Бактериофаги, особенности строения и практическое применение

Курсовая работа

по теме:

«Бактериофаги. Особенности строения и практическое применение»

1. История открытия бактериофагов

2. Особенности строения

3. Жизненный цикл фага

4. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой

4.1 Редуктивная инфекция

4.2 Общая трансдукция

4.3 Специфическая трансдукция

5. Методы культивирования бактериальных вирусов (фагов) и их индикация

5.1 Выделение фага из объектов окружающей среды

5.2 Качественный метод определения фагов E. coli

5.3 Количественный метод — определение титра фага по методу Грациа

5.4 Определение спектра литического действия фага

5. 5 Фаготипирование бактерий

5.6 Определение лизогении

6. Практическое применение

Заключение

Список литературы

У каждого обитателя Вселенной свое назначение: все в природе гармонично и взаимосвязано, все имеет свои логические связи и требует баланса, чтобы жить в равновесии и гармонии.

Человек, как все другие живые существа, подвержен заражению вирусами. Вирусные эпидемии и даже пандемии не раз поражали человечество, приводя к многомиллионным жертвам (натуральная оспа, грипп, желтая лихорадка, клещевой энцефалит и др.). В конце XX века человек столкнулся с возбудителями целого ряда ранее неизвестных инфекций — вирусами геморрагической лихорадки Эболла, гепатитов В, C, D и E, атипичной пневмонии, птичьего и свиного гриппа. А в начале 80-ых гг. началась новая эпидемия, которую вызвал вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Надо признать, что одной из важнейших проблем в инфекционной патологии человека являются вирусные заболевания. Вирусы обычно рассматриваются как паразиты возбудители инфекционных болезней, наносящих вред человеку, животным, растениям. Однако такой подход является однобоким, и его нельзя назвать правильным. В 70-ых годах Ждановым В. М. была высказана гипотеза, согласно которой вирусы являются важным фактором эволюции органического мира. Преодолевая видовые барьеры, вирусы могут переносить отдельные гены или группы генов, а интеграция вирусной ДНК с хромосомами клеток может приводить к тому, что вирусные гены становятся клеточными генами, выполняющими важные функции.

Проблема вирус клетка давно вышла за рамки вирусологии и заняла одно из главных мест в науке о жизни. Наибольшие успехи в этом направлении были достигнуты в изучении системы бактериальный вирус — микробная клетка. Это объясняется простотой культивирования системы, коротким периодом генераций, высоким выходом потомства и возможностью весьма точного его количественного учета.

Особая роль бактериальных вирусов определяется тем вкладом, который был внесен при их изучении в решение общевирусологических вопросов. Исследования на бактериофагах (вирусах, размножающихся в бактериях) принесли плодотворные результаты и в разрешение важнейших проблем молекулярной биологии и молекулярной генетики. С их помощью было доказано, что материальным носителем наследственности является ДНК, открыт феномен модификации — рестрикции, открыта транскрипция, проведены важнейшие исследования по изучению репликации, рекомбинации, морфогенезу. бактериальный фаг вирус Кроме того, на бактериальных вирусах были проведены широкие радиобиологические исследования. Бактериофаги оказались также удобным объектом для первичного отбора противоопухолевых препаратов. Наконец, фаги с успехом использованы для биологических исследований космического пространства.

В последние годы вновь возрос интерес к вирусам бактерий в медицинской практике. С одной стороны это связано с все более широким их применением в качестве лекарственных препаратов на фоне нарастающего распространения штаммов микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, а с другой — с использованием бактериофагов в качестве санитарно-показательных микроорганизмов для ряда объектов. 1]

1. История открытия бактериофагов

Бактериофамги (фаги) (от греч. цЬгпт — пожирать) — вирусы, избирательно поражающие бактериальные клетки. Чаще всего, бактериофаги размножаются внутри бактерий и вызывают их лизис.

Бактериофагия — процесс взаимодействия фагов с бактериями, заканчивающийся очень часто их разрушением (от лат. bacteriophage — пожирающий бактерии).

1896 год — открытие бактериофагов Британским бактериологом Эрнестом Ханкин.

1898 год — бактериофаги исследованы российским ученым Николаем Гамалея. В этом же году фаги стали использовать при лечении ран и различных инфекций.

1920;е годы — Феликс д’Эрель — канадский сотрудник Института Пастера (Париж) назвал бактериофаги «бактериофагами» и охарактеризовал их: «вирусы, размножающиеся в бактериях».

1940;е годы — везде, кроме СССР разработки бактериофагов вычеркнуты из числа перспективных исследований. В СССР исследования продолжаются.

Во всем мире популярность приобретает метод применения антибиотиков.

1980;е годы Эффективность лечения антибиотиками значительно понизилась. Бактерии выработали лекарственную устойчивость.

Интерес к фаговой терапии возобновился.

Начало 2000;х годов — Гленн Моррис — сотрудник Университета Мэриленд (США) совместно с НИИ бактериофагов, микробиологии и вирусологии в Тбилиси наладил испытания фаговых препаратов для получения лицензии на их применение в США.

Июль 2007 годабактериофаги одобрены для использования в США.

На протяжении последних нескольких лет исследования свойств бактериофагов проводятся в России, Грузии, Польше, Франции, Германии, Финляндии, Канаде, США, Великобритании, Мексике, Израиле, Индии, Австралии.

