Синтез и взаимодействие с холинэстеразами эфиров кислот фосфора, содержащих гидрофобные группировки

Фосфорорганические физиологически активные соединения в настоящее время нашли широкое применение в народном хозяйстве. Среди этих веществ найдены высокоэффективные инсектициды, акарициды, фунгициды, гербициды, многие из которых с успехом используются в сельском хозяйстве. Особенно возросла роль фосфорорганических пестицидов после ограничения масштабов применения хлорорганичес-ких инсектицидов, которые, как известно, обладают значительной персистентностью. Ряд фосфорорганических препаратов нашел также применение в медицине.

Запросы практики, однако, требуют поисков новых эффективных биологически активных веществ и, в первую очередь, химических средств защиты растений, которые обладали бы комплексом свойств, удовлетворяющий современным требованиям, например, таким, как высокая эффективность при низкой токсичности для человека, теплокровных животных и полезных насекомых, низкая персистентность и многие другие. Фосфорорганические соединения в этом отношении являются одними из наиболее перспективных.

Известно, что физиологическая активность фосфорорганических инсектоакарицидов связана с их способностью инактивировать холин-эстеразы — жизненно важные ферменты, принимакщие участие в регулировании передачи нервного возбуждения. Такой механизм передачи нервного возбуждения характерен не только для теплокровных животных, но и для членистоногих. Работами советских и зарубежных ученых показано, что холинэстеразы различных видов животных имеют, как правило, отличительные по характеру действия и поэтому изучение особенностей действия холинэстераз различного происхождения может послужить основой для поисков избирательно действуюцих фос-форорганических ингибиторов холинэстераз, а следовательно, и ин-сектоакарицидов, обладащих избирательностью действия по отношению к определенным видам животных. Для решения этой проблемы важное значение имеет изучение механизма антихолинэстеразного действия фосфорорганических соединений по отношению к холинэстеразам различных типов, в частности, к ацетилхолинэстеразе и бутирилхо-линэстеразе.

Систематические исследования в этом направлении проводятся коллективом сотрудников под руководством М. И. Кабачника, А.П.Брестки-ыа, В. И. Розенгарта и Н. Н. Годовикова. Ими было показано, что в процессе ингибирования холинэстераз фосфорорганическими соединениями важную, а иногда и решающую, роль, играет гидрофобная сорбция ингибитора на активной поверхности холинэстераз. Долгое время считалось, что гоосфорорганические соединения способны ингибировать хо-линэстеразы только необратимо. Однако в 1964 году Олдрщщем и Рейнер было показано, что гоосфорорганические ингибиторы способны тормозить каталитическую активность ацетилхолинэстеразы не только необратимо, но также одновременно по обратимому типу. Такой вид ингибирования получил название комбинированного.

В дальнейшем М. И. Кабачником, А. П. Бресткиным и Н.Н.Годовико-вым с сотрудниками было показано, что комбинированный вид ингибирования характерен не только для ацетилхолинэстеразы, но также и для бутирилхолинэстеразы. Было выявлено существенное влияние на такой вид ингибирования гидрофобных группировок, находящихся в молекуле фосфорорганического ингибитора. Однако оставались неся-ными факторы, оказывающие главное влияние на проявление этими соединениями комбинированного вида торможения каталитической активности холинэстераз. Поэтому представляло интерес выяснение этих факторов, что и послужило основным направлением настоящего исследования .

При этом, по нашему мнению, важно было выяснить роль гидрофобных группировок, находящихся как в отщепллвдейся, так и не-отщепляпцейся части молекулы ингибитора, на процесс обратимого ингибирования.

В качестве главных объектов исследования наш были выбраны эфиры фенилтиофосфоновой, фенилфосфоновой, циклогексилфосфоновой, циклогексилтиофосфоновой, бензилтиофосфоновой и бензилфосфоновой кислот, содержащих вув-положении тиоэфирной или алкоксильной группы алкилмеркаптоили соответствующую сульфониевую группировку, где варьировалась длина алкильной группы у сульфидного или сульфониевого атома серы. В случае фенилтиофосфонатов и фенилфос-фонатов варьировалась также джна алкоксильной группы у атома фосфора:

И: О Я X р р / +.

К* Х-СН2СН2−5-Е" И" Х-СН2СН2−5-К" -1.

К=СбН5, -С^, СбН5СН2, СН^, 0⁰, С^н90- н"=с2н5о, с3н? о, с4н90, с^о, с6н13о-,.

Н" =СН3 — С^, -СН2СбН5, СбН5, СбН5, -СбН4- СНГ П Х=0,Б.

Кроме того, были изучены некоторые эфиры 0,0-диалкилтиофос-форных, дифенилтиофосфиновой и фенилтиофосфоновой кислот, у которых варьировалась джна алкильного радикала алктиольной группы: к=с6н5, с4н90, сбн13о.

