Актуальность.
Широкое распространение иммунопатологических состояний, в частности, иммунодефицитов среди населения ставит исследователей перед необходимостью разработки специальной методологии раннего выявления заболеваний иммунной системы организма с целью их профилактики и своевременной коррекции болезни (Ковальчук Л.В., Чередеев А. Н., 1990; Петров Р. В. и др., 1992).
По данным органов здравоохранения, выявлена взаимосвязь уров ней заболеваемости населения с экологической ситуацией в регионах, особое внимание обращается на возникновение вторичных имму-нодефицитных состояний в условиях длительного контакта с пестицидами. (Материалы МЗ СССР, подготовленные для Комитета Верховного Совета СССР по вопросам экологии и рационального использования природных ресурсов, по мерам защиты населения СССР от неблагоприятного воздействия нитратов и пестицидов при использовании их в сельском хозяйстве, 1990 г).
За последнее десятилетие накоплены данные, свидетельствующие о том, что пестициды, загрязняющие окружающую среду, способны нарушать функциональную целостность иммунной системы (Кенигсберг Э.Я., 1981; Рузыбакиев P.M., 1986). ^————;
Возникла новая область науки — иммунотоксикология, объектом изучения которой является иммунная система как «мишень» воздействия ксенобиотиков.
Эксперты ВОЗ при формировании в 1989 г. в Лоцдоне «Международной программы сотрудничества в области иммунотоксикологии» (ICIP) в рамках «Международной программы по безопасности химических веществ» (IPC.S) признали актуальность и необходимость исследований по следующим основным направлениям: а) исследование иммунологических характеристик организма при воздействии пестицидов, включая резистентность организма хозяинаб) изучение аутоиммунных реакций организмав) поиски иммунохимических методов защиты от отравлений и иммунокоррекции состояния организма, подвергнутого воздействию ксенобиотикаг) внедрение аналитических иммунохимических методов в практику токсикологических исследований.
Возрастающий объем внедрения пестицидов в сельское хозяйство, изменение ассортимента препаратов требует определения уровней безопасного и эффективного их применения. При этом остро поднимается вопрос о критериях и методологии оценки иммунотоксично-сти пестицидов и применения принципов иммунобиотехнологии в организации массовых анализов остаточных количеств хими (c)препаратов .
Цель и задачи исследования
.
Целью наших исследований явилось исследование иммунотоксико-логических характеристик пестицидов, определение степени специфичности изменений функций иммунной системы, а также поиски путей и способов специфической защиты и иммунокоррекции организма.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
— изучение функционального состояния звеньев иммунной системы организма животных, подвергнутых воздействию пестицидов;
— разработка схемы иммунотоксикологического скрининга пестицидов;
— количественная оценка безопасных уровней воздействия пестицидов на иммунную систему организма;
— разработка имщунохимических методов определения пестицидов.
Научная новизна.
1. Экспериментально изучено влияние 2,4-дихлорфеноксиуксус-ной кислоты и карбофоса на функциональные показатели иммунной системы организма. Показано, что воздействие данных пестицидов на организм животных вызывает иммунодефицитное состояние.
Исследование иммунотоксикологических свойств пестицидов позволило разработать схему скрининга, использование которой сможет исключить применение в сельском хозяйстве пестицидов, токсичных для иммунной системы организма.
Предложенная в работе математическая модель позволяет определить безопасные для функционирования иммунной системы организма уровни используемых пестицадов.
2.Впервые экспериментально доказана возможность образования аномальных антигенов пестицид-белок и антител к ним. Выделены и очищены белки печени, связывающие пестицид. Показана возможность использования искусственных антигенов пестицвд-белок для раннего доклинического выявления изменений, вызываемых пестицидами.
3. Впервые установлена возможность защиты организма от острых отравлений пестицидами ~ фрагментами антител против искусственных антигенов пестицид-белок. Экспериментально показана возможность иммунокоррекции организма, подверженного воздействию пестицидов, такими иммуностимуляторами как Т-активин, мие-лопид, спленин, левамизол.
4. Разработаны твердофазные иммуноферментные методы определения пестицидов, в частности 2,4-Д и производных карбофоса, в биологических жидкостях.
Приоритетность разработок подтвервдена авторскими свидетельствами на изобретения:
1 345 399 «Способ иммунизации кроликов против сибирской язвы» от 15.06.87 г.
1 356 288 «Способ иммунизации крупного рогатого скота против сибирской язвы» от 01.08.87 г.
1 501 724 «Способ иммобилизации гаптенов» от 15.04.89 г.
1 545 350 «Способ защиты организма от отравления гербицидом» от 22.09.89 г.
1 670 608'" Способ получения антигенов карбофоса" от 15.04.91 г.
Практическая значимость работы.
Разработанные подходы и методы, а также результаты исследований по иммунотокеикологическому скринингу пестицидов использованы для подготовки и издания методического руководства «Иммуноток синологическая оценка пестицидов», Улан-Удэ, 1993, 103 е., утвер жденного секцией «Экспериментальная патология химической этиологии» Проблемной комиссии АМН СССР «Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс» .
По результатам работы подготовлены и изданы методические реко мендации и. руководства:
— «Использование искусственного антигена карбофос-белок для раннего выявления воздействия карбофоса на иммунологическую реак тивность организма», Улан-Удэ, 1984 г., 15 е., утвержденные МЗ РСШСР;
— «йммуноферментный метод определения производных карбофоса», Улан-Удэ, 1989 г., 13 с., утвержденный Ученым Советом Института биохимии им. А. Н. Баха АН СССР.
Разработанный иммуноферментный анализ 2,4-Д позволяет определить не только свободную, но и связанную форму препарата, которая, по нашим данным, обладает определенным токсическим эффектом.
Иммуноферментный метод определения производных карбофоса позволяет выявить основные метаболиты карбофоса в организме тепло-кровных-моно-, дималатионовые кислоты.
Предлагаемые методы анализа существенно дополняют используемые в настоящее время методы определения пестицидов и способству ют получению новой информации о биологической активности пестицидов.
— «Практикум по иммунологическим методам исследования». Улан-Удэ, 1987 г., 80 с.
— «Иммунотоксикологическая оценка пестицадов». Методическое руководство. Улан-Удэ, 1993 г., 103 с. Руководство утверждено секцией «Экспериментальная патология химической этиологии Проблемной комиссии АМН СССР» Научные основы гигиены и токсикологии пестицидов,'полимеров и пластических масс" .
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Анализ иммунотоксикологических свойств пестицидов.
— установлено влияние пестицидов на функционирование иммунной системы организма;
— разработана система скрининга токсичных для иммунной системы организма пестицидов;
— показана возможность использования иммунологических критериев для расчета безопасных уровней пестицидов.
2. Продемонстрирована способность пестицидов связываться с белками органов и тканей и изменять их антигенную структуру. Изменение антигенной структуры иццуцирует процесс антителообразо-вания к аномальным антигенам.