Явление бактериофагии наблюдали многие ученые, но приоритет открытия фагов (1916) принадлежит Ф. Д’Эреллю — канадскому ученому, работавшему в Париже в Институте Пастера. Занимаясь изучением дизентерии, Феликс Д’Эрелль задумался над вопросом: почему возбудитель этой болезни, высевающийся в ее начале в большом количестве, в конце заболевания очень часто перестает выделяться? Заподозрив здесь действие какого — то агента, Д’Эрелль решил его обнаружить. С этой целью к свежей бульонной культуре дизентерийной палочки он стал добавлять по нескольку капель фильтрата испражнений больного. После одного из таких посевов Д’Эрелль и обнаружил этот агент по его способности разрушать дизентерийные бактерии. При добавлении к мутной бульонной культуре он вызвал ее просветление, а при добавлении к культуре, засеянной на плотную среду, появлялись прозрачные (стерильные) пятна — колонии. Способность вызывать такие пятна и размножаться при повторных посевах дали основание считать его живым корпускулярным агентом. Д’Эрелль назвал его Bacteriophagum intestinale, т. е. выделенный из кишечника пожиратель бактерий. Последующие наблюдения показали, что бактериофаги распространены повсеместно. Они встречаются всюду, где есть бактерии — в почве, воде, кишечном тракте человека и животных, гнойных выделениях и т. п. Особенно много фагов в сточных водах; из этого источника можно выделить практически любой фаг. Поскольку естественной средой обитания любого фага является микробная клетка, жизнь фагов связана с бактериями. 1,7]

2. Особенности строения

Как правило, бактериофаг состоит из белковой оболочки и генетического материала — одноцепочечной или двуцепочечной РНК. Размер частиц приблизительно от 20 до 200 нанометров. Современная классификация бактериофагов включает 13 семейств, подразделенных более чем на 140 родов, которые содержат более 5300 видов фагов. В настоящее время эти вирусы выявлены у большинства бактерий, как болезнетворных, так и неболезнетворных, а также ряда других микроорганизмов (например, грибов).

Рис. 1. Бактериофаги.

Фаги различаются по форме, структурной организации, типу нуклеиновой кислоты и характеру взаимодействия с микробной клеткой.

Фагам присущи все биологические особенности, которые свойственны вирусам. Их геном представлен либо ДНК, либо РНК и заключен в белковую оболочку (капсид), структурные субъединицы которой уложены по типу либо спиральной, либо кубической симметрии. Крупные фаги, имеющие хвостик, устроены по типу бинарной симметрии (головка — икосаэдр, хвостик — спиральная симметрия). Фаги различаются по форме — нитевидные, сферические; фаги, имеющие головку и хвостик; по размерам — мелкие, среднего размера и крупные (рис. 2).

Рис. 2. Различные формы фаговых вирионов (по Г. Шлегелю, 1972):

1 — нитевидная форма (фаг fd); 2 — гексагональная головка с отростком и сократительным чехлом (фаги Т2. Т4, Т6); 3 — гексагональная головка с длинным, не способным к сокращению хвостиком; 4 — головка с коротким отростком (фаги ТЗ, Т7); 5 — октаэдр; 6 — икосаэдр.

Большинство фагов под электронным микроскопом имеют форму головастика или сперматозоида, некоторые — кубическую и нитевидную формы. Размеры фагов колеблются от 20 до 800 нм у нитевидных фагов.

Наиболее полно изучены крупные бактериофаги, имеющие форму сперматозоида. Они состоят из вытянутой икосаэдрической головки размером 65−100 нм и хвостового отростка длиной более 100 нм (рис. 3).

Внутри хвостового отростка имеется полый цилиндрический стержень, сообщающийся отверстием с головкой, снаружи — чехол, способный к сокращению наподобие мышцы. Хвостовой отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с короткими шипами, от которых отходят нитевидные структуры — фибриллы.

Существуют также фаги, имеющие длинный отросток, чехол которого не способен сокращаться, фаги с короткими отростками, аналогами отростков, без отростка. 2,4]

Рис. 3. Бактериофаг (схема строения).

1 — головка, 2- хвост, 3 — нуклеиновая кислота, 4 — капсид, 5 -" воротничок", 6 — белковый чехол хвоста, 7- фибрилла хвоста, 8 — шипы, 9 — базальная пластинка.

Фаги состоят из двух основных химических компонентов — нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белка. У фагов, имеющих форму сперматозоида, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали внутри головки.

Белки входят в состав оболочки (капсида), окружающей нуклеиновую кислоту, и во все структурные элементы хвостового отростка. Структурные белки фага различаются по составу полипептидов и представлены в виде множества идентичных субъединиц, уложенных по спиральному или кубическому типу симметрии.

Кроме структурных белков, у некоторых фагов обнаружены внутренние (геномные) белки, связанные с нуклеиновой кислотой, и белки — ферменты (лизоцим, АТФ — аза), участвующие во взаимодействии фага с клеткой. 2]

Фаги более устойчивы к действию химических и физических факторов, чем бактерии. По степени устойчивости к действию различных факторов внешней среды и химических веществ фаги занимают место между вирусами и неспоровыми бактериями. Они устойчивы в пределах рН от 5,0 до 8,0, большинство из них не инактивируется холодными водными растворами глицерина и этилового спирта. На них не действуют такие ферментные яды, как цианид, фторид, динитрофенол, а также хлороформ и фенол. Фаги хорошо сохраняются в запаянных ампулах и в лиофилизированном состоянии, но легко разрушаются при кипячении, действии кислот, химических дезинфектантов, при УФ облучении.

Высокочувствительны фаги к формалину и кислотам. Инактивация большинства фагов наступает при температуре 65−70 °С. Длительное время они сохраняются при высушивании в запаянных ампулах, замораживании при температуре -185 °С в глицерине. 2,4]

3. Жизненный цикл фага

Различают фаги инфекционные, т. е. способные вызвать разные формы фаговой инфекции, и неинфекционные (вегетативные), или незрелые фаги, находящиеся еще в стадии размножения. В свою очередь инфекционные фаги разделяют на покоящиеся (находящиеся вне клетки), вирулентные — способные вызвать продуктивную форму инфекции, и умеренные фаги — способные вызывать не только продуктивную, но и редуктивную фаговую инфекцию.

Жизненный цикл фага может проявляться в форме:

· продуктивной (фаг размножается в клетке и выходит из нее);

· редуктивной (геном фага проникает в клетку, однако размножения фага не происходит, его геном интегрируется в хромосому клетки — хозяина, становится ее составной частью, т. е. фаг превращается в профаг, а клетка становится лизогенной);

· абортивной инфекции, при которой взаимодействие фага с клеткой обрывается на какой — то стадии жизненного цикла фага, и он погибает.

