Строение липополисахаридов как основа классификации фитопатогенных бактерий Pseudomonas. 
Syringae

Фитопатогенные бактерии Pseudomonas syringae и родственные фитопатогенные бактерии вызывают заболевания большинства культивируемых человеком и многих диких растений. Таксономическое положение этих микроорганизмов дискутируется в течение последних сорока лет и до сих пор не является окончательно установленным. В зависимости от способности поражать тот или иной вид растений в группе P. syringae выделяют 56 патоваров. Недавно на основании результатов риботипирования и ДНК-ДНК гибридизации типовых штаммов каждого патовара в этой группе бактерий выявлено девять геномотипов. Однако, для большинства штаммов не обнаружено каких-либо фенотипических или биохимических признаков, на основании которых их можно было бы отнести к тому или иному патовару или геномотипу. Были предприняты попытки классифицировать штаммы на основе иммуноспецифичности, но до настоящего времени не создано единой классификационной схемы P. syringae, которая стала бы общепринятой.

В связи с этим актуальной задачей является поиск новых, в частности хемотипических, признаков для отнесения штаммов к патоварам и геномотипам и для создания универсальной классификационной схемы P. syringae. Одним из таких признаков может служить структура липополисахарида (ЛПС) — одного из основных компонентов внешней мембраны клеточной оболочки. ЛПС представляет собой уникальный биополимер грам-отрицательных бактерий, который, располагаясь непосредственно на поверхности клетки, играет важную роль в процессах взаимодействия бактерии с окружающей средой, другими микроорганизмами, бактериофагами и организмом хозяина. Исследования ЛПС микробных патогенов человека и животных ведутся на протяжении многих десятилетий, а в последние годы все больший интерес привлекают ЛПС фитопатогенных бактерий.

Биосинтез ЛПС включает каскад генетически строго детерминированных событий, а именно синтез мономеров, сборку олигомеров, полимеризацию и транспорт через мембрану. В связи с этим любым изменениям в структуре ЛПС, таким как включение или потеря моносахаридного компонента, изменение конфигурации или положения гликозидной связи, должны соотвествовать трансформации в генах, кодирующих ферменты биосинтеза ЛПС. Таким образом, хемотип ЛПС и определяемый им серотип бактерии являются достаточно консервативными фенотипическими характеристиками, которые могут иметь важное таксономическое значение, в том числе для бактерий P. syringae.

В Лаборатории химии углеводов ИОХ РАН проводится систематическое химическое исследование ЛПС P. syringae, главным направлением которого является установление состава и первичной структуры О-специфических полисахаридов (ОПС) -полимерных цепей ЛПС, определяющих специфичность взаимодействия бактерии с фагами и иммунной системой. Основной целью этого исследования является выявление взаимосвязи между строением ЛПС и иммуноспецифичностью штаммов P. syringae с одной стороны и их отнесением к различным геномотипам и патоварам с другой стороны. Эти данные являются молекулярной основой для классификации и идентификации бактерий P. syringae и способствуют лучшему пониманию биохимических и генетических механизмов диверсификации поверхностных структур бактериальной клетки. Они могут использоваться также для характеристики моноклональных антител, имеющих потенциальное диагностическое значение.

Результатом настоящей работы, являющейся частью общего исследования, стало определение строения 13 новых ОПС, выделенных из штаммов восьми различных патоваров P. syringae. Таким образом, оказались установленными структуры ОПС всех известных в настоящее время серологически различимых штаммов этого вида бактерий. В ходе работы выявлены уникальные типы структурной гетерогенности полисахаридов, ранее не обнаруженные у других видов микроорганизмов, и продемонстрирована блочная структура ряда ОПС, построенных из различных повторяющихся звеньев. Кроме того, в работе впервые исследовано строение более консервативных по структуре частей ЛПС P. syringae — олигосахарида кора и липида, А — и выявлено как сходство с ЛПС других псевдомонад, так и специфические особенности ЛПС P. syringae.

Диссертация включает «Литературный обзор», в котором дана характеристика бактерий P. syringae и приведены данные о круге растений, поражаемых различными патоварами. Другой раздел обзора посвящен описанию строения липополисахаридов изученных к настоящему времени фитопатогенных бактерий. В разделе «Результаты» описана стратегия исследования строения ОПС P. syringae, включая особенности применения химических методов и спектроскопии ЯМР при анализе ОПС различных штаммов. Описаны также локализация О-метильных групп в ОПС и структурный анализ олигосахарида кора и липида, А штамма P. syringae pv. phaseolicola. В разделе «Обсуждение результатов» проведен сравнительный анализ структур ОПС и предложена классификация штаммов P. syringae на основе этих данных в сочетании с серологическими данными, полученными с помощью моноклональных антител. Обсуждается также корреляция между строением ОПС и иммуноспецифичностью штаммов P. syringae, а также их специфичностью к растению-хозяину и геномотипом. В экспериментальной части описано выделение ЛПС и его компонентов и приведены методики их структурного анализа.