X/ р/ I?'=0⁰, 0⁰, с6н13о. ят?" к" эй" сбн5.

Н" =сн3 — сбн13) а также тиоэфиры глетилтиоуосйоновой кислоты, содержащие б ¿-вположении алктиольного радикала алкилсульфокси-группу, где варьировалась длина алкильного радикала, связанного с атомом сульфоксид-ной серы:

СНо, 0.

С2Н50 / ^Б-С^С^- 8 -й И = СН3 — С6Н13. О.

Соединения вышеуказанного типа были получены с использованием методов синтеза, описанных в литературе, при этом, с учетом специфики строения синтезируемых веществ, в эти методы вносились изменения, позволившие увеличить выходы целевых веществ и облегчить их выделение в индивидуальном состоянии.

Для всех синтезированных веществ была определена антихолин-эстеразная активность по отношению к ацетилхолинэстеразе эритроцитов крови человека и бутирилхолинэстеразе сыворотки крови лошади с использованием метода потенциометрического титрования при постоянном рН, метода измерения скорости начального изменения рН. На основании полученных данных был сделан вывод о том, что наличие определенным образом расположенных гидрофобных заместителей в молекуле ингибитора влияет не только на силу ингибирования, но и способствует проявлению комбинированного вида торможения каталитической активности холинэстераз. Наиболее резко этот эффект проявляются при наличии гидрофобных заместителей в неотщепляю-щейся части молекулы ингибитора. В значительно меньшей степени сказывается на эффекте комбинированного ингибирования наличие подобных заместителей в отщепляющейся части.

При обобщении полученных данных рассмотрены представления о роли гидрофобной сорбции в процессе ингибирования холинэстераз фосфорорганическими соединениями. Был сделан вывод, что следует рассматривать не только комплементарность отдельных гидрофобных группировок определенным гидрофобным участкам на активной поверхности холинэстераз, но и эффект комплементарности всей молекулы активной поверхности фермента. Здесь ванное значение имеет «согласованность» или «несогласованность» эффектов гидрофобной сорбции ингибитора на гидрофобных участках, расположенных в районе анионного и эстеразного пунктов холинэстераз. Таким образом, эффект комбинированного вида ингибирования холинэстераз зависит от многих факторов, причем здесь ведущую роль играют гидрофобные взаимодействия, существенно меняющие компле"Эг§ арность молекулы ингибитора активной поверхности фермента. Установлено, что варьирование величины и положения гидрофобных и полярных заместителей в молекуле фосфорорганического ингибитора позволяет изменять не только силу ингибирущей активности этих соединений, но и характер их действия на холинэстеразы. Показано, что закономерности таких изменений для ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы различны.

Полученные в работе результаты могут быть использованы в исследовании специфических ингибиторов холинэстераз с различными механизмами действия, что может иметь важное значение при поисках новых пестицидов и других физиологически активных веществ.

Работа выполнена на Кафедре органической и биологической химии Кабардино-Балкарского государственного университета и в Институте элементоорганических соединений АН СССР по плану исследований, проводящихся под общим руководством академика М.И.Кабач-ника.

Все сделанные в работе выводы основаны на результатах, полученных в исследованиях, выполненных лично автором и под его руководством.

В работе принимали участие сотрудники и аспиранты Кабардино-Балкарского госуниверситета: М. Х. Беканов, Г. Г. Ольховая, В.М.Куза-мышев, Л. Г. Гринева.

Автор выражает благодарность профессору А. П. Бресткину и старшему научному сотруднику Р. С. Агабекяну за активное участие в проведении совместных биохимических исследований. современные представления о строении холинэстераз" и механизме взаимодействие их с фосфороргашческими ингибиторам.

Литературный обзор).

Холинэстеразы относятся к жизненно важным ферментам, участвующем в передаче нервного возбуждения. В настоящее время различают две группы холинэстераз, которые отличаются по свойствам и строению /I, 2/. К первой группе относится ацетилхолинэстераза (АХЭ) или ацетилгидролаза ацетилхолина (КФ 3.1.1.7.), физиологическое назначение которой состоит в гидролизе ацетилхолина — медиатора нервного возбуждения. Ко второй группе относится холинэстеразы или ацшггидролазы ацилхолинов (КФ 3.1.1.8.), физиологическое назначение которых пока неясно. Предполагается, что холинэстеразы защищают организм от случайно попадапцих в кровь ацетилхолина и подобных ему веществ /3/. В зависимости от того, холиновые эфиры каких кислот лучше всего гидролизуются холинэстеразами, различают, бутирилхолинэстеразу, пропионилхолинэстеразу, бензоилхолинэстера-зу и т. д.