Клетка, несущая профаг, называется лизогенной, потому что профаг, передающийся клеткой по наследству, может выйти из хромосомы, активироваться и вызвать продуктивную форму инфекции.

Если в результате лизогении, т. е. внедрения профага в хромосому клетки — хозяина, она получает новые наследуемые признаки, такую форму ее изменчивости называют лизогенной конверсией, т. е. изменчивостью, обусловленной лизогенией. Лизогенную конверсию вызывают только умеренные фаги.

Жизненный цикл фага, сопровождающийся продуктивной инфекцией, складывается из 6 последовательных стадий, каждая из которых, в свою очередь, состоит из нескольких этапов.

1. Адсорбция фагов на клеточной поверхности бактерий при помощи специфических рецепторов (белков — лоцманов), которые располагаются на кончике нити, шипа или хвостика. В свою очередь, на клеточной стенке бактерии располагаются ее фагоспецифические рецепторы, распознаваемые фагом. Адсорбция фага — пусковой момент его жизненного цикла. Она очень специфична и поэтому обусловливает возможность практического использования фагов, например для идентификации, бактерий, а также для лечебных и профилактических целей.

2. Проникновение фагового генома через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану внутрь клетки и освобождение его от оболочки (раздевание фага).

3. Установление фагового генома с помощью белка — лоцмана для реализации содержащейся в геноме информации:

а) однонитевая ДНК — к репликативному аппарату для синтеза комплементарной ей нити и образования репликативной формы; далее ее поведение аналогично двунитевой ДНК;

б) двунитевая ДНК — к транскрипционному аппарату для синтеза мРНК и последующей трансляции вирусспецифических белков (ферментов и структурных);

в) РНК — геном — к трансляционному аппарату для синтеза вирусоспецифических белков (ферментов репликации и структурных).

4. Репликация фаговой геномной ДНК или РНК.

5. Сборка вновь синтезированных вирионов — заключение геномной НК в белковую оболочку, морфогенез фагов.

6. Выход вновь синтезированных фагов из клетки:

а) путем отпочковывания (М13 — единственный фаг, не вызывающий при выходе из клетки ее гибели);

б) путем лизиса клетки изнутри. Он осуществляется свободным лизоцимом и вызывает гибель клетки.

Степень зависимости репликации ДНК фага от хромосомы клетки определяется набором генов у фагов. Крупные фаги осуществляют репликацию полностью автономно; средние — частично нуждаются в помощи бактериальных генов, а мелкие почти полностью зависят от хромосомных генов. 4]

Морфогенез мелких фагов протекает по типу самосборки. У крупных фагов этот процесс имеет более сложный характер. Например, морфогенез фага Т4 требует активности более чем 40 генов и протекает при участии трех самостоятельных линий. На одной из них происходит сборка хвостика (участвует около 20 генов), на другой — головки фага (не менее 16 генов) и на третьей — сборка ворсинок (5 генов). Соединение хвостика с головкой не требует участия генов, однако оно не может произойти до тех пор, пока и хвостик, и головка не будут смонтированы полностью. Точно так же ворсинки могут присоединяться к хвостику только после того, как он соединится с полностью готовой головкой. Благодаря строгому генетическому контролю со стороны фага обеспечивается последовательность и согласованность всех процессов его внутриклеточного размножения.

Выход сформировавшихся фагов в большинстве случаев происходит благодаря лизису изнутри свободным лизоцимом. Он синтезируется на самом последнем этапе размножения фага. Иногда бывает лизис бактерий извне как следствие адсорбции многих фагов на одной клетке, но при этом размножения фагов не происходит. Обычно же после внедрения фагового генома в клетку у нее возникает состояние иммунитета к суперинфекцни данным фагом, т. е. проникновение других фаговых геномов становится невозможным. Иммунитет обеспечивается особым цитоплазматическим ре-прессором. 4]

4. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой

По механизму взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги, проникнув в бактериальную клетку, автономно репродуцируются в ней и вызывают лизис бактерий. Процесс взаимодействия вирулентного фага с бактерией протекает в виде нескольких стадий и весьма схож с процессом взаимодействия вирусов человека и животных с клеткой хозяина. Однако для фагов, имеющих хвостовой отросток с сокращающимся чехлом, он имеет особенности. Эти фаги адсорбируются на поверхности бактериальной клетки с помощью фибрилл хвостового отростка. В результате активации фагового фермента АТФазы происходит сокращение чехла хвостового отростка и внедрение стержня в клетку. В процессе «прокалывания» клеточной стенки бактерии принимает участие фермент лизоцим, находящийся на конце хвостового отростка. Вслед за этим ДНК фага, содержащаяся в головке, проходит через полость хвостового стержня и активно впрыскивается в цитоплазму клетки. Остальные структурные элементы фага (капсид и отросток) остаются вне клетки.

После биосинтеза фаговых компонентов и их самосборки в бактериальной клетке накапливается до 200 новых фаговых частиц. Под действием фагового лизоцима и внутриклеточного осмотического давления происходит разрушение клеточной стенки, выход фагового потомства в окружающую среду и лизис бактерии. Один литический цикл (от момента адсорбции фагов до их выхода из клетки) продолжается 30 — 40 мин. Процесс бактериофагии проходит несколько циклов, пока не будут лизированы все чувствительные к данному фагу бактерии.

Взаимодействие фагов с бактериальной клеткой характеризуется определенной степенью специфичности. По специфичности действия различают поливалентные фаги, способные взаимодействовать с родственными видами бактерий, моновалентные фаги, взаимодействующие с бактериями определенного вида, и типовые фаги, взаимодействующие с отдельными вариантами (типами) данного вида бактерий.