3. Предложен новый метод иммунохимической защиты организма от острых отравлений пестицидами, отличающийся высокой специфичностью. Доказана возможность коррекции иммунодефицитного состояния, вызванного пестицидами.
4. Разработан иммунофермецтный метод определения пестицидов: и их производных, в частности, связанные и свободные формы 2,4-Д и основные метаболиты карбофоса в организме теплокровных.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Иммунотоксикологическая оценка пестицидов.
Открытие пестицидов является выдающимся достижением современной науки. Их применение позволяет предотвращать потери 20−30% урожая от вредителей, болезней и сорняков на суммы, выражаемые миллиардами рублей в год. Комиссия Министерства здравоохранения, просвещения и социального обеспечения США (7?2гаА Е., 1969) конста тировала, что «потребность в применении пестицидов и других хими катов для борьбы с вредными организмами будет возрастать в течение всего обозримого времени». Однако эта фактическая необходимость не дает права на использование пестицидов в бесконечно возрастающем масштабе, т.к. неизменный объем биосферы не способен выдерживать бесконечно ежегодное 10%-ное увеличение применения пестицидов. Загрязнение окружающей среды, рост за-болеваний животных, птиц, рыб, полезных насекомых и человека служит веским доказательством необходимости изменения стратегии и тактики борьбы с сорняками и паразитами.
Необходимо сделать упор на интегрированную борьбу с вредными организмами, включающую разные подходы, создание, отбор и исполь зование пестицидов более специфичных и, следовательно, менее ток сичных для других, не вредящих видов. Актуальными остаются вопросы изучения метаболизма и естественного распада пестицидов, их перемещения в окружающей среде и влияния на организм человека и животных.
Важнейшим принципом нормального функционирования организма является поддержание постоянства внутренней среды, которое дости гается деятельностью ряда систем, находящихся между собой в слож ных регуляторных взаимоотношениях. К числу таких систем относится иммунная система организма.
Интерес к изучению иммунной системы организма как «мишени» воздействия химических веществ, условий проявления их модифицирующего действия на иммуногенез значительно возрос в последние годы. Результаты современных исследований показали, что возрастающее число химических веществ действительно оказывает влияние на иммунную систему. Наибольшее внимание уделялось тем соединениям из окружающей среды, которые ослабляли иммунологическую реактивность и повышали восприимчивость к инфекциименьше данных относительно тех веществ, которые повышали иммунную активность.
1.1.1. Влияние пестицидов на иммунную систему организма.
Иммунвдшгическая реакция является одним из чувствительных индикаторов состояния разнообразных физиологических функций организма и довольно просто определяется (в количественном отношении) рядом методов.
Отсюда всё более и более растущий интерес исследователей к оценке влияния пестицидов на целый ряд самых разнообразных аспектов иммунологических реакций (ало/егШ3. 1980) Сюда можно отнести влияние на выработку антител, реакцию кожных покровов на специфические иммуногены, уровень иммуноглобулинов, восприимчивость к различным инфекциям, уровень комплемента, количество лимфоидных клеток, а также влияние, оказываемое на структуры лим-фоидных органов, которое можно установить гистологическими исследованиями.
3^,(1980) провели обширное исследование влияния самых разнообразных пестицидов на гуморальные и клеточные иммунологические реакции, которые возникают в ответ на четко установленные антигены. Выли проанализированы следующие препараты: диносеб, паратион, пентахлоронйтробензол, ресметрин, пиперонилбутоксид, пиретрины, арохлор 1260. Полученные экспериментальные данные показали, что однократная доза <250 пестицида, введенного перорально, оказывает мощное, длительное влияние на иммунологическую реакцию. Наблюдаемый эффект может оказаться или стимуляцией, или угнетением, а может быть непосредственно направлен отдельно на клеточные или на гуморальные иммунологические реакции в зависимости от химической природы пестицвда и его свойств. Изучаемые клеточные и гуморальные показатели иммунологической реакции организма подавлялись под действием диносеба, паратиона, в то время как ресметрин вызывал раннюю, а в некоторых случаях даже весьма длительную стимуляцию клеточной иммунной реакции. Действие последнего из указанных препаратов вызывает значительный интерес и может дать в руки исследователей важный ключ, который позволит разработать действенные стимуляторы клеточных иммунологических реакций. А угнетение иммунных реакций, которое вызывали паратион и диносеб, приводит к тому, что организм становится менее устойчивым к различным инфекционным заболеваниям.
В результате проведенных исследований авторы приходят к выводу о необходимости изучения влияния пестицидов на иммунологические реакцииво-вторых, исследования должны проводиться не только на организменном уровне, но и на клеточном и молекулярном уровне активации Т-, В-клеток и макрофагов.
Серию экспериментов по влиянию разных доз лестицвдов: дихлор-фоса, линдана, малатиона, дециса на показатели клеточного и гуморального иммунитета кроликов после вакцинации ш провели венгерские ученые ^/^?,(1978, 1980, 1983). В работе были использованы дозы 1/10, 1/20,.
Полученные авторами результаты свидетельствуют о дозозависимом подавлении показателей клеточного и гуморального иммунитета при введении дихлорфоса, линдана, дециса. Малатион значительно инги-бировал только показатели клеточного иммунитета.
О влияний хлорсодержащего углеводородного инсектицида-токса-фена на функции макрофагов, реакцию гиперчувствительности замедленного действия и антителообразования у мышей-самок и их потомства сообщили ?2.3. Ов? е/ъ (1983). Воздействие токсафена г/г zde. ro и через лактацию приводило к заметному снижению фагоцитарной функции макрофагов у мышей.: Образование гуморальных антител уменьшалось у взрослых животных, получавших токсафен в дозах 100 или 200 частей на миллион, и у потомства мьшей из группы, получавшей препарат, в дозе 100 частей на миллион га. т?? его и с материнским молоком. Клеточный иммунитет менялся только у потомства мышей, получавших токсафен в дозе 100 частей на миллион.
По мнению авторов как оральное, так и трансплацентарно-лакта-ционное воздействие токсафена приводило к иммуносупрессии. Наибольший эффект отмечен у потомства, которое получало токсафен -¡-л ти±&го и с материнским молоком. Иммуносупрессия в большей степени затрагивала макрофаги, вслед за ними гуморальный иммунитет, показатели же клеточного иммунитета нарушались в меньшей степени.
Работами рдда других авторов также показано, что воздействие пестицидов часто оказывает большее токсическое действие на потомство, чем на взрослых животных (Семенчева Э.М. и др., 1979; Горбачевская Е.§-., 1980; аее&п <2.?. е? а.б.
Явление иммуносупрессии при воздействии диметоата, этефона, трихлорфона, мета иидофоса в дозе ½ Д: э () на крысах и мышах наблюдали В. &е/е/ъ?а.сА е£ ?2^,(1983).