Роль ацетилхолинэстеразн в передаче нервного возбуждения в настоящее время достаточно ясна. Вообще, механизм химической передачи нервного возбуждения изложен во многих обзорах и монографиях ¦ /4−13/. Схематически его можно представить следуицим образом (рис. I).

В нервной клетке синтезируется при участии фермента холин-ацетилазы и коэнзима «А» ацетилхолин, который накапливается в окончании нервного волокна в виде синаптических пузырьков диаметром около 400 2. При прохождении нервного импульса по аксону мк.

1— I ммшш1ттпШМММ7Мт,.

Рис. I. Схема синапса с химической передачей возбуждения.

А — электронно-микроскопическая картина синапса /14/. Б — выход молекул медиатора и их взаимодействие с молекулами рецептора /15/. Г — нейрофибриллы, 2 — мембрана глиальной клетки, окружающей синапс (изображена пунктиром), 3 — митохондрии, 4 — синаптические пузырьки, 5 — пресинапти-ческая мембрана, 6 — субсинаптическая (постсинапти-ч е екая) мембрана.

часть синаптических пузырьков проходит через персинаптиче скую мембрану и ацетилхолин поступает в синаптическую щель шириной 200−500 X. Взаимодействие ацетилхолина с холинорецепторами, расположенными на постсинаптической мембране, приводит к изменению поляризации последней, что, в свою очередь, вызывает возбуждение 1 или торможение’иннервируемой клетки. Ацетилхолин, выполнивший свою функцию, сразу же гидролизуется при помощи ацетилхолинэстеразы.

Многие фосфорорганические соединения обладают способностью необратимо блокировать холинэстеразы, то-есть лишают их способности осуществлять свою функцию. Это приводит к нарушению нормальной передачи нервного импульса и, в конечном счете, к гибели организмов.

Следует отметить, что мысль об антихолинэстеразном действии фосфорорганических соединений впервые была высказана А.Г.Гинецин-ским в 1942 году /2/. На способности фосфорорганических соединений ингибировать холинэстеразы и, в частности ацетилхолинэстера-зу, основано их применение в качестве инсектоакарицидов. Так как холинэстеразы различных организмов имеют различное строение, имеется принципиальная возможность получения фосфорорганических соединений, избирательно действующих на вредных насекомых и не токсичных для теплокровных животных и полезных насекомых. Для решения этой проблемы необходимо глубокое изучение строения холин-эстераз и механизма их действия. Прежде, чем перейти к изложению результатов, полученных нами при изучении механизма взаимодействия различных фосфорорганических соединений с холинэстеразами, рассмотрим литературные исследования, посвященные изучению строения холинэстераз, механизма гидролиза ацетилхолииа и взаимодействия холинэстераз с фосфорорганическими соединениями.

ВЫВОДЫ.

1. Синтезированы эфиры метилтиофосфоновой, диэтилтиофосфорной, фенилтиофосфоновой, циклогексилтиофосфоновой, бензилтиофосфоно-вой и бензилфосфоновой кислот, содержащие в рположении алк-тиольного радикала алкил (арил)меркаптогруппу и соответствующие им йодметилаты, тиоэфиры 0,0-дибутили 0,0-дигексилтиофосфор-ной, дифенилтиофосфиновой и О-этилфенилтиофосфоновой кислот, содержащие алктиольные радикалы, а также тиоэфиры метилтиофосфоновой кислоты, имеющие в? -положении тиоэфирного радикала алкилсулъфоксигруппу.

2. Изучено взаимодействие синтезированных соединений с ацетилхо-линэстеразой эритроцитов крови человека и бутирилхолинэстера-зой сыворотки крови лошади.

3. Найдено, что 0-этил-Балкилмеркаптоэтил)фенилтиофосфонаты и их йодметилаты способны проявлять только необратимую ингиби-рующую активность не-зависимо от длины алкильного радикала, связанного с атомом сульфидной или сульфониевой серы.

4. Показано, что 0-алкилБ-{рметилмеркаптоэтил)фенилтиофосфона-ты, имеющие в алкоксильных группах этильные, пропильные и бу-тильные радикалы, являются необратимыми ингибиторами холинэстеразувеличение радикалов до амильного и геКсильного сопровождается появлением комбинированного вида ингибирования.

5. Йодметилаты 0-алкил- -метилмеркаптоэтил)фенилтиофосфона-тов при увеличении алкильного радикала алкоксильной группы до амильного и гексильного приобретают свойства комбинированных ингибиторов лишь по отношению к бутирилхолинэстеразе. По отноше.

ШШ И айемхожнэотеразе эти с])ос (1)орорганические ингибиторы являются только необратимыми ингибиторами.