Работа была поддержана грантами РФФИ 02−04−48 721, ИНТАС-Украина 95−0142 и ИНТАС YS-00−12. Часть работы по изучению кора и липида, А была проведена в Центре медицины и биологических наук Исследовательского центра Борстеля (Борстель, Германия) при участии У. Цэрингера, Б. Линднера и Г. Молля. Результаты работы опубликованы в семи статьях [1−7] и шести тезисах докладов [8−13] и были представлены на X и XI Европейских симпозиумах по углеводам (Голвей, Ирландия, 1999 г.- Лиссабон, Португалия, 2001 г.), Международном симпозиуме по современным проблемам микробиологической биохимии и биотехнологии (Пущино, Московская обл., 2000 г.), XX Международном симпозиуме по углеводам (Гамбург, Германия, 2000 г.) и I Германо-польско-российской конференции по бактериальным углеводам (Борстель, Германия, 2000 г.).

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю д.х.н. Юрию Александровичу Книрелю за постановку задачи, определение основных направлений работы, помощь при интерпретации результатов и подготовке статей для печати. Автор благодарит д.х.н. Александра Степановича Шашкова и Георгия Валерьевича Затонского за съемку и помощь в интерпретации спектров ЯМР, Анну Николаевну Кондакову за съемку масс-спектров с электрораспылением, к.х.н. Нину Алексеевну Кочарову за передачу своего опыта проведения химических экспериментов, д.б.н. Галину Михайловну Здоровенко и к.б.н. Владимира Владимировича Овода за предоставление бактериальной массы, проведение серологических исследований и обсуждение биологических аспектов работы. Автор искренне признателен руководителям Лаборатории химии углеводов Николаю Константиновичу Кочеткову и Владимиру Николаевичу Шибаеву за постоянный интерес к работе, а также коллективу Лаборатории химии углеводов за товарищескую поддержку.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Характеристика и вопросы классификации фитопатогенных бактерий Pseudomonas syringae.

К фитопатогенам относится большая группа грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, входящих в состав различных семейств и родов. Из грам-отрицательных бактерий к ним относятся представители семейств Enterobacteriaceae (родов Enterobacter, Erwinia, Serratia, Pantoea, Samsonia) — Pseudomonodaceae (родов Pseudomonas, Xanthomonas, Burkholderia, Ralstonia, Rhizobacter, Rhizomonas, Xylella) — Acetobacteriaceae (родов Acetobacter, Gluconobacter) — Rhizobiaceae (рода Agrobacterium) и Comamonadaceae (рода Acidovorax) [14, 15]. Систематика многих фитопатогенных бактерий является предметом постоянных дискуссий и частых пересмотров. Например, вид Pseudomonas solanacearum был недавно перенесен из рода Pseudomonas сначала в род Burkholderia и затем в род Ralstonia [16, 17].

Род Pseudomonas семейства Pseudomonadaceae грам-отрицательных бактерий объединяет микроорганизмы, занимающие в природе различные экологические ниши. В него входят фитопатогенные бактерии P. syringae, способствующие росту растений ризобактерии P. putida, условно-патогенные для человека бактерии P. aeruginosa, сапрофитный вид P. fluorescens и ряд других видов. Одним из общих признаков, на основании которых они были отнесены к роду Pseudomonas, является их морфология: псевдомонады представляют собой прямые или слегка изогнутые палочки диаметром 0,7−1,2 мкм и длиной 1,5 мкм, подвижные благодаря наличию нескольких полярных флагел. Как и другие представители семейства Pseudomonadaceae, они являются аэробами со строгим использованием кислорода как конечного акцептора электронов.

Бактерии вида P. syringae являются причиной заболеваний всех культивируемых человеком растений, а также дикорастущих растений. Среди симптомов, которые они вызывают, различают опухолевые новообразования, гниение, прекращение роста и гибель части растения без загнивания, хлороз, некроз (рис. 2.1). Эти симптомы проявляются в результате нарушения нормального метаболизма растительных клеток, вызываемого некоторыми вещества, выделяемыми бактериями, такими как ферменты, способные атаковать компоненты растительных тканей, токсины и фитогормоны.

Штаммы P. syringae обычно изолируют из пораженных тканей растений. Продолжительная ассоциация с растением-хозяином важна для их выживания, однако она не обязательно сопровождается повреждением растения, так как микроорганизм может выживать и в эпифитной форме. Оптимальная температура для роста.