Умеренные фаги лизируют не все клетки в популяции, с частью из них они вступают в симбиоз, в результате чего ДНК фага встраивается в хромосому бактерии. В таком случае геномом фага называют профаг. Профаг, ставший частью хромосомы клетки, при ее размножении реплицируется синхронно с геном бактерии, не вызывая ее лизиса, и передается по наследству от клетки к клетке неограниченному числу потомков. Биологическое явление симбиоза микробной клетки с умеренным фагом (профагом) называется лизогенией, а культура бактерий, содержащая профаг, получила название лизогенной. Это название (от греч. lysis — разложение, genea — происхождение) отражает способность профага самопроизвольно или под действием ряда физических и химических факторов исключаться из хромосомы клетки и переходить в цитоплазму, т. е. вести себя как вирулентный фаг, лизирующий бактерии.

Лизогенные культуры по своим основным свойствам не отличаются от исходных, но они невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и, кроме того, приобретают дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменение свойств микроорганизмов под влиянием профага получило название фаговой конверсии. Последняя имеет место у многих видов микроорганизмов и касается различных их свойств: культуральных, биохимических, токсигенных, антигенных, чувствительности к антибиотикам и др. Кроме того, переходя из интегрированного состояния в вирулентную форму, умеренный фаг может захватить часть хромосомы клетки и при лизисе последней переносит эту часть хромосомы в другую клетку. Если микробная клетка станет лизогенной, она приобретает новые свойства. Таким образом, умеренные фаги являются мощным фактором изменчивости микроорганизмов.

Умеренные фаги могут нанести вред микробиологическому производству. Так, если микроорганизмы, используемые в качестве продуцентов вакцин, антибиотиков и других биологических веществ, оказываются лизогенными, существует опасность перехода умеренного фага в вирулентную форму, что неминуемо приведет к лизису производственного штамма. 2,4]

4.1 Редуктивная инфекция

Ее вызывают только умеренные фаги. В этом случае их жизненный цикл складывается из следующих стадий:

а) адсорбция фага на поверхности клетки;

б) проникновение фаговой ДНК в бактериальную клетку;

в) сайт — специфическая интеграция фаговой ДНК в хромосому клетки-хозяина и превращение фага в профаг.

Если первые две стадии протекают так же, как в случае продуктивной инфекции, то третья требует участия дополнительных фаговых и хозяйских генов.

Механизм интеграции фаговой ДНК в хромосому бактериальной клетки лучше всего изучен на примере фага л (лямбда). Фаг состоит из головки и хвостика. Его геном представлен двунитевой линейной ДНК, имеющей «липкие» концы (избыточные нуклеотидные последовательности на противоположных концах нитей, комплементарные друг другу), поэтому она может переходить в кольцевую структуру, необходимую для ее включения в хромосому клетки-хозяина. ДНК фага X имеет м. м. около 30 МД, содержит 46 500 нуклеотидных пар и несет 32 гена, 7 из которых кодируют головку, 11 — хвостик, а остальные играют регуляторную роль.

Фаг л включается в хромосому Е. colt между генами gal и bio с помощью сайт — специфической рекомбинации. Она оказывается возможной потому, что ДНК фага имеет особый участок — attP (от англ. attachment phage — прикрепление фага). Такой же участок имеется и в хромосоме Е. coli - attB. Он расположен между генами gal и bio. Участки att имеют сложную структуру и состоят из 250 нуклеотидов. В результате рекомбинации между attP и attB, протекающей по механизму кроссннговера, фаговая ДНК оказывается включенной в хромосому, причем слева она фланкирована участком attL (от англ. left - левый), а справа - attR (от англ. right — правый), которые образуются вследствие рекомбинации между attP и attB. Рекомбинация протекает с участием генов red фага и гесА — бактерии. Для интеграции требуется также белок фага — продукт гена int (интеграза) и особый хозяйский белок интеграции. Таким образом, геном фага, интегрируясь в хромосому, превращается в профаг, а клетка становится лизогенной. Выходу профага из хромосомы препятствует цитоплазматический репрессор, который наделяет клетку одновременно иммунитетом против повторного инфицирования данным фагом. Синтез репрессора контролируется фагом. Однако профаг спонтанно или под воздействием различных факторов (химические вещества, облучение УФ, рентгеновскими лучами, повышенная температура) может выходить из хромосомы клетки и вызывать продуктивную инфекцию, заканчивающуюся лизисом клетки и выходом из нее вновь синтезированных вирионов. Механизм выхода (исключение фага) из хромосомы состоит в том, что происходит рекомбинация между attL и attR, в результате которой восстанавливаются attP и attB, а фаговая ДНК принимает кольцевидную структуру и исключается из хромосомы. Процесс выхода требует участия, помимо указанных выше белков, еще одного белка — продукта фагового гена xis (ген эксцизии, исключения).

Умеренные фаги играют важную роль в обмене генетическим материалом между бактериями. Этот процесс получил название трансдукции. Различают общую (генерализованную, или неспецифическую) и специфическую трансдукцию. 4]

4.2 Общая трансдукция

Механизм ее заключается в том, что в процессе внутриклеточного размножения фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК, равный по длине фаговой. Это вполне возможно, так как в инфицированной клетке биосинтез ее ДНК блокирован, а сама ДНК подвергается распаду. Таким образом в процессе репродукции фага возникают дефектные вирионы, у которых в головках вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в нее ДНК, содержащуюся в головке, но при этом размножения фага не происходит. Введенная в клетку реципиента донорная ДНК (фрагмент хромосомы донора), если она содержит гены, отсутствующие у реципиента, наделяет его новым признаком. Этот признак будет зависеть от того, какой ген (гены) попал в головку трансдуцирующего фага. В случае рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки — реципиента этот признак наследственно закрепляется. 4]

4.3 Специфическая трансдукция

Отличается от неспецифической тем, что в этом случае трансдуцирующие фаги всегда переносят только определенные гены, а именно, те из них, которые располагаются в хромосоме лизогенной клетки слева от attL или справа от attR. Специфическая трансдукция всегда связана с интеграцией умеренного фага в хромосому клетки-хозяина. При выходе (исключении) из хромосомы профаг может захватить ген с левого или правого фланга, например или gal, или bio. Но в этом случае он должен лишиться такого же размера своей ДНК с противоположного конца, чтобы ее общая длина оставалась неизменной (иначе она не может быть упакована в головку фага). Поэтому при такой форме исключения образуются дефектные фаги: A — dgal или Xdbio.