6. 0-Этил- ^-алкишеркаптоэтил)циклогексилтиофосфонаты являются ингибиторами холинэстераз комбинированного вида действия и по активности резко уступают аналогичным фенилтиофосфонатам.

7. Ингибиругацая активность циклогексилтиофосфонатов по отношению к бутирилхолинэстеразе значительно зависит от длины алкоксиль-ного радикала, находящегося у атома сульфидной или сулъфоние-вой серы. По отношению к ацетилхолинэстеразе эти соединения менее активны и их эффективность мало зависит от длины алкиль-ного радикала, связанного с атомом сульфидной или сульфоние-вой серы.

8. Йодметилаты 0-этил-Б -(узалкилмеркаптоэтил)циклогексилтиофос-фонатов взаимодействуют с бутирилхолкнэстеразой по комбинированному типу, в то время как ацетилхолинэстеразу они ингибируют только необратимо, за исключением нонильного производного, который является ингибитором комбинированного действия.

9. Найдено, что 0-этилБ-(уЗалкишеркаптоэтил)бензилтиофосфона-ты и их йодметилаты по отношению к бутирилхолинэстеразе являются более сильными ингибиторами, чем аналогичные фенилтиофос-фонаты. По отношению к ацетилхолинэстеразе имеет место обратное соотношение между активностями бензилтиофосфонатов и фе-нилтиофосфонатов.

10. На примерах Б-/> -арилмеркаптоэтиловых эфиров кислот фосфора показано, что соединения, имеющие у атома сульфидной серы фе-нильную, толильную или бензильную группировки, способны в определенных случаях проявлять комбинированный вид ингибирования.

11. Найдено, что тиоэфиры кислот пятивалентного фосфора, не содержащих в алктиольных радикалах каких-либо полярных группировок, такие как? -алкилдифенилтиофосфинаты, 0-этил-уз-ал-килфенилтиофосфонаты, 0,0-дибутил—ажилтиофосфаты и 0,0-дигексил-^-ашшлтиофосфаты проявляют только комбинированный вид ингибирования.

12. Показано, что 0-этил-Б -(? -ажилсулнроксиэтил)метилтиофос-фонаты способны проявлять только необратимую ингибирувдую активность. По сравнению с аналогичными соединениями сульфидного типа изученные вещества по отношению к ацетилхолинэстера-зе более активны, а по отношению к бутирилхолинэстеразе менее активны.

13. Найдено, что 0-этил-0-(/ -алкишеркаптоэтил)фенилфосфонаты, 0-алкил-0-(Аметилмеркаптоэтил)фенилфосфонаты, 0-этил-0-О^-алкилмеркаптоэтил)циклогексилфосфонаты, 0-этил-0-(ражил-меркаптоэтил) бензил:—^, фосфонаты и их йодметилаты являются только обратимыми ингибиторами холинэстераз. Сделан вывод о том, что алкиловые эфиры кислот пятивалентного фосфора способны ингибировать холинэстеразы только обратимо.

14. Показано, что*гидрофобная сорбция при определенных структурных особенностях ингибитора может способствовать благоприятной его ориентации на активной поверхности фермента, в результате чего скорость необратимого ингибирования возрастает. Однако гидрофобная сорбция может и препятствовать «правильной» ориентации, что приводит к эффекту обратимого ингибирования.

Гидрофобные заместители в молекуле ингибитора могут также создавать пространственные препятствия в реакции фосфори-лирования, что приводит к снижению константы скорости необратимого ингибирования и появлению обратимой компоненты.

15. Высказано предположение, что эффект избирательности антихо-лин^эстеразного действия, сила и вид ингибирования холинэсте-раз фосфорорганическиш соединениями зависят от ряда факторов, из которых наиболее существенными являются: электрофильная фосфорилируицая способность ингибиторов, гидрофобная сорбция определенных группировок ингибитора на соответствующих гидроп фобных участках активной поверхности фермента, согласованность или несогласованность гидрофобного связывания на гидрофобных участках в районах эстеразного и анионного центров.

16. Предложены схемы-согласованной'1 и несогласованной" сорбции молекул фосфорорганических ингибиторов на активной поверхности хо-линэстераз.

17. Определена инсектоакарицидная активность ряда синтезированных соединений, среди которых выявлены эффективные избирательно действующие акарициды. Сделан вывод о перспективности поиска новых фосфорорганических инсектоакарицидов на основе варьирования в их молекулах гидрофобных и полярных фрагментов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Можно попытаться суммировать наши знания о механизме ингибирования холинэстераз фосфорорганическими ингибиторам! и о зависимости ингибирующей активности фосфорорганических соединений от их строения.

