В 1997 году впервые было показано, что в периферической крови взрослого человека существует популяция клеток, способная пролиферировать и дифференцироваться в эндотелиальные клетки in vitro [Asahara T. et al., 1997]. Эти клетки характеризуются наличием на их поверхности таких маркеров, как CD34, VEGFR2 и CD 133. CD34 — маркер, характерный для недифференцированных клеток гематопоэтического ряда и капиллярного эндотелия. VEGFR2 — рецептор к фактору роста сосудистого эндотелия, называемый также KDR (kinase-insert domain-containing receptorрецептор, содержащий киназный домен) — он специфичен для эндотелиальных клеток. CD 133 — трансмембранный гликопептид, экспрессирующийся на гематопоэтических стволовых клетках и предшественниках эндотелиальных клеток, а также нейроэпителиальных клетках, клетках почечного эпителия и опухолевых клетках [Asahara T. et al., 1997; Barber C.L. et al., 2006]. Предшественники эндотелиальных клеток (ПЭК) были выделены также из костного мозга, сосудистой стенки и некоторых других органов и тканей [Doyle В. et al., 2006]. Позднее было продемонстрировано, что фракция CD34+ клеток содержит в малом количестве клетки, способные как in vitro, так и in vivo приобретать не только эндотелиальный фенотип, но и фенотип кардиомиоцита, гладкомышечной клетки [Simper D. et al., 2002; Badorff С. et al., 2003; Yeh E.T.H. et al., 2003]. В экспёриментальных работах на животных было показано, что ПЭК привлекаются в места сосудистого повреждения, в частности, после баллонной ангиопластики [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004a], и значительно ускоряют реэндотелизацию области повреждения. Базальный уровень этих клеток в кровотоке невелик, но он многократно возрастает при введении цитокинов и ростовых факторов, а также при воспалительной реакции и физической нагрузке [Laufs U. et al., 2004аRehman J. et al., 2004]. В экспериментальных и единичных клинических работах показано участие ПЭК в процессах неоваскуляризации [Asahara T. et al., 1999аShintani S. et al., 2001].
Известно, что в основе острого коронарного синдрома (ОКС) лежит эрозия эндотелиального слоя на поверхности атеросклеротической бляшки коронарной артерии или разрыв бляшки с последующим образованием тромба. Так как ПЭК участвуют в репарации эндотелия, с одной стороны, уменьшение их количества в кровотоке и/или нарушение их функциональных свойств могут являться предрасполагающим фактором возникновения эндотелиального повреждения, а с другой стороны, патогенетически может быть обосновано их введение при необходимости ускорения эндотелизации внутрисосудистого повреждения. Поэтому в ведущих лабораториях мира идет активное изучение роли различных популяций циркулирующих недифференцированных клеток в патогенезе различных заболеваний сердца и сосудов. Установлено, что число ПЭК в периферической крови здоровых лиц снижено при наличии факторов риска ишемической болезни сердца (ИБС) [Vasa М. et al., 2001bHill J.M. et al., 2003]. В то же время при острой ишемии конечности или миокардиальной ишемии, индуцированной физической нагрузкой, а также при остром инфаркте миокарда с зубцом Q отмечается увеличение количества клеток-предшественников в системном кровотоке [Takahashi Т. et al., 1999; Shintani S. et al., 2001; Adams V. et al., 2004]. Функциональные характеристики этих клеток: их способность пролиферировать, мигрировать, формировать сосудоподобные структуры in vivo и восстанавливать перфузию ишемизированной конечности — снижены у больных ИБС, перенесших трансмуральный инфаркт миокарда [Heeschen С. et al., 2004]. Однако, несмотря на большое количество исследований и интенсивное накопление экспериментальных и клинических данных, до сих пор нет однозначного мнения как об изменениях числа ПЭК у больных с различными формами ИБС, так и об их роли в неоваскуляризации и репарации поврежденного эндотелия.
Целью данной работы явилось исследование количества циркулирующих клеток-предшественников у пациентов с острым коронарным синдромом без подъема сегмента ST и пациентов со стабильной стенокардиейнапряжения, подвергшихся коронарной ангиопластикесопоставление числа циркулирующих клеток-предшественников с концентрацией ангиогенных факторов роста в крови, факторами риска сердечно-сосудистых осложнений, выраженностью коронарного атеросклероза и медикаментозной терапией.
