Закономерности функционирования АТР-зависимой Lon-протеиназы E. coli и ее мутантных форм

Функционирование иротеолитических ферментов внутри клетки направлено на поддержание гомеостаза. Условно можно выделить две основные функции протеиназ, имеющие существенное значение для жизнеспособности организмов: регуляторную и деструктивную.

В первом случае протеолитические ферменты осуществляют процессинг белков и контроль содержания в клетке регуляторных белков.

Во втором случае протеолиз позволяет устранять нефункциональные «балластные» белки, образующиеся, например, при случайной ошибочной экспрессии генов, в результате временного пребывания организма под влиянием общих факторов стресса (биохимическое голодание, экстремальные значения температуры, повреждающее излучение, химическое воздействие и т. п.), или чужеродные белки. Деструктивный протеолиз носит «защитный» характер и направлен на обеспечение организма аминокислотным и пептидным материалом.

Установлено, что ключевую роль при внутриклеточном протеолизе играют энергозависимые ферменты, сопрягающие протеолитическую активность с гидролизом АТР. Эти протеиназы отличаются достаточно сложной структурной организацией, выраженной субстратной селективностью и выполняют, по-видимому, комплексную функцию (проявляют свойства и деструктивных протеиназ и регуляторных).

Lon-протеиназа Е. coli — первый обнаруженный представитель АТР-зависимых протеиназ. Можно указать на следующие структурно-функциональные особенности этого фермента, отличающие его от классических протеиназ: (1) зависимость протеолиза от гидролиза АТР- (2) высокая селективность по отношению к белкам-мишеням- (3) процессивный характер деградации белков при отсутствии специфичности по отношению к расщепляемой пептидной связи- (4) наличие четвертичной структуры (гомоолигомер) — (5) локализация АТР-азиого и пептидгидролазного центра в пределах одной полипептадной цепи.

В настоящее время установлено, что ферменты, сопрягающие протеолитическую активность с АТР-азной (в том числе и Lon-протеиназы) широко представлены в клетках самых разнообразных организмов. В Е. coli обнаружено уже несколько АТР-зависимых иротеолитических ферментов.

Несмотря на относительные успехи в изучении функции этих ферментов на клеточном уровне методами биохимической генетики, основные молекулярноэнзимологические проблемы, общие для АТР-зависимых протеиназ, во многом не решены и представляют собой весьма актуальную научную задачу. Важное значение имеют вопросы, связанные с выяснением принципов узнавания этими ферментами своих субстратов (проблема селективности) и принципов сопряжения гидролиза АТР и протеолиза (проблема сопряжения).

В представляемой работе эти проблемы рассматриваются при исследовании функционирования in vitro Lon-протеиназы Е. coli.

Структура и функция АТР-зависимых протеиназ Е. coli (обзор литературы).

Внутриклеточный протеолиз играет важную роль в поддержании определенного уровня белка, необходимого живой клетае [1]. Можно выделить следующие группы белков, подвергающиеся внутриклеточной деградации:

1) нефункциональные (аномальные) белки (неправильно свернутые и мутантные белки, белки, синтезированные с аномальными аминокислотами, укороченные белки) — такие белки являются нестабильными и подвергаются быстрой деградации как у прокариот, так и у эукариот [1,2];

2) короткоживущие белки, необходимые клетке в течение ограниченного периода времени или при специфических метаболических условиях (примерами таких белков служат белки, выполняющие свои функции в условиях стресса [3]);

3) белки, «лишенные партнеров», стабильные в составе олигомерных комплексов отдельные субъединицы таких белков, образующиеся в результате недостаточного или избыточного биосинтеза, подвергаются быстрой деградации и считаются «условными субстратами» [4].

В цитозоле, ядре и митохондриях эукариотических клеток и в цитоплазме бактериальных клеток внутриклеточная деградация осуществляется главным образом мультимерными АТР-зависимыми протеиназами. Протеолитическая активность этих ферментов сопряжена с гидролизом АТР. Это свойство АТР-зависимых протеиназ выделяет их в особую группу протеолитических ферментов. Среди ферментов из прокариот наиболее исследованы Lonи С1р-протеиназы Е. coli [5]. У эукариот значительная часть внутриклеточного протеолиза осуществляется 26S протеасомными комплексами [6].

В представляемом обзоре обобщены сведения о структурной организации и основных свойствах энергозависимых ферментов внутриклеточной деградации белков, функционирующих в Escherichia coli.

В клетках Е. coli обнаружено несколько растворимых АТР-зависимых протеиназ [7−12]: Lon, ClpAP, ClpXP (сериновые протеиназы) и HslUV (или ClpYQ, каталитически активный остаток пептидгидролазного центра — треонин). Обнаружена также мембрано-связанная Zn-зависимая металлопротеиназа — FtsH (или Hfl В) [13].

В Lonи FtsH-протеиназах протеолитический и АТР-азный центры локализованы в одной полипептидной цепи, и эти ферменты функционируют как гомоолигомеры (иногда их относят к внутриклеточным белкам типа AAA.

ATPase Accosiated with a variety of cellular Activities).

ClpAP, ClpXP и HslUV (ClpYQ) относятся к типу протеиназ, связанных с шаперонами (Chaperon Linked Proteases), и представляют собой гетроолигомеры, состоящие из протеолитических (ClpP и HslV) и регуляторных (ClpA, ClpX и HslU) субъединиц. Регуляторные субъединицы (АТР-азы) обладают шапероноподобными свойствами.