Несомненно, что необратимое ингибирование холинэстераз — результат химической реакции фосфорорганических соединений с активным центром фермента — фосфорилирование эстеразного участка активного центра — гидроксила серина, включенного в полипептидную цепь фермента. Несомненно также, что обратимое ингибирование холинэстераз фосфорорганическими веществами — результат их сорбции на активной поверхности фермента, блокирующей (по тому или иному механизму) этот центр и не позволяющий, таким образом, естественному субстрату — ацетилхолину атаковать фермент.

При необратимом ингибировании действие ингибитора складывается из ряда актов, которые можно разделить на две группы: а) образование фермент-ингибиторного комплекса и б) собственно, реакция фосфорилирования. Образование фермент-ингибиторного комплекса включает сорбцию ингибитора, при которой он принимает надлежащую конформацию, и вызванную сорбцией коиформационную перестройку фермента. Собственно, фосфорилирование — тоже сложный процесс, в котором принимают участие разные функциональные группы фермента.

Поскольку мы в нашей работе старались сравнивать ряды фосфорорганических ингибиторов, характеризующихся примерно одинаковой электрофильной реакционной способностью, можно отвлечься от роли фактора фосфорилирования и сосредоточить свое внимание на первой группе фактов — образовании фермент-ингибиторного комплекса.

Сорбция молекулы фосфорорганического ингибитора на активном участке фермента зависит от разного типа взаимодействии. Это ион-ионное, ион-дипольное, диполь-дипольное взаимодействие и гидрофобная сорбция.

Ион-ионное (кулоновское) взаимодействие связывает триметил-аммониевую «головку» ацетилхолина с анионным участком активного центра или, соответственно, ониевую (заряженную) часть молекулы ингибитора (например, сульфониевую серу) с анионным участком.

Роль кулоновского взаимодействия в процессе ингибирования установлена большим количеством исследователей /53, 54, 97, 99 105, 106, 208, 271/ и еще раз подтверждена в нашей работе. Так, при переводе сульфидной серы изученных тиофосфонатов в сульфониевую (см. общую часть), константы необратимого ингибирования холин-эстераз увеличиваются в 100−2500 раз.

Считается, что введение катионной группы в молекулу фосфор-органического ингибитора приводит к повышению констант необратимого ингибирования за счет двух факторов: ион-ионного взаимодействия с анионным центром фермента и увеличения электрофильной фосфорилирупцей способности ингибитора, вследствие индуктивного влияния заряженной группы. Разделить эти два фактора количественно очень трудно, но такая попытка была предпринята /III/. Было высказано предположение /112/, что при незначительном расстоянии между заряженной группой и атомом фосфора антихолинэстеразная активность ингибитора примерно в одинаковой степени определяется обоими факторами, а при большом расстоянии между указанными группами решающую роль играют ион-ионные взаимодействия.

В связи с изложенным, интересно отметить следующее. Если.

— 226 ион-ионное взаимодействие играет существенную роль в процессе ингибирования холинэстераз фосфорорганическими соединениями, то появление заряда в молекулах ингибиторов обратимого вида действия должно также сильно увеличивать их ингибиругацую активность, как и в случае тиофосфонатов. Однако переход от сульфидных производных к сульфониевым, в случае изученных нами фосфонатов (см. общую часть), или не приводит к увеличению ингибирующей активности, им увеличивает ее незначительно (в 2−20 раз).

Видимо, следует признать, что ион-ионная сорбция играет свою роль, главным образом, в ориентации молекулы ингибитора (как субстрата) на активной поверхности фермента, при котором дожат осуществляться стадия фосфорилирования. В случае фосфонатов — обратимых ингибиторов — ориентация, естественно, роли не играет, и это резко снижает эффект от появления зарядакроме того, в случае необратимых ингибиторов огромную роль играет индуктивный эффект ониевой группы, повышающей электрофильную реакционную способность соединения, что приводит к резкому увеличению ингибирующей активности фосфорорганических ингибиторов. •.

Сказанное можно подтвердить тем, что константы щелочного гидролиза тиофосфонатов, которые прямо связаны с фосфорилирующей способностью фосфорорганических ингибиторов, увеличиваются при появлении катионной группы в отщепляющейся части молекулы фосфорорганических ингибиторов в 100−200 раз /139, 194/.

В случае дифенилтиофосфонатов типа (с6н^)2р (о)8(сн2)пбс2н^.

I) и (с^^РСО^ссн^дбс^ • 5, изученных ранее /78/, переход о.

11) сн^ соединений типа (I) к соединениям типа (П) должен сопровождаться резким увеличением ингибирующей активности как при п= 2, так и при п = 6, за счет появления положительного заряда. На самом де к;

117 (при п = 2) и.

— 227 ле в случае бутирилхолинэстеразы.