В работе были поставлены следующие задачи:1. Определить количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стенокардией напряжения и больных с острым коронарным синдромом без подъема сегмента 8 Т.
2. Исследовать влияние коронарной ангиопластики на количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стабильной стенокардией напряжения.
3. Сопоставить количество циркулирующих клеток-предшественников с концентрацией ангиогенных факторов роста в крови.
4. Оценить взаимосвязь численности клеток-предшественников в крови с факторами риска сердечно-сосудистых осложнений.
5. Сопоставить количество циркулирующих клеток-предшественников с выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий у больных ИБС и объемом эндоваскулярного вмешательства у больных со стенокардией напряжения.
6. Оценить взаимосвязь числа клеток-предшественников в периферической крови с медикаментозной терапией.
Научная новизнаВпервые установлено снижение количества циркулирующих клеток-предшественников у больных ИБС, как стабильного, так и нестабильного течения, по сравнению с лицами, имеющими лишь факторы риска ишемической болезни сердца. Показано, что коронарная ангиопластика сопровождается снижением количества клеток-предшественников в крови через 1 сутки после вмешательства с последующим восстановлением их числана 3−5 сутки. Впервые установлено, что количество циркулирующих клеток-предшественников положительно коррелирует с концентрацией фактора роста гепатоцитов в крови и объемом эндоваскулярного вмешательства у больных ИБС стабильного течения.
Практическая значимостьПолученные данные свидетельствуют об участии циркулирующих клеток-предшественников в процессах репарации внутрисосудистого повреждения, что обосновывает перспективность разработки методов терапевтического применения циркулирующих клеток-предшественников для ускорения регенерации эндотелия после эндоваскулярных вмешательств у больных ишемической болезнью сердца.
Заключение
.
Роль клеток-предшественников костномозгового происхождения в репаративных процессах в сердечно-сосудистой системе, открытая в последние годы, позволяет по-новому взглянуть на механизмы репарации сосудистого повреждения и механизмы реваскуляризации ишемизированных тканей.
Предшественники эндотелиальных клеток способны аккумулироваться в участке повреждения сосуда, дифференцироваться в зрелые эндотелиальные клетки и участвовать в процессах репарации и формирования новых сосудов в ишемизированных тканях [Asahara T. et al., 1997; Gehling U.M. et al., 2000; Kong D. et al., 2004а]. В экспериментальных исследованиях показано, что ретрансплантация ауто логичных циркулирующих ПЭК, предварительно культивированных in vitro, животным после ангиопластики значительно ускоряет реэндотелизацию области повреждения и препятствует избыточной пролиферации неоинтимы и развитию посттравматического стеноза [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004b]. Клетки-предшественники, аккумулирующиеся в области ишемии или повреждения, секретируют факторы роста, действующие на соседние зрелые сосудистые эндотелиальные клетки и стимулирующие их пролиферацию и миграцию [Asahara T. et al., 1999аKamihata H. et al., 2001]. Причем этот механизм действия ПЭК, возможно, даже более важен для процессов репарации и реваскуляризации, чем процесс пролиферации и дифференциации самих предшественников. Данные исследования демонстрируют терапевтический потенциал этих клеток в репарации сосуда. Первый опыт применения клеток-предшественников с терапевтической целью продемонстрировал безопасность их использования при наблюдении сроком до полутора лет. Численность и функциональная активность клеток-предшественников, в том числе предшественников эндотелиальных клеток, уменьшается под воздействием сердечно-сосудистых факторов рискаколичество циркулирующих ПЭК негативно коррелирует с функциональными индексами эндотелиальной функции (реактивностью плечевой артерии), что указывает на их важную роль в обеспечении функции сосудистого эндотелия [Hill J.M. et al., 2003]. Таким образом, число клеток-предшественников в кровообращении может представлять собой новый фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний и осложнений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Характеристика лиц, участвовавших в исследовании.
В исследование было включено 60 человек: 22 больных с ОКС без подъема сегмента ST, 20 больных со стенокардией напряжения II-III ф.к., и 18 лиц, составивших контрольную группу.