Рис. 2.1. Примеры растений, пораженных бактериями P. syringae. фитопатогенных бактерий составляет 25−30°, и обычно они неспособны выживать в организм теплокровных животных и человека. Типовым штаммом P. syringae является штамм АТСС 19 310 (PDDCC 3023, NCPPB 281), который был выделен из сирени (Syringa vulgaris, семейство Oleaceae), давшей название всему виду.

В зависимости от способности поражать тот или иной вид (или виды) растений штаммы P. syringae подразделяют на 56 патоваров (табл. 2.1) [14].

Таблица 2.1. Основные растения, поражаемые различными патоварами P. syringae.

Патовар Растение Патовар Растение aceris клен maculicola Капуста actinidiae актинидия mellea Табак aesculi каштан mori (morihuszi) Шелковица amygdali миндаль, персидская сирень, фикус meliae персидская сирень, фикус antirrhini норичниковые morsprunorum слива, вишня apii сельдерей myricae восковник aptata свекла oryzae рис atrofaciens пшеница и др. злаки panici просо atropurpurea пырей, костры papulans яблоня avellanae лещина passiflorae пассифлора berberidis барбарис persicae персик cannabina конопля, фасоль, вика phaseolicola фасоль ciccaronei цератония pisi горох coriandricola кориандр porri лук-порей coronafaciens костры, овес, пырей primulae примула delphinii дельфиниум ribicola смородина dendropanacis тыквенные savastanoi оливковые деревья, маслины, олеандр dysoxyli дизоксилюм sesami кунжут eriobotryae локва striafaciens овес, ячмень ficuserectae фикус syringae вишня, перец, кукуруза, слива, лук репчатый garcae кофе tabaci табак glycinea соя tagetis бархатцы helianthi подсолнух theae чай hold сорго tomato помидор japonica рожь, ячмень, пшеница, рис tremae соя lachrimans огурец ulmi вяз lapsa кукуруза, сахарный тростник viburni калина lupini люпин zizaniae рис.

На основании данных риботипирования и ДНК-ДНК гибридизации типовых штаммов каждого патовара было выделено девять геномотипов P. syringae и родственных фитопатогенных псевдомонад (таблица 2.2) [18]. Однако, большинство геномотипов, также как и большинство патоваров P. syringae, невозможно определить на основании каких-либо фенотипических признаков или рутинных физиологических тестов, что снижает ценность такого рода классификации.

Таблица 2.2. Распределение патоваров P. syringae и родственных псевдомонад в геномотипы.

Геномотип Патовары и виды.

1 pvs. syringae, aptata, lapsa, papulans, pisi, atrofaciens, aceris, panici, dysoxyli, japonica.

2 pvs. phaseolicola, ulmi, mori, lachrymans, sesami, tabaci, morsprunorum, glycinea, ciccaronei, eriobotryae, mellea, aesculi, hibisci, myricae, photiniae, dendropanacis и P. savastanoi = P. ficuserectae = P. meliae = P. amygdali.

3 pvs. tomato, persicae, antirrhini, maculicola, viburni, berberidis, apii, delphinii, passiflorae, philadelphi, ribicola, primulae.

4 pvs. porri, garcae, striafaciens, atropurpurea, oryzae, zizaniae и P. coronafaciens.

5 pv. tremae.

6 P. viridiflava.

7 pvs. tagetis, helianthi.

8 pv. theae и P. avellanae.

9 pv. cannabina.

Начиная с 70-х годов, делаются попытки классифицировать бактерии P. syringae на основе иммуноспецифичности штаммов [19, 20]. JI. Т. Пастушенко и И. Д. Симонович протестировали более 300 штаммов фитопатогенных бактерий с помощью кроличьих антисывороток, полученных против поверхностных термостабильных О-антигенов, а также перекрестно абсорбированных антисывороток [20]. В результате исследованные штаммы P. syringae были разделены на девять О-серогрупп (таблица 2.3.).

Таблица 2.3. Серологическая классификация некоторых патоваров P. syringae по Пастушенко и Симонович [20].

Серогруппа Патовары Серогруппа Патовары.

I syringae, tomato, maculicola VI phaseolicola, atrofaciens, hold.

II atrofaciens, morsprunorum, cerasi, hold VII tabaci.

III morsprunorum, syringae VIII tabaci.

IV atrofaciens, hold, pisi IX lachrimans.

V atrofaciens.

Позднее, Saunier и соавт. на основании данных по двойной диффузии в агаре также с помощью поликлональных антисывороток распределили 300 штаммов различных патоваров P. syringae в 23 серогруппы (таблица 2.4) [21]. Сопоставить серогруппы этой классификационной схемы, имеющие буквенные обозначения, с серогруппами схемы Пастушенко и Симонович, обозначенными римскими цифрами, затруднительно, так как при создании этих двух классификаций использовались различные штаммы P. syringae. К настоящему моменту ни одна из предложенных классификационных схем не стала общепринятой.