Полученные данные (действие на лимфоидные органы, ход временной зависимости и сходство реакций на различные соединения) указывают, по мнению авторов на то, что иммуносупрессия обусловлена освобождением глюкокортикоидов из коры надпочечников, хотя авторы не исключают воздействия на иммунную систему через другие механизмы. б.^-Сашва 1982,1983) изучали связь холинергической стимуляции и иммуносупрессии, вызванной введением паратиона, ма-латиона и ДДВ1. Результаты данного исследования показали взаимосвязь между холинергической стимуляцией и, иммуносупрессией, индуцированной фосфорорганическими пестицидами. Эта связь может быть опосредована через прямое действие ацетилхолина на специфические компоненты иммунной системы. Это предположение подтверж дает тот факт, что на лимфоцитах и макрофагах были обнаружены холинергические рецепторы (^?сАгпи/г. & О., ?2гаа?о/1 & ¿-Я ЪГ., 1979; Ш&ееуЖ. 1981).
Альтернативой является гипотеза о том, что наблюдавшаяся иммуносупрессия может быть опосредована глюкокортикоидами, выделявшимися в ответ на токсикохимический стресс. В поддержку этой гипотезы была продемонстрирована увеличенная концентрация плазменных кортикостероидов у крыс после введения сублетальных доз паратиона ТПжгр/гу, 1970). Однако авторы не исключают возможности прямого действия препаратов или их метаболитов на иммунную систему. Дальнейшее понимание иммунотокеикологиче-ского действия пестицидов требует тщательных исследований, которые должны определить истинное значение стрессовых и нестрессовых эффектов в иммуносупрессии, вызванной фосфорорганическими пестицидами.
Интересные данные получены Т. с?71ое?^ег} (1990) с. препаратом ме-копроп, являющимся производным хлорфеноксипропионовой кислоты. Было показано, что мекопроп способствует сильной атрофии коры тимуса, уменьшению белой пульпы селезенки, вызывает сдвиги в дифференциальной картине крови, подавляет функциональные показатели клеточного и гуморального иммунитета у животных. Результаты предшествующих исследований авторов указывали на то, что введение мекопропа вызывало повышенную секрецию глюкокортикоидов корой надпочечников. Удаление надпочечников устраняло возможность повышения глюкокортикоидов в крови при стресс-реакциях, одновременно с этим в значительной мере устранялись или снижались иммунотоксикологические свойства мекопропа.
Здесь, по-видимому, следует отметить, что в исследуемых диапазонах доз мекопроп обладает как иммунотоксикологичееким, так и токсическим действием на другие органы и системы, т. е. влияние на иммунную систему, возможно, не является первичным.
По данным Т. <уСсзь и ^тиеу-л^'иг^Ь/^ 1980) иммунотоксикологи-ческое действие диизопропил-фосфофлуоридата (Д§-§-) на морских свинок и свиней колебалось в зависимости от количества введений —, препарата. Однократное введение препарата приводило к значительному повышению комплементарной активности, титра антител и бляш-кообразующих клеток. Многократные введения препарата снижали изучаемые параметры.
Полученные результаты показывают, что Д§-§может стимулировать некоторые иммунологические реакции или подавлять их в зависимости от введенной дозы.
Это показано и^№в/^'г^^/,(1970а, в), который обнаружил повышение комплементарной активности, уровня гемомуина и общего иммунного фона после острой интоксикации кроликов изопропиловым эфиром метил-флуорофосфорной кислоты. Сходные результаты получили и оГ (1973,1974) на морских свинках, получавших хлорофос и паратион, еТ^^й:^^4^' ДО78) У КУР" подверг.
— 17 нутых воздействию хлорфенилвинилфоеа. а£., (1987) исследовали действие алдикарба, который относится к карбаматным инсектицидам и нематоцидам, на некоторые показателе иммунной системы мышей. Алдикарб вводили животным с питьевой водой в дозе 1,10,100,100 частей на биллион в течение 14 и 34 дней, определяли количество А0К и титры антител, хемилюминесценцию перитонеальных макрофагов и периферической крови. Полученные результаты свидетельствуют. о том, что алдикарб обладает иммунотоксичностью в чрезвычайно низких дозах. Наиболее интересный факт, полученный в данной работе,-это обратная зависимость эффекта от дозы, выявленная, как после 14, так и после 34 дней воздействия алдикарба. Этот эффект авторы наблюдали во всех четырех опытах, в которых использовали две линии мышей из разных источников и алдикарб из двух источников. Этот факт вступает в противоречие с классической концепцией, согласно которой с увеличением дозы токсичность увеличивается. Хотя в литературе известны аналогичные примеры (Ж., 1977), однако выяснение механизма этого эффекта, по-видимому, еще предстоит.
Среди публикаций, отражающих влияние пестицидов на иммунную систему, обращают внимание работы, которые указывают на роль макрофагов при воздействии пестицидов на организм.
Ранее отмечалось о нарушении фагоцитарной функции и «?с-рецеп-торной активности альвеолярных макрофагов кошек (Зъс/еИ Ж аС., 1979), об ингибиции розеткообразующей способности альвеолярных макрофагов крыс, подвергнутых воздействию гексахлорбен-зола. М.З., &оггг?ег., 1977). По мнению авторов действие инсектицида на макрофаги может быть обусловлено гидрофобно-стью молекулы, способностью вызывать нарушения в липидных областях мембран и, таким образом, изменять целостность мембран и внутриклеточных структур.
О снижении количества и функциональной активности макрофагов, подвергнутых воздействию разных концентраций. линдана та vitro указывают et (1978). Критической концентрацией, вызывающей достоверные изменения функций макрофагов, является доза, равная 10″ %. По мнению Q'.3curh7&.S).
Однако не всегда исследования i/ъ vitro коррелируют с данными, полученными гл. -vtw. Так, В. Ю. Ахувдов и др.(1981) сообщили о значительном снижении миграционной активности макрофагов морских свинок при введении севина (15 мг/кг) в течение трех месяцев пе-рорально. А внесение в инкубационную среду севина не влияло на миграционную активность макрофагов, полученных от интактных животных.
Приведенные выше данные, а также ряд других работ (Олефир А.И. и др., 1977; (2с/о/пбвб?., ?teAota^ty, 1980) указывают на высокую чувствительность макрофагов к воздействию пестицидов.
На необходимость проведения экспериментов ш шгю г/ ъ/l vitro при оценке иммунотоксичности пестицидов указывают работы ^o/msoa,(1987). Авторами было показано, что инсектицид хлордан не вызывал значительных изменений показателей гуморальных и клеточ-но-опосредованных иммунных реакций взрослых мышей {^оAnson. -Л'. Ш? tat., 1986). Однако добавление хлордана к системам анализа клеточной и гуморальной иммунной реакции in vitro значительно снижало иммунную активность. Результаты, полученные авторами, свидетельствуют о том, что имм^шосупрессивный эффект не зависит от цитотоксичности при низких концентрациях хлордана, что указывает на возможность влияния последнего на иммунную активность гл. rivo. Изучение причин неоднократного действия хлордана показало, что метаболиты хлордана проявляли собственную иммунотоксич-ность в системе гл. z>itr-o. По мнению авторов значительное подавление иммунных реакций ш vitro связано с антипролиферативным действием хлордана и его метаболитов. Отсутствие иммунотоксич-ности последнего в системе ш тлгю связано со способностью хлордана и его метаболитов связываться с компонентами сыворотки крови, что ведет к’снижению иммуносупрессивной активности данных соединений.