In vivo АТР-зависимые протеиназы проявляют высокую селективность по отношению к своим белковым мишеням: Lon-протеиназа участвует в деградации белков SulA [14], RscA [15], N-белка фага X [16]- субстратами протеиназы ClpAP in vivo являются MazE [17] и некоторые гибридные белки, полученные на основе ß—галактозидазы [18]- ClpXP проявляет избирательность по отношению к О-белку фага X [10, 19], а также к ряду других белков [20−22]- одним из установленных субстратов FtsH является фактор с32 [13, 23].

Наряду с протеолизом, рассматриваемые протеиназы (по результатам исследования как in vivo, так и in vitro) могут осуществлять АТР-зависимое изменение конформации белков (белковое ремоделирование), функционируя, таким образом, подобно молекулярным шаперонам [24].

1. Сериновая Lon-протеиназа.

Ьоп (Ьа)-протеиназа из E. coli — исторически первая энергозависимая протеиназа [25−27], выделенная из экстрактов E. coli как фермент, требующий наличия АТР для деградации казеина [26]. Протеиназа La впоследствии была идентифицирована в работах [26, 27] как продукт гена Ion и получила название Lon-протеиназы.

Клонирование гена Ion и определение его структуры было осуществлено одновременно в лаборатории химии протеолитических ферментов Института б. иоорганичеек0Н, химви.¦.¦РАН-[28.]. и вл1абаратории,-проф^ АХ^. Goldberg^ США. .

29]. .".. 7^. «V :

Регуляторная последовательность гена Ion содержит—418-п.н. Структурная часть этого гена кодирует белок, состоящий из 784 аминокислотных остатков [28]. Анализ первичной структуры Lon-протеиназы с учетом данных о ее ферментативной активности позволил выдвинуть предположение о том, что субъединица Lon-протеиназы имеет функционально-доменную организацию [30] и состоит из центрального АТР-азного домена (A-домен), содержащего так называемые мотивы Уолкера, А и В, ответственные за продуктивную для гидролиза АТР координацию трифосфата нуклеотида и иона Mg2+ в АТР-азном центре [31]- С-концевого — протеолитического домена (Р-домен), включающего каталитически активный остаток серина 679 [32] (рис.1) — N-концевой часта (N-домен), вариабельной в подсемействе Ьоп-протеиназ.

1 107 566 784.

Мотив, А Мотив В.

Рис. 1. Схема строения Lon-протеиназы Escherichia coli. Показаны границы предполагаемых доменов, локализация мотивов, А и В Уолкера и фрагмента, включающего каталитический остаток серина.

По первичной структуре Ьоп-протеиназа не обнаруживает гомологии с другими известными протеиназами (в том числе и сериновыми). Молекула фермента представляет собой гомоолигомер, образованный субъединицами с молекулярной массой 87,4 кДа. Методом гель-фильтрации в препаратах Lon-протеиназы были обнаружены тетраи октамерные формы [33]. Физиологически активная форма Ьоп-протеиназы, вероятно, представляет собой тетрамер [34, 35]. Существуют наблюдения, свидетельствующие в пользу кооперативного функционирования активных центров фермента [33, 34].

Интересное и малоизученное свойство фермента — его способность связываться с ДНК [36]. Следует отметить, что впервые Ьоп-протеиназа была выделена именно как ДНК-связывающий белок [37], что, в свою очередь, позволило предположить ее участие в регуляции экспрессии генов. В работе [36] показано, что одноцепочечпая ДНК активирует протеолитическую и белок-активируемую АТР-азную активность ферментамРНК и тРНК не обладают таким действием [33]. В работе [38] установлено, что Ьоп-протеиназа специфически связывается с TG-богатыми участками нуклеотидной последовательности ДНК. Физиологическая роль связывания ДНК к настоящему времени не определена.

выводы.

1. Изучены кинетические аспекты функционирования Ьоп-протеиназы. Выявлена регуляторная роль свободных ионов Mg2+ - активатора протеолитической и пептидгидролазной активности фермента и ингибитора базовой АТР-азной активности (для физиологических концентраций АТР и магния). Показано, что активация гидролиза АТР при связывании белкового субстрата сопровождается устранением ингибирующего действия ионов Mg2+.

2. Получены и охарактеризованы формы Ьоп-протеиназы E. coli с мутациями в АТР-азном домене: K362Q, Т363А, D387N, D423N, Y493 °F. Установлено ключевое значение остатков К362 и Т363 из мотива, А Уолкера АТР-азного центра не только для катализа гидролиза АТР, но и для сопряжения гидролиза АТР и протеолиза. Показано, что остаток D387 не является каталитически активным, как было постулировано в литературе. Продемонстрировано формальное участие в системе передачи сигнала остатков D423 из мотива В Уолкера и Y493.

3. Выявлено отсутствие прямой корреляции между АТР-азной и пептидгидролазной активностями при функционировании как нативного фермента, так и его мутантных форм.

4. Подтверждено существование в Ьоп-иротеиназе дополнительного центра связывания белкового субстрата, локализованного вне протеолитического домена фермента.

5. Показано, что мутации в АТР-азном центре Ьоп-протеиназы понижают стабильность четвертичной структуры фермента. Высказано предположение о локализации АТР-азных центров в области контакта субъединиц.

6. Обнаружено, что ADP-Mg- (ингибитор нативной Ьоп-протеиназы) активирует пептидгидролазный центр в субъединице фермента, содержащего мутацию K362Q. Постулировано существование в нативном ферменте двух путей передачи сигнала ог АТР-азных центров к протеолитическим виутрисубъединичного и межсубъединичного.