В группу больных с ОКС без подъема сегмента ST включались пациенты (мужчиныженщины в менопаузе) с ангинозным приступом, возникшим в течение последних 24 часов и сопровождавшимся изменениями ЭКГ (стенокардия покоя III В класса по классификации Е. Braunwald) [Hamm C.W., Braunwald E., 2000]. В группу больных со стабильным течением ИБС были включены пациенты со стабильной стенокардией напряжения II-III функционального класса по NYHA, у которых толерантность к физическим нагрузкам не менялась на протяжении как минимум 1,5 месяцев, направляемые по показаниям на коронарную ангиопластику со стентированием. Взятие крови осуществлялось до проведения коронарной ангиопластики, через день и на 3−5 сутки после процедуры. В контрольную группу вошли лица, сопоставимые по возрасту и полу, имеющие факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний без клиники ИБС и не имеющие критериев исключения. Критерии исключения:
• возраст моложе 40 и старше 70 лет;
• крупноочаговый инфаркт миокарда в острой и подострой стадиях;
• операция коронарного шунтирования или имплантация стента с лекарственным покрытием в анамнезеимплантация стента без лекарственного покрытия в последние 6 месяцев;
• острое нарушение мозгового кровообращения;
• поражение периферических артерий нижних конечностей с перемежающейся хромотой и трофическими нарушениями;
• сахарный диабет;
• наличие хронической сердечной, хронической почечной или печеночной недостаточности;
• плохо поддающаяся медикаментозной коррекции артериальная гипертония (АД выше 180/100 мм рт.ст.) на фоне комплексной гипотензивной терапии;
• пороки сердца;
• эндокардит, миокардит, перикардит, гипертрофическая или дилатационная кардиомиопатия;
• онкологическое заболевание;
• тяжелые бронхообструктивные, гематологические, неврологические, эндокринные заболевания;
• системные заболевания (васкулиты, ревматизм в анамнезе, системная красная волчанка и т. д.);
• клинические и лабораторные признаки острого инфекционного заболевания в течение 2 предшествующих месяцев;
• анемия (гемоглобин менее 10,0 г/дл);
• отказ от участия в исследовании.
Основные клинические характеристики групп представлены в таблицах 2,.
Табл. 2. Характеристика лиц, включенных в исследование.
ОКС без подъема сегмента 8 Т, п=22 Стенокардия напряжения, п=20 Контроль, п=18.
Возраст, лет 56,8 ± 1,8* 54,4 ± 1,6 50,7 ± 1,6 р=0,04.
Мужчины, % 73 90 89 р=0,24.
Курящие, % 50 25 39 р=0,25.
Продолжение табл. 2.
Артериальная гипертония, % 82. 65 67 р=0,41.
Перенесенный инфаркт миокарда в анамнезе, % 18 40 р=0,18.
ТБКА/КШ1 в анамнезе, % 0/0 10/0 р=0,22.
Гиперхолестеринемия2, % 82 85 50 р=0,02.
Индекс массы тела, кг/м2 27,6 ± 0,7 28,2 ± 0,7 29,4 ± 1,1 р-0,35.
Фракция выброса левого желудочка, % 58 ± 1 59 ± 1 61 ± 1 р=0,06.
Гемодинамически значимые стенозы б/ц0 артерий или артерий ПБС4 (по данным УЗДГ5), % 9 10 0 р=0,40.
Глюкоза, ммоль/л 5,3 ±0,1 5,5 ±0,1 5,2 ±0,1 р=0,07.
СОЭ, мм/час 8 ± 1 8 ± 1 4 ± 1 р=0,05.
С-РБ, мг/л 3,27 ± 0,63 2,00 ± 0,58 1,95 ± 0,69 р=0,16.
Гомоцистеин, мкмоль/л 12,39 ±0,82 10,67 ± 0,43 11,94 ±0,57 р=0,20.
Примечание: * - здесь и далее данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего-1 — коронарное шунтирование-2 — гиперхолестеринемия — общий холестерин >5,2 ммоль/л-3 — брахиоцефальные- 4 — подвздошно-бедренный сегмент-5 — ультразвуковая допплерография.
Контрольная группа в нашем исследовании была несколько моложе, статистически значимо по сравнению с группой ОКС и не значимо по сравнению с группой больных со стенокардией напряжения. Тем не менее, к настоящему моменту не проводилось масштабных популяционных исследований, которые могли бы продемонстрировать значимость разницы в несколько лет у лиц данного возраста. В контрольной группе был меньше процент лиц с гиперхолестеринемией независимо от получаемой терапии.
Табл. 3. Ангиографические характеристики групп.