— ту— = 5 (при п = 6), то-есть с увеличением расстояния между 1Са атомом фосфора и катионной головкой активность заряженных соединений приближается к активности незаряженных соединений. Несомненно, что в данном случае определенную роль играет эффект несогласованности гидрофобной и ион-ионной сорбции (см. ниже), но симбатное уменьшение констант щелочного гидролиза и констант скорости необратимого ингибирования бутирилхолинэстеразы заряженными соединениями при увеличении п (рис. 57) /79/ подтверждает, что падение ингибиторной активности связано в основном с падением фосфорилирущей активности фосфорорганических ингибиторов, как следствие — .т — эффекта.

4,5.

— о 2.

ИоН.

2,5.

20 5.

1.0 П.

2 3 4 5 6.

Рис. 57. Зависимость констант скорости /79/:

1 необратимого торможения бутирилхолинэстеразы (к) — э.

2 щелочного гидролиза (1вК0н) — от (п) для соединений.

С6Н5)2Р (0)Б (СН2)п8С2Н5.5: сн, р

Ион-дипольное взаимодействие, видимо, имеет место между анионным пунктом фермента и полярной функциональной группой, находящейся в отщепляемой части молекулы ингибитора, например, группировкисн2-Б-К. Это видно, например, из сравнения антихо-линэстеразной активности Ббутил-О-этилфенилтиофосфоната (I) и Б-уЗметилмеркаптоэтил-О-этилфенилтиофосфоната (П).

СХ О О ¿-Неуо б5 / 6 Ч /.

I) (П).

С^О^^{ЗСН2СН2СН2СН3} С2Н5°// ЬСН2СН2-Б-СН5.

Для соединения I, не имеющего полярной группировки в отщепляемой части молекулы ингибитора, константа необратимого ингибирор вания ацетилхолинэстеразы составляет 5,8*10, а по отношению к о бутирилхолинэстеразе — 7,7*10. В случае же соединения П, имеющего полярную группировку, эти константы соответственно равны 5,2*104 и 1,3"104, то-есть на два порядка выше.

Диполь-дипольное взаимодействие, по-видимому, разыгрывается на эстеразном участке фермента, где сорбируется ацетильная группа ацетилхолина, а при действии фосфорорганических соединений — фосфорильная группа ингибитора. Как уже было указано выше, диполь-дипольное взаимодействие, видимо, играет одну из главных ролей при взаимодействии фосфорорганических ингибиторов с холин-эстеразами. фактор, определяющий «прилипание» гидрофобных частей молекулы ингибитора к гидрофобным участкам активной поверхности. Роль гидрофобной сорбции очень важна, однако она будет положительной (в смысле ускорения процесса инги-бирования) лишь в том случае, если ее действие и действие электростатических факторов происходит согласованно, то-есть все факторы способствуют «правильной» ориентации молекулы ингибитора на активном участке фермента.

При несогласованности разных видов взаимодействия может наступить ослабление ингибиторной активности и даже изменение типа ингибирования от необратимого к обратимому.

На рисунке 58 приведены схемы некоторых вариантов несогласованной сорбции. Во всех случаях несогласованной сорбции молекула ингибитора ориентируется на активной поверхности ферментов таким образом, что атом фосфора и гидроксил серина пространственно разобщены, и фосфорилирование затруднено. Видимо, в случае такой несогласованной сорбции мы и обнаруживаем эффект комбинированного вида действия фосфорорганического ингибитора. При согласованной же сорбции все сорбционные силы, участвующие в каждом конкретном акте ингибирования фермента, ориентируют молекулу фосфорорганического ингибитора таким образом, что атом фосфора и гидроксил серина пространственно сближены, и может наступить процесс фосфорилирования.

Как згже было указано выше, несогласованность сорбции, видимо, имеет место в случае дифенилтиофосфонатов, изученных ранее.

78/. Резкое уменьшение ингибирулцей активности соединений.

С6Н^)2Р (0)8(СН2)П8С2Н^^ при увеличении (п) связано, как сн-, р было указано (см. вьппе), не только с уменьшением фосфорилирую-щей способности фосфорорганических ингибиторов, но и с несогласованностью ион-ионного взаимодействия на анионном пункте и ди-поль-дипольного взаимодействия на эстеразном пункте (рис. 58а), которая является следствием неоптимального расстояния между фосфором и ониевым зарядом.

— 230.

В работе /186/, а также неоднократно в наших исследованиях, было показано, что несогласованность гидрофобных взаимодействий в отщепляемой и неотщепляемой части молекулы резко ослабляет ин-гибиторный эффект, так как прочная гидрофобная сорбция гидрофобных радикалов на гидрофобных участках, в районах эстеразного и анионного пунктов активной поверхности ферментов, ориентирует атом фосфора так, что он отделен от гидроксила серина и фосфори-лирование затруднено (рис. 58с).

