлений в плане совершенствования флуоресцирующих диагностикумов является получение фракции антител, используемых для метки, с максимальным содержанием специфических антител. Преимуществом РИФ является ее специфичность, высокая чувствительность, определение искомого антигена среди других смешанных антигенов, получение быстрого результата, выявление как живых, так и мертвых микроорганизмов и их антигенов, простота выполнения.
Первым этапом создания люминесцентной тест-системы для определения F. necrophorum в патматериале было получение коньюгата анти-F.necrophorum IgG — ФИТЦ и коньюгата анти-IgG КРС IgG — ФИТЦ.
Результаты, полученные при проверке работы иммунофлюоресцентной тест-системы, сравнивали с результатами в РТГА. Из 130 образцов патматериала 8 образцов оказались отрицательными во всех трех реакциях, 4 образца — отрицательными в РТГА и положительными в двух вариантах РИФ, остальные были положительными во всех трех реакциях.
Таким образом, оба варианта РИФ не уступают по чувствительности такому надежному методу как РТГА. Неоспоримым преимуществом РИФ являются простота и высокая скорость постановки реакции. Метод технически не сложен, хотя и требует определенных навыков в интерпретации результата.
Для изучения напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе использовали опытную (п=6) и контрольную (п=6) группы телят. Предварительно все животные были проверены на отсутствие антител к F.necrophorum. Телятам опытной группы вводили некробактериозную вакцину производства ГЩБК (Щёлковский биокомбинат) согласно наставлению. Контрольной группе животных вводили неполный адьювант Фрейнда. Кровь брали на 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 14 день после введения вакцины.
В результате изучения напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе, установлено, что в крови контрольных животных наблюдается увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК клеток на 7 сутки. Полученные данные свидетельствуют о том, что динамика образования спонтанных Е-лимфоцитов совпадала с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.
6.1. Отработан метод получения очищенного антигена F.necrophorum. С помощью электрофореза в ПААГ в составе антигена определена молекулярная масса белков в диапазоне от 30 до 300 КД, специфичных в ИФА.
6.2. Установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.
6.3. Показана возможность выделения антинекробактериозных антител из сыворотки переболевших животных с помощью аффинной хроматографии на нерастворимой фракции бактериальных клеток.
6.4. Получены анти-IgG КРС сыворотки на кроликах с титром в РДП 1:32 — 1:256. Синтезированы высокоактивные коньюгаты анти-IgG КРС с ФИТЦ (1:1000 в непрямой РИФ) и ПХ (1:20 000 в непрямом твердофазном ИФА).
6.5. Показано, что разработанная тест-система характеризуется специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью результатов. Установлена явная корреляционная зависимость методов РТГА и РИФ при обнаружении антигена F. necrophorum в гнойно-некротических поражениях КРС, ИФА и РПГА при количественном определении содержания антител к F.necrophorum. Выявлено, что метод ИФА при определении антигена F. necrophorum, превосходит по чувствительности РТГА.
6.6. Технология получения реагентов и методика проведения ИФА положены в основу разработанной тест-системы и созданы «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л», «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А»;
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
В практику предложены тест-системы для обнаружения антител и антигенов к F. necrophorum в сыворотках КРС методом иммуноферментного анализа. Метод может быть рекомендован для включения в схему лабораторных исследований с целью диагностики некробактериоза.
Материалы работы использованы при составлении нормативной документации на «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-JI», «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» (ТУ, Инструкция и Наставление).