Специфическую трансдукцию у Е. coli осуществляет не только фаг лямбда, но и родственные ему лямбдоидные и другие фаги. В зависимости от места расположения сайтов attB на хромосоме они при своем исключении могут включать различные бактериальные гены, сцепленные с профагом, и трансдуцировать их в другие клетки. Встраивающийся в геном материал может замещать до 1/3 генетического материала фага.

Трансдуцирующий фаг в случае инфицирования реципиентной клетки интегрируется в ее хромосому и привносит в нее новый ген (новый признак), опосредуя не только лизогенизацию, но и лизогенную конверсию.

Таким образом, если при неспецифической трансдукции фаг является только пассивным переносчиком генетического материала, то при специфической фаг включает этот материал в свой геном и передает его, лизогенизируя бактерии, реципиенту. Однако лизогенная конверсия может произойти и в том случае, если геном умеренного фага содержит такие собственные гены, которые у клетки отсутствуют, но отвечают за синтез существенно важных белков. Например, способностью вырабатывать экзотоксин обладают только те возбудители дифтерии, в хромосому которых интегрирован умеренный профаг, несущий оперон tox. Он отвечает за синтез дифтерийного токсина. Иначе говоря, умеренный фаг tox вызывает лизогенную конверсию нетоксигенной дифтерийной палочки в токси — генную.

Фаги размножаются только за счет паразитирования в микробной клетке. Их размножение в бульонной культуре приводит к тому, что культура, бывшая перед добавлением фага мутной, через несколько часов инкубации при 37 °C становится прозрачной. На плотных средах фаги обнаруживают либо с помощью спот — теста, либо методом агаровых слоев, предложенным А. Грациа (1936). В первом случае на поверхность агара в чашке засевают культуру, а затем на нее наносят каплю содержащего фаг материала. Если в нем содержится много вирионов, то на месте нанесения капли будет большое стерильное пятно (англ. spot — пятно; рис. 4).

Рис. 4. Обнаружение бактериофагов в исследуемом материале:

1 — спот-тест; 2 — титрование по Грациа.

Метод агаровых слоев заключается в следующем. Вначале в чашку наливают слой питательного агара. После застывания на этот слой добавляют 2 мл расплавленного и охлажденного до 45 °C 0,7% - ного агара, в который предварительно добавляют каплю концентрированной суспензии бактерий и определенный объем суспензии фага. После того, как верхний слой застынет, чашку помещают в термостат. Бактерии размножаются внутри мягкого слоя агара, образуя сплошной непрозрачный фон, на котором хорошо видны колонии фага в виде стерильных пятен (рис. 4.2). Каждая колония образуется за счет размножения одного исходного фагового вириона. Применение этого метода позволяет:

а) путем подсчета колоний точно определить количество жизнеспособных фаговых вирионов в данном материале;

б) по характерным признакам (размер, прозрачность и др.), изучать наследственную изменчивость V фагов.

По спектру действия на бактерии фаги подразделяются на поливалентные (лизируют родственные бактерии, например поливалентный сальмонеллезный фаг лизирует почти все сальмонеллы), монофаги (лизируют бактерии только одного вида, например фаг Vi — I лизирует только возбудителей брюшного тифа) и типоспецифические фаги, которые избирательно лизируют отдельные варианты бактерий внутри вида. С помощью таких фагов производится наиболее тонкая дифференциация бактерий внутри вида, с разделением их на фаговарианты. Например, с помощью набора фагов Vi — II возбудитель брюшного тифа делится более чем на 100 фаговариантов. Поскольку чувствительность бактерий к фагам является относительно стабильным признаком, связанным с наличием соответствующих рецепторов, фаготипирование имеет важное диагностическое и эпидемиологическое значение. 4]

5. Методы культивирования бактериальных вирусов (фагов) и их индикация

Бактериофаги широко распространены в окружающей среде — водоемах, почве. Фаги кишечных бактерий (кишечной палочки, шигелл, сальмонелл) могут быть выделены из сточных вод и испражнений. Фаги стафилококков обнаруживают в слизи из носоглотки, на коже и в раневом отделяемом, фаги клостридий, вызывающих анаэробную раневую инфекцию, — в раневом отделяемом, почве. Наличие фага в среде указывает на присутствие чувствительных к нему бактерий.

Существуют вирулентные и умеренные фаги. Вирулентные фаги вызывают продуктивную инфекцию, заканчивающуюся образованием новых фаговых частиц и лизисом бактериальных клеток. Умеренные фаги вызывают интегративную инфекцию, не приводящую к лизису зараженных ими клеток. ДНК этих фагов включается в хромосому бактерий и передается при их делении неограниченному числу потомков. Такой тип взаимодействия фага с клеткой называют лизогенией, а бактерии, несущие в своей хромосоме фаговую ДНК (профаг), являются лизогенными. Под действием различных факторов в клетках лизогенных бактерий может происходить индукция профага — выщепление его ДНК из хромосомы бактерии и развитие продуктивной инфекции. Лизогенные фаги широко распространены в природе.

Репродукция вирулентного фага в клетках бульонной бактериальной культуры сопровождается лизисом бактерий и просветлением среды. На газоне чувствительных бактерий, выращенных на плотной питательной среде в чашке Петри, фаги образуют зоны очагового или сплошного лизиса, что зависит от их концентрации. Зоны очагового лизиса получили название негативных колоний фага, или стерильных пятен — бляшек (рис. 5).

Рис. 5. Негативные колонии (стерильные пятна) бактериофагов:

а — пятна фага Т₂; б — пятна фага T₁

Они имеют морфологию, характерную для определенных фагов, и образуются из одной фаговой частицы при ее внедрении и последующей репродукции в бактериальных клетках. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется и освобождает потомство фага, состоящее из сотен новых фаговых частиц. Они внедряются в интактные клетки, и весь цикл повторяется. В результате лизиса клеток на сплошном бактериальном газоне появляются негативные колонии фага.