Эффект такой несогласованной сорбции подтверждается при рассматривании антихолинэстеразной активности соединений типа абр (о)бспн2п+1 при разных п .

По отношению к ацетилхолинэстеразе (рис. 59) вещества типа (с2н50)сн5р (0)бспн2п+1 при росте п показывают повышение ин-гибирупцей активности до п = 8-Ю, в зависимости от строения радикала, а вещества типа (С4Н9°)2Р⁰^спН2п+1' хорошо сорбирующиеся за счет гидрофобной сорбции алкоксильных групп на гидрофобных участках, расположенных в районе эстеразного пункта, практически не повышают констант необратимого ингибирования (ка) с ростом (п), а в случае (сбн1з0)2р (°)8Спн2п+1 после п = 4 наблюдается даже снижение значений этих констант. Таким образом, наличие двух объемистых гидрофобных групп в молекуле ингибитора не дает с ростом п такого роста ка, как наличие только одной (рост к2 метильного производного). Видимо, сорбция одновременно двух: гидрофобных групп невыгодно ориентирует атом фосфора по отношению к сериновому гидроксилу.

Производные дифенилтиофосфиновых кислот (0бН5)2Р (0)БСпн2п+1, хотя и показывают рост ка, но при п = 6 становятся уже слабее этоксиметильного производного. Отметим, что у всех веществ, кроме этоксиметильных, наблюдается обратимая компонента торможения,.

— 231 что свидетельствует о наличии непродуктивной сорбции.

По отношению к бутирилхолинэстеразе (рис. 60), гидрофобные области активной поверхности которой выражены^ для соединений метального ряда (с2н^о)сы^р (о)бспы2п+^, наблюдается резкий рост К2 до п= 6- то же имеет место и для соединений (с2н^о)с6н^р (о)бспн2п+^ (табл. 67). БАлкилдибутилтиофосфаты, гораздо более активные в силу хорошей гидрофобной сорбции, тоже показывают рост ка (но есть обратимая компонента), а Балкил-гексилтиофосфаты при малых п показывают самую высокую активность (Б-метальное производное), но в силу эффекта «несогласованности» повышения активности с ростом п не наблюдается.

БАлкилдифенилтиофосфинаты при небольших п (1−3) приблизительно равны по силе этоксиметильным и этоксифенильным производным, а далее с ростом п существенно отстают от них. Отметим, что обратимая компонента ингибирования (результат непродуктивной сорбции) в этом случае у дифенильных производных выражена сильно (к. порядка 10).

Как уже было указано выше, несогласованность сорбции может привести даже к изменению вида ингибирования от необратимого к обратимому. Так, в работе /65/ показано, что Б-метилдииозпропил-тиофосфинат (1-с^н,-7)2Р (о)бсн^) является ингибитором ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы только обратимого вида действияб-метилдифенилтиофосфинат (с6н^)2р (о)бсн^ - чисто обратимый ингибитор ацетилхолинэстеразы. Видимо, в данном случае проявляется эффект гидрофобного экранирования (рис. 58 а), Изученные нами 0-этилБнонижлеркаптоэтил)циклогексилтиофосфонат С6Н11(С2Н?-0)Р (0)БСН2СН2БС^Н1^ и 0-этилБбензилмеркапто-этил)циклогексилтиофосфонат С6Н11(С2Н⁰)Р (0)БСН2СН2БСН2С6НС-, хотя и являются ингибиторами комбинированного действия, но очень а) он несогласованность ион-ионной и диполь-дипольной сорбции / о рБ-СИМЯ ж, в) он несогласованность ион-ионной и гидрофобной сорбции с) несогласованность гидрофобных форбций в районах эстераз-ного и анионного пунктов а) гидрофобное экранирование фосфора.

Рис. 58. 5 4 1.

J1.

5 б 8 О п.

Рис. 59* Зависимость констант скорости необратимого ингибирова-ния (1б ацетилхолинэстеразы соединениями: (С^ОХЗ^РСО)^ (I).

СбН5)2Р (0)ЯЙ (С6Н130)2Р (0)8К (С^ОСН^РСОБЕ (С4Нд0)2РС0)БН.

2).

3).

4).

5).

Рис. 60. Зависимость констант скорости необратимого ингибирования бутирилхолинэстеразы соединениями:

СбН5)2Р (0)8Е (I).

С^ОСН^РСОБН (2).

С^ОС^РСОБЕ (3) (СбН130)2Р (0)8К (4) с4нд0)2р (0)вн (5) близки по ингибирупцей способности к обратимым ингибиторам. Константы необратимой компоненты ингибирования у них очень малы, соп О ответственно ка = 1,5"10 л/моль мин. и ка = 1,8"10 л/моль мин, а судя по константам к. и к. «характеризующим обратимую ком.