ОКС без подъема сегмента 8 Т, п=22 Стенокардия напряжения, п=20.
Выполнение КАГ1, % 82 100 Р=0,11.
0/½/3-сосудистое поражение, % 11/33/17/39 0/35/55/10 р=0,03.
Значимое поражение ствола Л1СА/ПНА/ОА/ПКА2, % 0/78/61/44 0/85/40/50 р=0,63.
Число значимо пораженных сегментов на 1 больного 3,0 ±0,5 2,4 ± 0,3 р=0,65.
Эндоваскулярное лечение, % 50 100 р=0,01.
Среднее число имплантированных стентов 1,6 ±0,2 1,6 ±0,2 р=1,00.
Коронарное шунтирование, % 18 0 р=0,11.
Примечание: 1 — коронароангиография- 2 — левая коронарная артерия, передняя нисходящая артерия, огибающая артерия, правая коронарная артерия.
По ангиографическим характеристикам группы ОКС и стабильной стенокардии сходны между собой. И хотя в группе ОКС больше больных с трехсосудистым поражением коронарного русла, а в группе стенокардии напряжения — с двухсосудистым, по числу гемодинамически значимо.
пораженных сегментов коронарных артерий в расчете на 1 больного группы значимо не различаются.
Табл. 4. Медикаментозная терапия больных.
ОКС без подъема сегмента ST, п=22 Стенокардия напряжения, п=20.
Аспирин 91% 100% р=0,49.
Клопидогрель 77% 100% р=0,05.
Гепарин 45% 0 р=0,01.
Статины 32% 70% р=0,03.
Р-адреноблокаторы 86% 100% р=0,23.
Ингибиторы АПФ 41% 45% р=0,96.
Нитраты 59% 30% Р=0Д1.
Антагонисты кальция 5% 5% р=1,00.
В группе больных со стенокардией напряжения большее число больных получали клопидогрель и статины и никто не получал гепарин. Влияние клопидогреля и гепарина на количество ПЭК в кровотоке к настоящему моменту не исследовано. Статины же обладают протективным действием по отношению к численности и функциональным способностям ПЭК [Dimmeler S. et al., 2001; VasaM. et al., 2001a].
Из 22 больных с ОКС без подъема сегмента ST девяти впоследствии на основании содержания в крови биохимических маркеров некроза миокарда был выставлен диагноз мелкоочагового острого инфаркта миокарда, а тринадцатидиагноз нестабильной стенокардии. У 45% больных с ОКС ангинозный приступ развился впервые в жизни. Длительность анамнеза ИБС у остальных 55% больных составила 2,1 ± 0,8 лет. В среднем взятие крови происходило через 12±2 часа от момента начала ОКС. Среди 20 больных со стабильной стенокардией у 70% был определен II функциональный класс стенокардии.
напряжения, у 30% - III. Средняя продолжительность анамнеза ИБС в данной группе составила 3,2 ± 0,7 лет.
Получение образцов крови.
Анализ мембранной экспозиции CD45, CD34, VEGFR2 в.
лейкоцитарной фракции.
Связывание антител с клетками измеряли методом цитофлюориметрии в потоке на приборе «FACSCalibur» (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения «CellQuest» и «WinMDI», анализируя 300−500 тысяч событий для каждого образца. Параметры настройки прибора были одинаковы для всех измерений. Лейкоциты выделяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния, клетки с экспрессией CD34 и VEGFR2 выделяли из популяции CD45low/" клеток (см. рис. 3, 4).
Рис. 3. Выделение фракции CD450W клеток среди лейкоцитов (SSC (sideward scatter) — боковое светорассеяние).
Контроль.
С034+УЕСЕ]*2;
СБ34+УЕСРШ+.
СВ34+УЕСЕЯ2- С034+УЕСРИ2+.
у •. ¦
Ю2 у.е.ЭРР?2.
Рис. 4. Выделение СБ34+УЕСГК2 и СБ34+УЕСЕЫ2+ клеток из популяции.
С0451,т/ клеток>
Для определения общего числа С034-позитивных клеток количество CD34+VEGFR2″ и CD34+VEGFR2+ клеток суммировалось.
Таким образом, для каждого пациента было определено число CD45, ow/ CD34 VEGFR2 и суммарное количество CD45, ovv/" CD34+ клеток в пересчете на 1 миллион лейкоцитов.