Для получения «чистой» линии фага (свободной от примеси других фагов) проводят последовательные пассажи морфологически однотипных негативных колоний на газоне одного и того же бактериального штамма.

Большинство фагов характеризуется видоспецифичностью в отношении бактерий. Однако существуют фаги, которые могут поражать только отдельные варианты одного и того же вида бактерий. Их используют для определения фаготипов (фаговаров) внутри данного вида. Вместе с тем имеются фаги, лизирующие родственные виды бактерий.

В практической работе фаги применяют для:

1) фаготипирования бактерий, т. е. определения фаготипа по лизису штаммов бактерий одного и того же вида типоспецифическими фагами, что важно для маркировки исследуемых бактерий при эпидемиологическом анализе заболеваний;

2) фагоидентификации бактериальных культур с целью установления их видовой принадлежности;

3) фагодиагностики, заключающейся в выделении фага из организма больного (например, из испражнений), что косвенно свидетельствует о наличии в материале соответствующих бактерий;

4) фагопрофилактики — предупреждения некоторых заболеваний (например, дизентерии) среди лиц, находящихся в эпидемическом очаге;

5) фаготерапии — лечения некоторых инфекционных заболеваний, вызванных, например, шигеллами, протеем, стафилококком. 3]

5.1 Выделение фага из объектов окружающей среды

Для получения вирулентного фага готовят фильтрат, пропуская исходный материал (вода, суспензия фекалий и др.) через бактериальные фильтры. Фильтрат вместе с соответствующей бактериальной культурой засевают в бульон и инкубируют при 37 °C в течение 18 — 24 ч. После лизиса культуры оставшиеся бактериальные клетки удаляют центрифугированием или фильтрацией через бактериальный фильтр. Наличие фага в фильтрате определяют качественными и количественными методами. 3]

5.2 Качественный метод определения фагов E.coli

Чашку Петри с питательным агаром засевают суточной бульонной культурой кишечной палочки газоном и подсушивают при 37 °C в течение 10—15 мин. Затем на поверхность газона наносят каплю фага и наклоняют так, чтобы капля стекла к противоположному краю. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая наличие зоны лизиса по месту стекания капли фага. 3]

5.3 Количественный метод - определение титра фага по методу Грациа

Для постановки опыта предварительно:

а) разливают питательный агар в чашки Петри, подсушивают в термостате;

б) приготовленный полужидкий (0,7%) питательный агар, разлитый по 3 — 4 мл в пробирки, растапливают в водяной бане. Делают 10-кратные разведения исследуемого фага (10^-2 — 10^-7 в зависимости от предполагаемого титра) в изотоническом растворе хлорида натрия. Затем 0,5 мл из последнего разведения фага (10^-7) смешивают с таким же объемом суточной бульонной культуры чувствительных к фагу бактерий и выливают в пробирку с полужидким агаром, охлажденным до 45 ⁰С. Смесь быстро выливают на поверхность агара в чашке Петри, где она застывает в виде тонкого слоя.

Так же готовят смесь из следующего разведения фага (10^-6) с бактериями и полужидким агаром и выливают на поверхность агара в другой чашке, затем — из разведения 10^-5. После застывания второго слоя агара чашки инкубируют при 37⁰ С, затем подсчитывают число негативных колоний фага. Число этих колоний соответствует количеству фаговых частиц в засеянной смеси. Исходя из него, можно вычислить количество пятнообразующих единиц в 1 мл исходной суспензии фага. Эта величина, характеризующая концентрацию фага, называется его титром (табл.1). 3]

Таблица 1. Результаты титрования фага, но методу Грациа (форма протокола)

5.4 Определение спектра литического действия фага

Чашку с питательным агаром делят на квадраты по числу испытуемых бактериальных культур. На каждый квадрат петлей наносят каплю соответствующей бульонной культуры и распределяют ее по агару в пределах данного квадрата. Затем на каждый засеянный квадрат петлей или пастеровской пипеткой наносят по одной капле испытуемого фага. После суточной инкубации в термостате просматривают чашку, отмечая те квадраты, где имеется сплошной лизис бактерий или так называемые стерильные пятна на бактериальном газоне. Количество различных бактериальных культур, которые лизируются испытуемым фагом, определяет широту спектра его литического действия. 3]

5.5 Фаготипирование бактерий

Испытуемую суточную бульонную культуру бактерий засевают на поверхность питательного агара в чашке Петри, слегка подсушивают в термостате, затем делят на квадраты, на которые пастеровской пипеткой наносят по одной капле различных типоспецифических фагов. После суточной инкубации отмечают на чашке те квадраты, в которых имеется сплошной лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется тем типом фага, который вызывает ее лизис (рис. 6). 3]

Рис. 6. Постановка опыта фаготипирования культуры стафилококка.

5.6 Определение лизогении

Исследуемую суточную бульонную культуру центрифугируют для отделения фага от бактерий. В том случае, если бактерии спонтанно продуцируют фаг, последний будет содержаться в надосадочной жидкости. Для выявления фага надосадочную жидкость засевают на газон индикаторной (чувствительной) бактериальной культуры, на котором через 1 сутки инкубации при 37 ⁰С образуются очаги лизиса «стерильные» пятна. При отрицательном результате опыта исследуемую бактериальную культуру предварительно подвергают УФ — облучению с целью индукции содержащегося в ней профага. Затем поступают так же, как и в предыдущем опыте. 3]