Особый интерес представляют исследования toa^e. et (1979,1982). Авторы, определяя иммунологические показатели у мьшей Ва^/е,, обработанных дильдрином или гексахлорбензолом и зараженных ($лс&кпгап1а. или ShzgrriDcLiz/m. бегдШ^ установили подавление реакции на эритроциты барана, ингибицию реакции на поливи-нилпиролидон, уменьшение количества Т-, В-клеток и макрофагов, подавление реакции на фитогемагглютинин (#ГА).
Обследование причин изменения иммунологического статуса мышей, в частности Т-клеток селезенки, полученных от обработанных дильд рином и инфицированных ЗесЗб-та/иа. мышей с помощью метода обработки пролиффующих клеток митомицином С (для ингибирования синтеза ДНК) или обработкой антисывороткой к антигену, выявило отсутствие реакции ингибирования нормальных Т-клеток на §-ГА. Супрессорная активность Т-клеток была установлена по наличию клеток, содержащих антиген и количеству ДНК. Дальнейшее исследование по анализу изолированных клеток печени, селезенки, легких и перитонеальных макрофагов выявило, что добавление’макрофагов к селезеночным культурам Т-клеток вызывало супрессию 1ГАстимулированных Т-клеток. Этот фактор макрофагов, вызывающий супрессию Т-клеток, не оказывал влияния ни на интактные контрольные клетки, ни на Т-клетки от инфицированныхмышей. Однако, когда этот фактор добавляли к Т-клеткам селезенки мышей, обработанных дильдрином и зараженных^е^А/псиио., или к клеткам селезенки мышей, подвергнутых воздействию дильдрина или гекса-хлорбензола, он ингибировал их пролиферативную активность. Это. указывает на то, что фактор действует на примированные инсектицидами Т-клетки. В то же время макрофаги, полученные от животных, обработанных инсектицидами, не способны представить адекватный антиген хозяину, что указывает на состояние супрессии, даже если и вырабатывается фактор.
В этой связи интересным представляется развитие исследований по изучению продуцирования супрессорного фактора макрофагами в сочетании с продукцией интерферона, простагландинов, которые играют роль иммуномодуляторов.
Следует отметить, что супрессия функций иммунной системы, выявляемая при воздействии пестицидов на организм {6шг-деа.&, 1987 За1раг$е.С., &, 1982; <Л Ю., 1987 а, бнаблюдалась при низких дозах, не вызывающих признаков токсического эффекта, что указывает на высокую чувствительность иммунокомпетентных клеток и органов к действию ядохимикатов.
Ряд работ, выполненных разными авторами, посвящено изучению влияния пестицидов, на иммунную систему людей, подвергавшихся воздействию пестицидов через профессиональные контакты или через пищевую цепь.
По данным к.?^ег/ргсг/гогс^е^ ???7^1982) у 33-х лиц, подвергнутых профессиональному воздействию хлорорганических пестицидов, установлено глубокое угнетение функций сегментоядерных нейтрофи-лов: хемотаксиса, слипания, фагоцитоза и восстановления нитроси-него тетразолия. По мнению авторов, поражение функций нейтро-фильных гранулоцитов следует иметь в виду как пр^располагающий фактор развития инфекционных заболеваний системы дыхания при боль ших концентрациях инсектицидов в воздухе рабочей зоны.
О влиянии хлорорганических пестицидов на миграцию лейкоцитов крови сообщили <0. Зсаслук её (1978) ^ЖЖа^аг^/А, 'Ш'^^сыг^с (1979). Хлорорганичеекие пестициды — ДДТ, ДЦЕ,- ГХЦГ, меток-сихлор в концентрациях, характерных для крови человекаингиби-ровали миграцию лейкоцитов крови людей, имеющих профессиональный контакт с пестицидами. По мнению польских иммунологов ингибиция миграции лейкоцитов отражает состояние гиперчувствительности замедленного типа и, возможно, индуцирована стимуляцией лимфоцитов специфическим антигеном, комплексом антиген-антитело или конъю-гатом гаптен-носитель.
Выявлено, что у лиц, профессионально контактирующих с пестицидами, при наличии 3−6- кратного превышения их ПДК в воздухе рабочей зоны, в период сезонных работ подавлялась иммунная реакция организма. Выявленная иммуносупрессия проявлялась в статистически достоверном снижении уровня столбнячного антитоксина по сравнению с контролем (Руссу-Лупан %Л. и др., 1983). Интересно отметить, что авторы выявили сходные закономерности подавления иммунной реакции организма как в натурных исследованиях, так и в эксперименте на животных, что свидетельствует о сходстве патогенеза интоксикации пестицидами у человека и животных.
Н.Е. а£. ,(1978) описали в своей работе необычный случай гемолитической анемии. Результаты лабораторных исследований показали иммунологическую природу анемии, а в качестве имму-ногена был определен дильдрин. Болезнь перешла в состояние ремис сии лишь после удаления селезенки.
Многочисленные литературные данные свидетельствуют о разностороннем влиянии пестицидов на функционирование иммунной системы организма человека и животных. Это может быть и стимулирующее, и угнетающее действие в зависимости от химической природы пестицида, от дозы и кратности введения, вида животного и методов тестирования.
Так, &{1пгта$.9>,?еепгсиг. <771. (1980) обобщили данные о влиянии ДЦТ на продукцию антител к нескольким антигенам у семи видов животных, включая серебряного карася, кур, уток, крыс, морских свинок, кроликов и человека.
В зависимости от нескольких факторов, то есть изучаемого вида животных, дозы и режима приема ДЦТ и используемого антигена, может не наблюдаться никакого эффекта, возможно увеличение продукции ан тител, или даже первоначальное возрастание, за которым следует по давление вторичной стадии продукции антител. Очевидно также, что на результат контакта с антигеном влияла схема эксперимента, то есть величина интервала между иммунизацией и изучением эффекта, или время приема пестицида, т. е. применялся ли он до, после или одновременно с антигеном.
Иммунный ответ включает в себя работу большой сети органов и различных типов клеток, выполняющих взаимосвязанные функции. Реак ция на внешние сигналы управляется сложной регуляторной сетью высокоспециализированных клеточных популяций и субпопуляций, сложным образом связанных между собой.
Химические соединения, в частности пестициды, действуют на иммунную систему и в конечном счете на некоторые её, функции на раз.
— 23 личных уровнях «иммунологического древа» (Вчаип Д.Р. 1981). Они могут влиять на афферентное звено иммунного ответа, затрагивающее количество и функции моноцитов (макрофагов, Т-, В-клеток) на различных этапах связывания антигена, переваривания и презентации лимфоцитамони могут влиять и на центральное звено иммунного ответа.