Анализ содержания ростовых факторов, С-реактивного белка и.
гомоцистеина в сыворотке крови.
Анализ содержания VEGF, HGF и эндостатина в сыворотке крови осуществлялся иммуноферментным методом. Концентрация VEGF определялась с помощью набора Human VEGF Quantikine® ELISA kit (R&D Systems Inc., США), концентрация HGF — набором фирмы «BioSource International, Inc.», США, а концентрация эндостатина — набором Human Endostatin Quantikine® ELISA kit (R&D Systems Inc., США). Анализ сыворотки на содержание VEGF был осуществлен у 22 больных с ОКС без подъема сегмента ST, у 20 больных со стенокардией напряжения до и после коронарной ангиопластики и у 16 лиц контрольной группы. Определение концентрации HGF было выполнено у 15 больных с ОКС без подъема сегмента ST, у 20 больных со стенокардией напряжения до и после коронарной ангиопластики и у 16 контрольных лиц. В связи с терапией гепарином, который приводит к быстрому значительному повышению концентрации фактора роста гепатоцитов в крови [Seidel С. et al., 1999], у 7 больных с ОКС определение «истинного» содержания HGF в крови не представлялось возможным. Концентрация эндостатина была определена у 11 больных с ОКС без подъема сегмента ST, у 19 больных со стенокардией напряжения и у 7 контрольных лиц.
Концентрация С-РБ в сыворотке крови определялась высокочувствительным нефелометрическим методом на приборе «BN ProSpec», Dade-Behring Marburg GmbH, Германия. Содержание гомоцистеина в сыворотке.
крови измеряли иммуноферментным методом с помощью набора «Axis® Homocysteine EIA», Axis-Shield Diagnostics Ltd., Великобритания.
Статистический анализ.
Данные представлены в виде среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Для определения значимости различий между независимыми группами использовали непарный t-критерий Стьюдента при нормальном распределении и непараметрический тест Манна-Уитни в случае ненормального распределения. Для определения значимости различий между связанными выборками применяли парный t-критерий, а в случае ненормального распределения — критерий Уилкоксона. Для сравнения 3 и более групп использовали тест ANOVA. Для сравнения групп по номинативным признакам использовался точный критерий Фишера и критерий Для нахождения корреляции между количеством клеток и концентрацией ангиогенных ростовых факторов при нормальном распределении данных использовался коэффициент Пирсона, а при ненормальном распределении — коэффициент Спирмена. Во всех случаях нормальность распределения проверялась критерием Колмогорова-Смирнова. Статистическая обработка данных производилась при помощи программных пакетов «SigmaStat» и «Microsoft Excel».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Циркулирующие клетки-предшественники у больных ОКС без подъема сегмента 8 Т и больных хронической ИБС.
Общее количество циркулирующих клеток-предшественников (С034±клеток) было снижено на 38% (173±14 уэ. 280±29 клеток на 1 миллион лейкоцитов, р=0,01) у больных ОКС без подъема сегмента 5 Т и на 26% (206±23 ув. 280±29 клеток на 1 миллион лейкоцитов, р=0,05) у больных со стабильной стенокардией по сравнению с их количеством в контрольной группе (см. рис. 5). Разница между группами ОКС и стабильной стенокардии напряжения не достигла уровня статистической значимости, р=0,22. Число лейкоцитов в крови в исследуемых группах достоверно не отличалось (см. рис. 6).
о си X.
Рис. 5. Количество С034-позитивных клеток в периферической крови больных ОКС без подъема сегмента 8 Т, больных со стенокардией напряжения и контрольных лиц.
г Г — р=0,05 р=0,01 1.
— г;
Контроль ОКС Стен. напр.
Рис. 6. Количество лейкоцитов в крови исследуемых.
Из 22 больных с ОКС без подъема сегмента 8 Т девяти на основании содержания в крови биохимических маркеров некроза миокарда был выставлен диагноз мелкоочагового острого инфаркта миокарда, а тринадцати — диагноз нестабильной стенокардии. При сравнении данных групп было выявлено достоверное снижение количества С034+ клеток в крови у больных острым мелкоочаговым инфарктом миокарда на 36% по сравнению с больными нестабильной стенокардией (см. табл. 5). Однако поскольку число СОЭ4 клеток рассчитывалось в пересчете на 1 миллион лейкоцитов, наличие достоверно более высокого числа лейкоцитов в крови у больных острым мелкоочаговым инфарктом миокарда не позволяет исключить то, что разница, по крайней мере, частично может быть обусловлена разным содержанием лейкоцитов в крови.