X у X X) «5 поненту ингибирования (соответственно К- =3,0*10 6.

X } л:

5,(МО-4, К. ч =2,0.10~5), они являются.

1,3-Ю" 5 и К,.

1,Г сильными обратимыми ингибиторами. Прямые зависимости 1бттг от.

Т/тъ для указанных соединений почти параллельны оси абсцисс (рис. 61), то-есть приближаются по углу наклона к обратимым ингибиторам. й.

5,0 4, о V V о?

1% О ю 7.

20 зо.

1?

Рис. 61. Зависшлость 1 &—Т&от времени инкубации (-ъ) ацетилхолинэстеразы с I — с^^с^узжо^сн^н^с^д и = 5,6 'Ю-5М и 2 — СбН1 Л (С^Н^О)Р (0)ЗСН2СН2ЙСН2СбН5 —.

Видимо, в данном случае имеет место несогласованность гидрофобной сорбции циклогексильной и нонильной (соответственно — бен-зильной) групп и диполь-дипольной сорбции атома фосфора на гидроксил серина.

Здесь необходимо учитывать еще одно обстоятельство. Мы знаем, что увеличение гидрофобных радикалов в молекуле ингибитора как в неотщепляемой, так и в отщепляемой частях молекулы вызывает усиление ингибиторного эффекта только до определенного предела. Дальнейшее увеличение алкильных групп приводит к падению эффективности. Мы полагаем, что в этом случае сказывается действие второго этапа формирования фермент-ингибиторного комплекса — кон-формационной перестройки фермента, предшествующей или сопутствующей элементарному акту фосфорилирования. Слишком большие гидрофобные радикалы, не умещающиеся на гидрофобных участках, препятствуют конформационным перестройкам, и это приводит кснижению активности ингибитора.

Ацетилхолинэстераза, особо специфично адаптированная к ме-тильной группе ацетилхолина, интенсивно ингибируется производными метилфосфоновой кислоты. Хотя и у ацетилхолинэстеразы в районе эстеразного пункта есть гидрофобные участки, все-таки во многих случаях метильная группа дает наибольший эффект.

У многих из исследованных нами веществ иигибирование активности холинэстераз происходит по комбинированному типу, т. е., наряду с необратимым ингибированием, имеет место обратимое, характеризующееся равновесными константами к• и К. и соответству.

1, Г X, о кщее образованию фермент-ингибиторного комплекса, не превращающегося в фосфорилированный фермент. В таблице 68 дана сводка проявления обратимой компоненты в зависимости от строения ингибитора.

При рассмотрении таблицы 68, прежде всего, бросается в глаза соотношение свойств веществ 'Ш 3, 12 и 19. При наличии^{9-ал-килмеркаптоэтильной} группы у атома серы (вещество № 3), связанной с атомом фосфора, эффекта обратимости нет, и он появляется только при высших алкоксильных группах при фосфоре (с^н^о или сбн^О вместо с2н^о), а если к атому серы присоединена алкильная группа без заместителей (вещество 12) или арильная группа (вещество 19), то обратимость налицо. Видимо, фиксация алкилсульйид-ной иж диалкилсульфониевой группы (но не арилсульфидной) на анионном пункте активного центра энзима благоприятствует продуктивной сорбции, т. е. образованию фермент-ингибиторного комплекса, превращающегося в фосфорилированный фермент. К тому же, у сульфидных и сульфониевых производных константы необратимого ингибирования фермента значительно выше, чем у алкильных (см. выше).

Наибольший эффект обратимого ингибирования в ряду простых &—алкильных производных показывают вещества с двумя бутоксии гексокси — группа!®у атома фосфора 14 и 15). Они хорошо сорбируются, благодаря гидрофобным взаимодействиям, что способствует образованию с ферментом как «непродуктивного» комплекса, так и «продуктивного» комплекса. Благодаря тому, что объемистые гидрофобные группы у них связаны с атомом фосфора не непосредственно, а через кислородный атом (т.е. «отодвинут» от атома фосфора), гидрофобная сорбция не оказывает стерических препятствий акту фосфорилирования. Вещество с двумя фенильными 0 $ 13), в силу сте-рической жесткости, сорбируется, вообще, хуже, причем и «непродуктивно» и «продуктивно» .

В ряду Б-алкилмеркаптоалкильных производных этокси-метиль-ные и этокси-фенильные (по фосфору) производные 1−4) вовсе не показывают эффект обратимости. У этокси-бензильных веществ (йй 5 и 6) обратимость есть, и по бутирилхолинэстеразе хорошо выражена, но только у «незаряженных» сульфидных производных. Оние-вые производные ингибируют оба фермента только необратимо. Эти ве.