Последнее свойство присуще соединениям, которые модифицируют синтез ДНК или модифицируют функции супрессорных, хелперных клеток и эффекторных Ти В-клеток, или же производят оба эффекта. И, наконец, они могут влиять на эфферентное звено иммунного ответа, экспрессирующую эффекторные функции иммунитета, развивающиеся в процессе прохождения центральной части ответа.
В конце концов любой иммуносупрессивный эффект, вызванный химическими соединениями, приводит к одному или более из следующих последствий: а) снижение сопротивляемости организма инфекционным заболеваниямб) изменение механизма иммунологического надзора, приводящее к увеличению числа и частоты опухолейв) развитие ги перчувствительности у восприимчивых особей и г) инициации аутоим мунных заболеваний {ЗирНх>па$ 2{., «ТУЬшъго .
— 195-ВЫВОДЫ.
1. Разработана и экспериментально апробирована двухуровневая система щумунотоконкологического скрининга пестицидов, представляющая собой комплекс методов, позволяющих поэтапно выявить наиболее чувствительное звено иммунной системы.
2. Пестициды — карбофос и 2,4-Д оказывают выраженный дозоза-висимый иммуносупрессивный эффект на показатели клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа, а также функции перитонеаль ных макрофагов.
3. Подавление функций перитонеальных макрофагов мышей, подвер женных. воздействию пестицидов, ш utvo коррелирует с данными, полученными in. vitro. Экспериментальные данные позволяют рекомендовать анализ функций макрофагов in vitro для предварительной оценки иммунотоксичности пестицидов, а также для предварительного отбора и подбора доз иммунокорригирующих средств. Однако это не исключает необходимости анализа функций иммунокомпетентных кле ток в условиях’и. vivo.
4. Функциональные нарушения иммунной системы могут быть использованы з качестве критерия вредности при оценке пороговых доз пестицидов. Предложена математическая модель, использующая иммунологические показатели для расчета пороговых доз воздействия на иммуннуюсистему организма. Экспериментальная проверка показала справедливость данного подхода.
5. Выявлены аномальные комплексы пестицид-белок в органах и тканях животных, подвергнутых воздействию пестицидов, которые вызывают индукцию антител к ним. Изучена динамика образования аномальных антигенов и антител к ним. Выделены и очищены белки печени, связывающие 2,4-Д.
6. Разработан и внедрен метод искусственных антигенов и антисывороток к ним для выявления раннего доклинического воздействия карбофоса на иммунологическую реактивность организма людей, имеющих профессиональный контакт с пестицидом.
7. Выявлен защитный, эффект (аё')^ - фрагментов, специфичных к 2,4-Д, при остром отравлении гербицидом.
8. Экспериментально установлена коррекция. Т-активином, миело-пидом, спленином, левамизолом иммунодефицитного состояния организма животных, 'подвергнутых воздействию пестицидов. Наибольшим корригирующим эффектом обладал миелопид, который восстанавливал функциональные показатели всех звеньев иммунной системы организма.
9. Разработаны твердофазные иммуноферментные методы определения 2,4-Д и производных карбофоса и антител к ним.
Интервал определяемых концентраций связанного 2,4-Д составил (15−1000) нг/мл, производных карбофоса — (0,3−150) нг/мл.
Методы апробированы при анализе препаратов в органах и тканях животных, отравленных пестицидами, для определения не требуется экстракция и очистка проб.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
Иммунная система организма стала объектом пристального изучения исследователей, занимающихся токсическим действием химических соединений, сравнительно недавно. Причиной тому особенности функционирования иммунной системы, сложности методических приее «мов, а также, завуалированность нарушений со стороны иммунной системы сопряженными изменениями других систем. Однако, все больше представляется фактов, свидетельствующих о способности химических соединений вызывать изменения в функционировании иммунной системы организма. В настоящее время ведется разработка единой системы оценки иммунотоксикологических свойств ксенобиотиков, вклю чая и пестициды.
Среди множества пестицидов, используемых в практике защиты растений, животных и человека, гербицид 2,4-Д и инсектицид карбофос (малатион) — являются классическими препаратами для борьбы с сорняками и насекомыми, широко применяющимися в практике сельского хозяйства.
Отсутствие материалов по иммунотоксичности пестицидов в «Методических л/казаниях по гигиеническойи токсикологической оценке новых пестицидов, предлагаемых для. внедрения в сельскохозяйственную практику, побудило нас к изучению их.
В результате проведенных исследований нами предложена система скрининга иммунотропных свойств химических средств защиты растений. Система скрининга, использованная при анализе иммунотоксичности карбофоса и 2,4-Д, позволяет выявить слабое звено в функционировании иммунной системы, рассчитать пороговую, дозу пре парата по показателям иммунной реактивности, а. также подобрать наиболее эффективные средства иммунокоррекции.
О высокой чувствительности иммунной системы организма к действию пестицидов свидетельствует тот факт, что уровень 2,4-Д, не вызывающий гистологических изменений в почках крыс, составлял 15 мг/кг массы тела в сутки (GhenW.Z, et at, 1981). Известно, что почки являются органом-мишенью для. структурных, физиологических и химических эффектов 2,4-Д.
В наших экспериментах доза 2,4-Д, рассчитанная и проведенная экспериментально и не изменяющая показатели иммунной системы организма, составила 0,94 мг/кг. Поскольку иммунологические механизмы направлены на охрану внутренней среды организма, использование иммунологических критериев при регламентировании пестицидов предотвратит нежелательные последствия использования пестицидов.
В предложенной схеме оценки иммунотоксичности пестицидов нашли отражение методы исследования ж vivo v гл vitro. Сочетание этих методов позволяет выявить прямое или опосредованное действие изучаемых препаратов.
Полученные нами данные об изменении функции макрофагов под.. влиянием пестицидов как in. vitro, так и ш vivo, возможно, отражают общую картину влияния, фармакологических и химиотерапевти-ческих средств на модулирование функций макрофагов. Корреляции изменений функций макрофагов in vitro и in vim под влиянием 2,4-Д и карбофоса позволяют нам рекомендовать анализ макрофагов как первичный тест оценки иммунотропного действия пестицидов.
Анализируя научную информацию о влиянии пестицидов на иммунную систему, можно отметить ряд исследований, объясняющих механизмы иммуномодулирующего действия пестицидов, их метаболитов и примесей, содержащихся в технических формах препаратов.
Так, К. Stodges s et ¿-г*?.,(1986) предложена ускоренная методика отбора in vitro потенциальных иммунотоксичных пестицидов, основан ная на определении цитотоксических Т-лимфоцитов. Эта методика, по мнению авторов, является простой, быстрой и практичной в использовании по следующим причинам: а) легкость интерпретации данных- -б) отсутствие осложняющих факторов со стороны целостного организма, и в) легкость изучения.- широкой области концентраций исследуемого вещества. Ранее были предложены методы исследовав ния шиИго, позволяющие определить влияние химических соединений на возникновение гуморальной иммунной реакции. Однако, необ^ ходимы методы в системе ш гн1го, изучающие воздействие препаратов на способность Т-клеток отвечать на это воздействие.