6. Практическое применение

Благодаря своему разрушающему (литическому) действию на бактерии фаги могут быть использованы с лечебно — профилактической целью при различных заболеваниях (дизентерия, холера, различные гнойно-воспалительные заболевания и т. д.). Наборы стандартных фагов, в том числе международные, используются для фаготипирования возбудителей ряда болезней (холеры, брюшного тифа, сальмонеллезов, дифтерии, стафилококковых и других заболеваний). Бактериофаги применяются также в генной инженерии в качестве векторов, переносящих участки ДНК, возможна также естественная передача генов между бактериями посредством некоторых фагов (трансдукция). Как правило, таким больным назначаются антибиотики. Но в связи с тем, что постоянно мутирующие бактерии приобретают устойчивость к антибиотикам, их эффективность за последние годы ослабла. Внимание исследователей привлекли бактериофаги — вирусы, пожирающие бактерии. В отличие от антибиотиков, которые уничтожают как вредную, так и здоровую микрофлору организма, бактериофаги избирательны, под их воздействие попадают только патогенные бактерии. Как действуют бактериофаги в организме? Они проникают только в определенные клетки и взаимодействуют с их ДНК, создавая лизогенный или литический эффект. Воздействуя на микробы при литическом типе, бактериофаги уничтожают их, что позволяет им быстро размножаться. Лизогенный тип представляет собой проникновение генома фага в геном бактерии, их синтез и дальнейший переход из одного поколения в другое. Информация о бактериофагах появилась больше века назад при использовании их для лечения стафилококка. В настоящее время они широко используются для профилактики и лечения кишечных, стафилококковых, стрептококковых, тифозных и многих других инфекций. Современная медицина ищет методы, при которых используются не живые бактериофаги, а ферменты, воздействующие на патогенные бактерии лизированием. Их применение может быть в виде назального или орального спрея, зубной пасты, продуктов питания, пищевых добавок. Эффективность применения бактериофагов состоит в отсутствии противопоказаний и осложнений, сочетаемости с другими лекарствами, активном воздействии на антибиотико-устойчивые микробы. Благодаря этим свойствам, бактериофаги оценены как препараты будущего для успешной борьбы с инфекциями.

Важнейшими достоинствами фаготерапии являются высокая чувствительность патогенной микрофлоры к бактериофагу, возможность первоначального применения небольших доз бактериофага, сочетаемость со всеми видами традиционной антибактериальной терапии, отсутствие противопоказаний к фагопрофилактике и фаготерапии. Установлено, что в природе не существуют микроорганизмы, абсолютно устойчивые к бактериофагу. Важно, что размножение бактериофага возможно лишь в присутствии чувствительных к нему бактерий. После гибели последней микробной клетки в очаге инфекционного поражения он прекращает свою активную деятельность и бесследно выводится из организма.

В связи с наблюдаемым снижением терапевтического действия антибиотиков препараты бактериофагов используются в клинической практике как альтернатива антибиотикам и в сочетании с последними. Препараты бактериофагов не уступают антибактериальным препаратам по эффективности, стимулируют местные факторы специфического и неспецифического иммунитета и не вызывают при этом побочных токсических и аллергических реакций. Бактериофаги назначают внутрь, а также используют для орошения ран, для введения в дренированные полости — брюшную, плевральную, полости пазух носа, среднего уха, абсцессов, ран, матки, мочевого пузыря. При пероральном и аэрозольном применении, а также при нанесении на поверхность слизистых оболочек бактериофаги проникают в кровь и лимфу и выводятся через почки, санируя мочевыводящие пути.

В настоящее время возобновился интерес к фаготерапии в хирургии, урологии, офтальмологии, травматологии.

Лечебно-профилактические препараты бактериофагов составлены из поликлональных вирулентных бактериофагов широкого диапазона действия, активных и в отношении бактерий, устойчивых к антибиотикам. Их выпускают в жидком виде, в таблетках с кислотоустойчивым покрытием, в виде свечей, мазей, линиментов.

Препараты бактериофагов представляют собой стерильный фильтрат бактериальных фаголизатов, их назначают внутрь, местно для орошения ран и слизистых, введения в полости матки, мочевого пузыря, уха, придаточных пазух, а также в дренированные полости — брюшную, плевральную, а также в полости абсцессов после удаления экссудата.

Бактериофаги способны быстро проникать в кровь и лимфу и выводятся через почки с мочой. Как показано в наших исследованиях, после приема 30 мл бактериофага уже через 2 часа фаговые частицы обнаруживаются в моче, а максимальная концентрация их в моче достигается через 6−8 часов после приема.

Активность лечебно — профилактических бактериофагов в отношении возбудителей гнойно-септических и энтеральных заболевании достаточно высока — от 72% до 90%, в том числе и в отношении штаммов госпитального происхождения, характеризующихся множественной устойчивостью к антибиотикам. Соответствие препаратов бактериофагов современной атиологической структуре возбудителей достигается их постоянной адаптацией к циркулирующим штаммам за счет обновления фаговых рас и производственных бактериальных штампов. Эта особенность выгодно отличает фаги от других антимикробных препаратов — антибиотиков, эубиотиков или вакцин, где производственные штаммы или штаммы-продуценты, или синтезированное вещество не подлежат каким-либо модификациям. Такая пластичность бактериофаговых препаратов обеспечивает продолжение первичной фагоустойчивости возбудителей.

Преимущества бактериофаговых препаратов.

К преимуществам бактериофаговых препаратов относятся узкая специфичность действия, не вызывающая, в отличие от антибиотиков, угнетения нормальной микрофлоры. Доказано стимулирующее действие стафилококкового бактериофага на бифидобактерии — важнейший компонент микробиоценоза кишечника. Использование бактериофагов для лечения инфекционных заболеваний стимулирует факторы специфического и неспецифического иммунитета, что особенно эффективно для лечения хронических воспалительных заболеваний на фоне иммунодепрессивных состояний, бактерионосительства.

Экспериментальными работами и длительными клиническими наблюдениями доказана невозможность передачи плазмид устойчивости к антибиотикам и токсигенности лечебно-профилактическими препаратами бактериофагов, потому что они являются поликлональными комплексами вирулентных бактериофагов.