Строение О-антигенов P. syringae может рассматриваться как универсальная химическая основа для единой классификации штаммов и выяснения соответствия между патоварами, геномотипами и серогруппами. Действительно, различия в строении О-антигенов предполагают различия в генах, контролирующих их биосинтез (геномотип), и тонкая структура О-антигенов определяет иммуноспецифичность бактериальной клетки (серогруппа), а возможно также специфичность узнавания и взаимодействия с растением-хозяином (патовар).

Таблица 2.4. Серологическая классификация P. syringae по Saunier с соавт. [21].

Серогруппа Патовары Серогруппа Патовары.

РИА phaseolicola, tabaci SYR2 atrofaciens, atropurpurea, coronafaciens.

МОР1 morsprunorum APTIS aptata, glycinea, pisi.

МОР2 morsprunorum, striafaciens TAB tabaci.

МОРЗ morsprunorum VIR1 P. viridiflava.

HEL1 helianthi VIR2 syringae, P. viridiflava.

HEL2 glycinea, helianthi VIR3 P. viridiflava.

SYR1 atrofaciens, striafaciens SYR3 syringae.

PERVASTOM1 persicae, savastanoi, atropurpurea, tomato SYR4 syringae.

PERVASTOM2 coronafaciens, tomato SYR5 syringae.

DEL striafaciens HUS morihuszi.

POR porri LAC lachrimans.

RIB coronafaciens, helianthi, pisi, tomato.

В конце 80-х и начале 90-х годов прошлого столетия был проведен структурный анализ О-антигенов ряда серогрупп классификационной схемы Пастушенко и Симонович, и для большинства из них было обнаружено хорошее соответствие между строением О-антигена и иммуноспецифичностью [22]. В настоящее время структурное исследование.

О-антигенов P. syringae завершено, в том числе с участием автора настоящей работы, и его результаты обсуждаются в главе 4 диссертации.

С конца 90-х годов проводится новое комплексное иммунохимическое исследование, включающее классификацию штаммов P. syringae с использованием широкого набора мышиных моноклональных антител, специфичных к О-антигенам. Параллельно изучается строение О-антигенов, отличающихся по картине связывания с моноклональными антителами в иммуноферментном анализе и Вестерн-блоттинге. Химическая часть этого исследования составляет основное содержание настоящей диссертационной работы.

2.2.5.

Заключение

.

Липополисахариды фитопатогенных бактерий имеют типичную для грамотрицательных микроорганизмов общую структуру, включая липид А, олигосахаридный.

29 кор и полисахаридную цепь. К настоящему времени липид, А и кор в структурном отношении изучены лишь для небольшого числа фитопатогенных бактерий, однако имеющиеся данные соответствуют существующим представлениям. Так, наблюдается значительное сходство структур липида, А у различных представителей одного семейства независимо от того, какую экологическую нишу они занимают. Строение олигосахарида кора является менее консервативной характеристикой и демонстрирует разнообразие уже между представителями различных видов одного рода.

Как и для важных в медицинском отношении бактерий, для фитопатогенных микроорганизмов характерно широкое разнообразие состава и строения ОПС. Ввиду этого данная характеристика обычно не рассматривается в качестве хемотаксономического критерия. В то же время у изученных фитопатогенных бактерий {Pseudomonas syringae, Xanthomonas campestris, Ralstonia solanacearum) наблюдается заметное сходство моносахаридного состава и топологии повторяющегося звена ОПС у всех штаммов или больших групп штаммов одного вида. Более того, некоторые моносахариды, такие как D-и L-рамноза, D-фукоза, L-ксилоза, часто встречаются в составе ОПС различных видов фитопатогенов.

Еще одной особенностью многих ОПС фитопатогенных бактерий является структурная гетерогенность, которая встречается довольно редко у микроорганизмов, не являющихся патогенными для растений. В некоторой степени эта гетерогенность затрудняет серологическую классификацию, однако, несмотря на это, строение ОПС в целом коррелирует с иммуноспецифичностью бактерий, выявляемой серологически. Это позволяет создать на основе иммунохимических характеристик различных штаммов классификационные схемы, необходимые для идентификации и мониторинга за распространением фитопатогенных бактерий.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Получение и общие подходы к структурному анализу О-полисахаридов на основе L-рамнанов.

В этой группе исследовались О-полисахариды из ЛПС И штаммов P. syringae, относящиеся к семи различным патоварам. Изученные микроорганизмы и их специфичность к растениям-хозяевам приведены в таблица 3.1.