Данная методика может быть проведена в присутствии и в отсутствие усиленной НДЦШ фракции печени 5−9. Исследование а) относительно легко осуществитьб) позволяет легко анализировать результатыв) занимает только одну неделюг) позволяет определить, должно ли испытуемое соединение вступить в обмен веществ, чтобы оказать воздействие на иммунную систему.
По результатам исследований авторов малатион и фенитротион совсем не оказывали ингибирующего действия на активность цитоток сических лимфоцитов после предварительной обработки ферментной системой, однако этили метилпаратион, а также фентион только частично обезвреживались. С другой стороны, ферментная система 5−9 не изменяла степени воздействия карбаматных пестицидов, кар-барила и карбофурана на активность цитотоксических Т-лимфоцитов. Никакого усиления иммуносупрессии после инкубации с ферментной системой не наблюдалось.
Анализ литературных данных по иммунотоксическим воздействиям фосфорорганических и карбаматных инсектицидов показал, что од нократная доза препаратов, введенная т ьсгю, подавляла иммунную реакцию организма. Это согласуется с данными, полученными ш ш1го.
Однако, корреляция между обработкой т vitro и многократным воздействием in vitro не такая уж строгая. Такое различие может быть результатом различных режимов обработки, включая используемый метод и время введения, кроме того, длительное введение пестицидов влечет за собой изменения в метаболизме соединения.
Использование ферментной системы $-9 позволяет учитывать влияние метаболизма на иммунотоксичность соединения.
Преимущество методов исследования in vitro заключается в том, что, арасходуется меньше животныхб) используемые животные не подвергаются побочным воздействиям, таким как холинергические реакциив) исключаются факторы, возникающие при использовании целого организма, такие как гормональное влияние на иммунную систему. Для эффективного изучения иммунотоксического воздействия соединений необходимо сочетать исследования in vivo и in vitro.
При определении порога вредного действия химических веществ рекомендуется определить границы мевду физиологической адаптацией и компенсацией нарушенных функций.- Для этой цели предлагается системы различных методических приемов (Голиков С.Н. и др., 1986). Одним из методических приемов является оценка единства организма и среды обитания с использованием целой серии различных «нагрузочных» тестов, когда применяются экстремальные нагрузки химической, физической или биологической природы. Такие ." нагрузочные", тесты позволяют выявить уменьшение адаптационных или компенсаторных возможностей организма.
Так как иммунный ответ организма представляет собой сложный многокомпонентный процесс, оценка иммунотоксикологических свойств пестицидов должна включать изучение иммунологического параметра, который максимально определяет иммунную реактивность организма — хозяина. Наилучшим образом отражаетиммунную реактивность организма оценка защитных сил хозяина при введении патогенов. В качестве патогенов могут быть использованы бактерии, вирусы, паразиты.
Использование инфекционных патогенных агентов позволило определить развитие синергизма мевду инфекционными факторами и химическими загрязнителями окружающей среды. Было показано, что этот синергизм может выражаться в состоянии иммуносупрессии, которая или не наблюдалась при независимом и отдельном воздействии, или была выше, чем аддитивная в слз/чае применения обоих факторов {ЗСоо*е.2Ж, 1982).
Продукция макрофагами растворимого фактора, который индуцирует Т-супрессорные клетки, была показана на примере клеток печени и, в меньшей степени, клеток селезенки мышей, получавших диль-дрин, а затем инфицированных? feisAmania tropica,. Этот фактор при добавлении вместе с фитогемагглютинином к культурам селезеночных Т-клеток вызывал супрессию пролиферативной активности Т-клеток. Данный фактор не оказывал влияния ни на нормальные контрольные клетки, ни на Т-клетки отинфицированных 5teish.mcm.La. мышей. Однако, когда этот фактор добавляли к Т-клеткам, полученным от обработанных дильдрином и инфицированных SteisAmania. мышей или от мышей, обработанных. дильдрином, он ингибировал их пролиферативную активность. По-видимому, фактор действовал лишь на примированные дильдрином клетки.
Секреция макрофагами ингибирующих факторов наблюдалась при состоянии супрессии, выразившейся в, ингибиции антигенпредставля-ющей способности (Жоояе. 3. S)., 1982).
Модели с использованием инфекционных патогенных агентов могут позволить с большей чувствительностью выявить потенциальные возможности иммунотоксичности пестицидов.
Токсичность фосфорорганичееких пестицидов для млекопитающих срав нительно низка благодаря быстрому превращению исходного соединения в нетоксичные метаболиты под действием карбоксидгстераз (Shu-terman W.C., 1971; '7na?eip7Jd.iJI/r..
Ранее авторами {Жосl^ar-s Х.ё.
По мнению авторов, макрофаги обработанных 0,0,5 -триметилтиофосфатом животных вызывают угнетение иммунных реакций путем выделения неустойчивого цитостатического фактора. В пользу этого предположения получены данные о том, что фактор макрофагов обработанных животных обладал способностью блокировать пролифератив-ную реакцию на митогены и гуморальнуюна эритроциты барана (Jtoc/gerzJt. ё. efo?., 1987).
В литературе имеются примеры участия макрофагов в выделении цитоетатических факторов. В число каццидатов в медиаторы действия крупных макрофагов по подавлению иммунитета включают проста-г л андины (TTl^ottot. efo8., 1975: Jeesczci О.Э. e~f ов., 1975), интер-фероны Johnson Я9? z. е? а?., 1975), аргиназу {Ое^зоп, ¿-Я 1978) и продукты распада комплемента {^с/с/леТ/. О., 1977). Кроме того показано, что интерлейкин-I при определенных обстоятельствах об.
— Обладает цитостатическим действием (.^Ьг^й:^. е±о?., 1986).
Следует отметить, что подобные изменения функций иммунной системы организма наблюдались в дозах, не вызывающих признаков отравления (потери веса тела, или недомогания, увеличения уровня холинэстеразы в сыворотке крови, отсутствие гистопатологических изменений в печени, легких, сердце, коже, мозгу, селезенке или • кишечнике) (¿-Ьелеля &-Ж, 1985). .
Усиленное образование интерлейкина-2, участвующего в реализации клеточного и гуморального иммунного ответа, по мнению авторов, может привести к индукции супрессорных Т-клеток. В свою очередь, ищцукция супрессорных клеток приводит к ослаблению иммунных реакций организма. В работах С.СЖпд. е1 о£. ,(1984) было показано, что избыток интерлейкина-2 может способствовать образованию антиген-специфических и антиген-неспецифических супрессорных Т-клеток. И, наконец, усиленное образование интерлейкина-2 может быть реакций на увеличение синтеза интерлейкина-1 макрофагами .
Таким образом, выявленная в наших экспериментах индукция анР тигенспцифических Т-супреесоров при воздействии 2,4-Д и карбофоса может быть следствием изменения активности медиаторов, как указано выше.
Следующая серия экспериментов посвящена роли глютатиона в им-мунотоксичности, обусловленнойтриметмлтиофосфатом.