В России, в странах СНГ, Польше, Франции, Испании бактериофаги широко используются в медицине и ветеринарии. Накоплен большой опыт использования бактериофагов в лечении кишечных инфекций: показана высокая клиническая эффективность фаготерапии острой и хронической дизентерии, сальмонеллезов, сопровождающихся санацией носителей. Доказана высокая эпидемиологическая эффективность профилактического применения дизентерийного, брюшнотифозного и сальмонеллезного бактериофагов, В контролируемых эпидемиологических опытах, проводившихся в дошкольных учреждениях и на промышленных предприятиях, установлено снижение уровня заболеваемости в 3 — 6 раз. Использование бактериофагов выявило хорошие результаты при лечении заболеваний, вызванных условно — патогенными бактериями, дисбактериозов, гнойных поражений кожи, ЛОР — органов, опорно-двигательного аппарата, мочеполовой системы, систем органов кровообращения и дыхания, в том числе у новорожденных и детей первого года жизни.

Важным условием, обеспечивающим результативность лечения фаговыми препаратами, является определенная фагочувствительность возбудителя.

Нагляден продолжительный опыт фаготерапии в НИИ урологии; в результате адаптации в НПО «Биофаг» коммерческих бактериофагов к госпитальным штаммам, циркулирующим в урологической клинике, фагочувствительность штаммов повысилась на 15% и находилась на уровне и выше чувствительности к самым современным зарубежным антибиотикам. На фоне длительного использования бактериофагов в стационаре среди госпитальных штаммов не наблюдалось формирования фагоустойчивости, в то время как резистентность к антибиотикам уменьшалась. Клиническая эффективность фаготерапии наблюдалась в 92% случаев, зачастую превосходя результаты антибиотикотерапии. Отсутствие противопоказаний и осложнений при применении препаратов бактериофагов, возможность их использования в сочетании с другими лекарственными препаратами, в том числе и с антибиотиками, активность в отношении антибиотико — резистентных штаммов и адаптация бактериофагов к современным возбудителям — все это позволяет оценить препараты бактериофагов как высокоэффективное и перспективное средство экстренной терапии гнойно — септических и энтеральных инфекций. Однако фаги, эти «природные санитары», могут быть использованы не только для лечения, но и для профилактики инфекционных заболеваний. Их можно назначать беременным, кормящим матерям и детям любого возраста, включая недоношенных. Основным условием их успешного применения является проверка выделенной культуры на чувствительность к соответствующему фагу. Отмечена удивительная закономерность: в отличие от антибиотиков, чувствительность клинических штаммов микроорганизмов к бактериофагам стабильна и имеет тенденцию к росту, что можно объяснить обогащением лечебных препаратов новыми расами фагов. Помимо медицинского применения, бактериофаги широко используются в ветеринарии; особенно эффективен стафилококковый бактериофаг при лечении маститов у коров. Препараты бактериофага назначают внутрь при заболеваниях внутренних органов либо местно, непосредственно на очаг поражения. Действие фага проявляется уже через 2−4 часа после его введения (что особенно важно в условиях реанимации). Бактериофаги проникают в кровь, лимфу и выводятся через почки, санируя мочевыводящие пути.

Таким образом, бактериофаги используют:

· в ветеринарии для:

­ профилактики и лечения бактериальных заболеваний птиц и животных;

­ лечения гнойно-воспалительных заболеваний слизистых глаз, полости рта;

­ профилактики гнойно-воспалительных осложнений при ожогах, ранениях, операционных вмешательствах;

· в генной инженерии:

­ для трансдукции — естественной передачи генов между бактериями;

­ как векторы, переносящие участки ДНК;

­ с помощью фагов можно конструировать направленные изменения в геноме хозяйской ДНК;

· в пищевой промышленности:

­ в массовом порядке фагосодержащими средствами уже обрабатывают готовые к употреблению продукты из мяса и домашней птицы;

­ бактериофаги применяют в производстве продуктов питания из мяса, мяса птицы, сыров, растительной продукции, и пр.;

· в сельском хозяйстве:

­ распыление фагопрепаратов для защиты растений и урожая от гниения и бактериальных заболеваний;

­ для защиты скота и птицы от инфекций и бактериальных заболеваний;

· для экологической безопасности:

­ антибактериальная обработка семян и растений;

­ очистка помещений пищеперерабатывающих предприятий;

­ санитарная обработка рабочего пространства и оборудования;

­ профилактика помещений больниц;

­ проведение экологических мероприятий. 5,6,8,9,10,11,12]

Заключение

Развитие естествознания необычайно расширило представления человека об окружающем его мире. Мир невидимых живых существ — микроорганизмов, хранит ещё много тайн, познать которые очень важно для человечества.

Вирусология — быстро развивающаяся отрасль современной биологии. Её теоретическое и практическое значение для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства — огромно. На вирусах изучаются вопросы генетики микробов и актуальные проблемы биохимии. Учёные всё более глубоко и успешно познают тончайшую структуру, биохимический состав и физиологические свойства этих ультрамикроскопических живых существ, их роль в природе, жизни человека, животного и растений. Развитие вирусологии связано с блестящими успехами молекулярной генетики. Изучение вирусов привело к пониманию тонкой структуры генов, расшифровки генетического кода, выявлению механизмов мутации. Вирусы широко применяются в работах генной инженерии. Способность вирусов приспосабливаться, вести себя непредсказуемо — не знает предела.

Миллионы людей стали жертвами вирусов — возбудителей различных болезней. И всё — таки основные успехи вирусологии достигнуты в борьбе с конкретными болезнями и это даёт основание утверждать, что в нашем третьем тысячелетии вирусология займёт ведущее место.

1. Мегаэнциклопедия: http://mega.km.ru.

2. А. А. Воробьёв, А. С. Быков. Е. П. Пашков, А. М. Рыбакова. Микробиология. Москва «Медицина». 1998.

3. Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Пол ред. В. В. Теца. Москва «Медицина». 2002.

4. А. И. Коротяев, А. И. Бабичев. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник для мед. Вузов. СПб: СпецЛит. 2002.

5. Научно-практический журнал «Урология» № 6, ноябрь-декабрь 2005.

6. Фармацевтический вестник. Статья М. Каменевой канд. биол. наук, старшего микробиолога отделения дифтерийных анатоксинов и бактериофагов НПО ''Биомед'' на сайте http://www.rusmg.ru .