По результатам оты^оъ ЗЖ.Жотаз.^Згпатига,(1966) иммуносупрессивный эффект 0,0,"5 -триметилтиофосфата усиливался з присутствии глютатиона и цитозоля, что позволило. авторам предположить необходимость наличия глютатиона для формирования иммунотоксич-ности данного препарата. Хотя ферментативное или неферментативное взаимодействие химических соединений с глютатионом является одним из путей их детоксикации, многие исследователи приводят данные о том, что глютатион способствует биологическому активированию химических канцерогенов и мутагенов. Об уменьшении концентрации глютатиона во всех клетках, особенно в гепатоцитах, млекопитающих, подвергнутых воздействию 0,0,5 -триметилфосфоро-тиоата, свидетельствуют данные ,(1980).
При введении крысам (н) 0,0,5 -триметилфосфоротиоата при сопутствующем истощении глютатиона значительное количество меченого препарата ковалентно связывалось с легкими. Другими органами, проявляющими значительную ковалентную связь с радиоактивностью, были печень, почки и повздошная кишка.
Предварительная обработка ингибитором монооксигеназной системы снижала уровень меченого препарата, связанного с легкими, истощение глютатиона и токсичность 0,0,5 -триметифосфоротиоата.Эти результаты свидетельствуют о том, что ковалентное связывание происходит вследствие метаболизма 0,0,5- триметилфосфоротиоата и что метаболиты вовлечены в механизм токсичности. Механизм поражения органов, вовлекающий в ковалентную. связь реактивные метаболиты с тканевыми макромолекулами, показан для ряда гепатоток-сических, нефротоксических и пневмотоксических компонентов.
Резюмируя полученные и литературные данные по иммунотоксич-ности карбофоса и его аналога малатиона необходимо отметить существенную роль его примесей: 0,0,6' -триметилфосфортиоата и 0,0 диметил 5-зтилфосфоротиоата. Сам малатион, попадая в организм, метаболизируется под действием карбоксиластераз, образуя метаболиты, не обладающие иммунотоксическими свойствами. Скорее всего эти метаболиты представляют собой дии мономалатионовые кислоты. Примеси, присутствующие в коммерческом препарате фосфорорга-нических пестицидов, при введении в организм ингибируют актив.
— 188 ность карбоксилэстераз,./ йнгибирование карбоксилестераз ткани, которые ответственны за детоксикацию малатиона, является одним из факторов, обуславливающих токсичность малатиона {Jmomuro^Жосе-дата. Л., 1984). Другим фактором, влияющим на иммунотокеичность малатиона, является образование иммунотоксичных конъюгатов при метаболической активации 0,0,5-триметилфосфоротиоата в организме или в присутствии глютатиона и цитозоля. Одним из механизмов иммунотоксичности могут быть те изменения в функционировании иммунной системы, которые описаны выше.
Последствия ингибиции функций иммунной системы организма при отсутствии явных признаков токсичности могут оказаться весьма серьёзными и для людей, т.к. фоефорорганические пестициды широко используются в быту в борьбе с домашними и садовыми вредными насекомыми. Даже частичное угнетение иммунитета может привести к повышенной опасности бактериальных, вирусных и других инфекций, нарушить устойчивость к этим инфекциям.
Иммунологические средства издавно привлекали внимание исследователей в качестве антидотов для терапии острых отравлений лекарственными препаратами и химическими соединениями. Тем более, в настоящее время не существует удовлетворительного способа лечения отравлений пестицидами.
Новый подход к лечению острых отравлений пестицидами заключается в том, что создается препарат, который в состоянии химически. связывать потенциально активный яд, нейтрализовать его био логическую активность и удалять его из кровотока.: Такой метод лечения предупреждает появление рецидивов и хроническую нейроток-сичность, уменьшает также продолжительность лечения обычными средствами типа атропина, ибо при этом методе токсичное вещество выводится из организма (Борисенко H.S., Пьянзина В. И., 1977;
— 189.
СоебитЖа.МЛеС.тлт,$i/feer, 1982;0bat&-i97!.fituc/г m&.,.
1984; Заве/" 77?., JCrcrnz S. Werr/попл., 1984.
Известно, что при пероральном отравлении крыс паракватом концентрация препарата в плазме крови остается сравнительно постоян ной в течение 30 часов, тогда как концентрация в легких возрастает в несколько раз. В других органах не наблюдается такого накопления параквата.: а. ЖWrz^hi е/ о£., (1987) получили поликлональные и монокло-нальные антитела, которые обладали способностью связывать парак-ват. Полученные антитела в равной степени препятствовали накоплению параквата в легочных срезах крыс iavitro. По мнению авторов, антитела связывают паракват в растворе и таким образом предотвращают ш vitro его накопление в легочной ткани. По-видимому, антитела не способны влиять на утечку из легких или на внутрикле точный метаболизм параквата.
0 значительном увеличении концентрации параквата в плазме крови мышей, отравленных паракватом, после введения ^(ав*^-фрагментов антител свидетельствуют данные.Cadot €taE., 1985).
Полученные наш данные также указывают на защитный эффект S-(o6})? -фрагментов антител к 2,4-Д. Наряду с нейтрализацией токсического эффекта наблюдалось повышенное выделение 2,4-Д с мочой. ¦
Таким образом, использование специфических-, фрагментов экзогенных, антител в-терапевтических целях является перспективным в. условиях острых отравлений пестицидами. Однако, необходимы дальнейшие исследования для определения минимального количества специфических фрагментов, :необходимого для-получения-клинического эффекта.
Разработанные методы синтеза коньюгата и получения." антител к пестицидам играют существенную роль в. специфичности получаемых.
— 190 антител и, соответственно, выраженности защитного действия от токсических эффектов.
Так, в работъ ов., (1979) показано, что антитела, полученные к келевану и очищенные аффинной хроматографией, были способны предотвращать ингибированиеч. кепоном АТ§-азной, активности в различных тканях т жЬ-о 7 Келеван как производное кепона былг использован для-синтеза конъюгата, Одним из механизмов токсического действия кепона как и других хлорорганических. пестицидов является, ингибироавние митохоидриальной АТ$-азы. Очищенные антитела были эффективны в предотвращении ингибирования активности фер мента и другими хлорорганическими пестицидами (аддрин, ДДТ, ми-рекс). Однако, нехлорированньзе ингибиторы фермента не взаимодействовали с антителами.—По мнению авторов, перекрестные реакции антител к кепону с другими-пестицидами являютсярезультатом на-, личия хлор-углероднойсвязи в молекулах пестицидов.
В случае использования антител или их фрагментов, в терапевтических целях-. даншШ .факт можно, рассматривать как положительное явление, позволяющее использовать одни и те же антитела при отравлениях различными пестицидами одного класса химических соединений. В зависимости от необходимости получения узкоспецифических или видоспецифических антител подходы и методы должны быть дифференцированными. Примером могут служить исследования ё. Жевс/-тал е/ о£&bdquo- (1985). 0 протективных свойствах антител против пара-оксона-фосфорорганического инсектицида.
Другим перспективным направлением современной клинической иммунологии является использование биологически активных препаратов для лечения заболеваний, сопровождающихся нарушением функций иммунной системы. Все большее применение в клинике получают такие препараты как Т-активин, миелопид, интерферон и другие.
Использование левамизола, спленина, Т-активина и миелопида для коррекции нарушений иммунной системы организма, вызванных воздей ствием карбофоса и 2,4-Д, дало положительные результаты. Лечебный эффект иммуностимуляторов, нормализующих те или иные показатели иммунной системы организма, указывает на иммунотокси-кологические свойства изучаемых пестицидов. Однако, степень эффективностииммунокоррекции варьировала у разных иммуностимуляторов .
Наилучший эффект наблюдался при введении миелопида мышам, подвергнутым воздействию карбофоса и 2,4-Д. По-видимому, высокая эф фективность миелопида связана с тем, что миелопептиды являются полифункциональными иммуномодулирующими медиаторами, оказывающими воздействие как на В-, так и на Т-звено иммунной' систем, в особенности существенна их способность конкурировать с супреесор-ной активностью Т-лимфоцитов.
В клинической практике терапии хронических отравлений пестицидами широкое применение нашел левамизол (Рузыбакиев P.M., 1982; Джаббатов Р. Д. Криворучко В.И., 1984).
Механизм иммунотоксического действия 2,4-Д изучен в меньшей степени (Кенисберг Я.З., 1981, Cush^onJ.^., Street J. С., 1982).
В опытах на мышах установлено, что в основе аллергической ги-перчувствительноети к 2,4-Д у животных лежит взаимодействие белков с гербицидом с образованием антигена, который индуцирует антитела реагины Щё (Сг/зАтак^.Л., Street J. С., 1982).
По данным Кенисберга Я. Э>(1981) иммунодепрессивный механизм гербицида 2,4-Д связан с нарушением функции лизосом в макрофагах и снижением биосинтеза белка.
Проведенные нами исследования по оценке иммунотоксичности 2,4-Д свидетельствуют о том, что. иммунная система наиболее чувст.
— 192 вительна к влиянию гербицида.
Достоверные, изменения функции иммунокомпетентных клеток под влиянием 2,4-Д отмечены при отравлении в дозах 2,2 мг/кг.
Анализ иммунологической реакции организма животных. на пестициды позволил— нам установить, что в основе антигенности пестицидов лежит взаимодействие, их с белками, в результате которого происходит изменение иммунологической специфичности последних, которая приобретала специфичность присоединившихся пестицидов.
Только в условиях хронического отравления карбофосом или 2,4-Д обнаруживались аномальные антигены с детерминантой пестицида. При этом установлено образование аутоантител к экстрактам органов отравленных животных и комплексам пестицид-белок, и в низких концентрациях антител к пестицидам.
Длительная иммунизация кроликов коньюгатами, карбофос-белок или 2,4-Д-б ел ок. приводила к синтезу антител, к гаптенам .(инсектициду или гербициду). Антисыворотки кроликов, содержащие антитела к пестицидам, позволили, выявить циркулирующие метаболиты карбофоса в крови рабочих, динамику содержания комплексов пестицид-белок.
Совершенствование методов иццикации реакции, антитело-гаптен позволило нам разработать иш^уноферментный анализ 2,4-Д, карбофоса и его метаболитов.
Дальнейшее развитие исследований в области иммуноферментного анализа возможно в расширении ассортимента пестицидов, которые будут определяться с помощью иммунохимических методов. А также в совершенствовании и приборном обеспечении иммунохимических методов анализа микроколичеств пестицидов.
По мнению Ж.О.ТПитта^.Зтф, (1987) использование гомогенного (ЕМСП) анализа будет превалировать благодаря его высокой воспроизводимости и малых затрат времени при выполнении определений. Иммунохимические. анализы будут значительно дополнять существующие: аналитические методы. Антитела, связанные с твердой фазой, могут служить колонками для концентрации пестицидов, извлекаемых из больших объемов воды.
Шире и глубже будут применяться монокловальные антитела. Низкая стоимость и простота иммунохимических методов будут способствовать широкому распространению этих операций в местах, где широко применяются пестициды.
Например, иммуноферментный анализ инсектицида дифлубензурона на 10% дешевле, чем определение его методом высокоэффективной жидкостной хроматографии,-или газожидкостной хроматографии и позволяет анализировать в 10−15 раз больше образцов в день, и требует более низких капитальных затрат при сохранении чувствительности анализа на уровне классических (ВЭЖ или ГЖК). Самую большую экономию средств и времени дают сокращение или исключение этапов очистки образцов.
Агенс-тво по охране окружающей среды США и группа химиков-аналитиков Госкомиссии по регламентации и нормированию пестицидов в России пересматривают список пестицидов, для которых не существует надежных аналитических методов и рекомендует, проводить разработки иммуноферментного анализа остаточных количеств пестицидов.
Множество организаций проявляют интерес к иммунодиагностике, но только некоторые из них разрабатывают коммерческие препараты. Так, фирма За! е1еЛ .¿-/пе., (Зал Зги по ЗО., УЗй) продает моноклональные антитела для определения регуляторов роста растений. Чувствительность метода определения метилового эфира индолил-3-уксусной кислоты находится в пределах от 0,5 до 100 пикомолей в 0,1 мл.
Фирма &г.аги1е Зкшегоп. — ёашго/ьтеп1о? аЗкод/гоз&сз, Лгс.> (.&иг?гп.~ о/г, Л/Р, 1/3(2) выпускает &-гХВсгеел. тест-наборы для определения пестицидов. Эти наборы @игьк-Сагс/$ состоят из планшетов и реагентов (антитела и субстраты ферментов). Наборы содержат индикатор, который изменяет цвет, если в испытуемом объекте содер жится пестицид. Эта методика требует нескольких минут для исполнения и является полуколичественной, стабильна в использовании и нашла широкое применение для экспресс-анализа большого числа проб. Недавно фирма разработала два набора для определения гербицида параквата и инсектицида паратиона.
Фирма Утлъигиэзу^етз', ($гс/о/е/ого1, 77? ё разрабатывает гомогенный иммуноферментный анализ для ряда пестицидов.
Однако большинство иммуноферментных методов определения пестицидов, разработанных в академических лабораториях, еще не получило широкого коммерческого спроса, хотя экономическая выгода оче видна.
Я.Ж.Залёеш/ .
Таким образом, анализ экспериментальных исследований по изучению иммунотоксичности пестицидов привел нас к убеждению, что организм использует иммунологические механизмы для сохранения го-меостаза гораздо шире, чем зто представлялось до настоящего времени.
Разработанные и экспериментально обоснованные методические подходы иммунотоксикологического анализа пестицидов могут быть заложены в научную практику предупредительного санитарного надзора наряду с изучением-безопасности химических веществ по показателям репродуктивной функции, 'мутагенного и аллергенного действия .