ллн/мл.
Контроль.
Стен. напр.
Табл. 5. Количество СБ34+, СБ34+УЕСРЯ2+ клеток в кровотоке у больных нестабильной стенокардией и мелкоочаговым инфарктом миокарда.
Количество CD34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество CD3 4+VEGFR2+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл.
Нестабильная стенокардия, п=13 202 ± 16 7 ±2 6,45 ±0,41.
Мелкоочаговый инфаркт миокарда, п=9 130 ± 19 4± 1 8,71 ± 0,65.
р=0,01 р=0,28 р=0,01.
Снижение общего пула CD34+ клеток у больных ИБС может, с одной стороны, свидетельствовать о повышенном привлечении данных клеток в области эндотелиального повреждения и ишемии и их участии в процессе репарации и неоваскуляризации. А с другой стороны, основываясь на результатах работ Aicher А. [2003, 2005], можно предположить, что снижение числа CD34+ клеток у больных ИБС обусловлено нарушением процесса мобилизации клеток-предшественников из костного мозга. Мы считаем, что первый механизм, скорее всего, объясняет снижение числа циркулирующих клеток-предшественников при остром повреждении сосудистой стенки и ишемии миокарда (например, при ОКС, коронарной ангиопластике), а второй, возможно, ответственен за это снижение у больных хронической стабильной ИБС.
Число предшественников эндотелиальных клеток (CD34+VEGFR2+ клеток) в периферической крови очень мало и составляет единичные клетки в расчете на 1 миллион лейкоцитов, что согласуется с данными литературы [Vasa М. et al., 2001аRabelink T.J. et al., 2004]. Достоверных различий в количестве циркулирующих предшественников эндотелиальных клеток между группами не выявлено (см. рис. 7).
Контроль.
Стен. напр.
Рис. 7. Количество СВ34+УЕСРН2+ клеток в периферической крови больных ОКС без подъема сегмента N1, больных со стенокардией напряжения и контрольных лиц.
У 10 из 22 больных ОКС без подъема сегмента ST ангинозный приступ развился впервые в жизни, у остальных — ОКС развился на фоне уже установленной ранее ИБС (длительность анамнеза 2,1 ± 0,8 лет). Предполагая, что на фоне существующей хронической ИБС на количество циркулирующих клеток-предшественников в крови могут оказывать влияние дополнительные факторы, например: нарушение мобилизации клеток-предшественников из костного мозга [Aicher A. et ai., 2003], повторные эпизоды ишемии миокарда [Adams V. et al., 2004], — мы сравнили численность CD34+ и CD34+VEGFR2+ клеток в крови данных подгрупп больных (см. табл. 6). Статистически значимых различий между подгруппами выявлено не было. Возможно, это обусловлено схожестью данных групп больных вследствие достаточно короткого анамнеза ранее установленной ИБС, а также приема лекарственных.
средств, улучшающих коронарный кровоток и снижающих число эпизодов миокардиальной ишемии.
Табл. 6. Количество СБ34 СБ34+УЕСГК2+ клеток в кровотоке у больных ОКС без подъема сегмента вТ с впервые в жизни возникшим ангинозным приступом и ОКС, развившимся на фоне существующей стабильной ИБС.
Количество С034+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл.
Ангинозный приступ развился впервые в жизни, п=10 160 ±20 5 ± 2 7,78 ± 0,74.
ОКС развился на фоне существующей ИБС, п=12 177 ± 21 7 ± 2 7,06 ± 0,54.
р=0,56 р=0,67 р=0,43.
Влияние коронарной ангиопластики со стентированием на количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стабильной стенокардией.
Коронарная ангиопластика сопровождается повреждением сосудистой стенки, эпизодами ишемии миокарда, поэтому мы исследовали количество циркулирующих клеток-предшественников у больных со стабильной стенокардией, направляемых по показаниям на проведение коронарной ангиопластики со стентированием: до процедуры, через 1 день (19,5±0,2 часа) и на 3−5 день (4,0±0,2 сут) после вмешательства. Внутрисосудистое повреждение, возникающее в процессе проведения коронарной ангиопластики со стентированием, у больных со стенокардией напряжения сопровождалось.
достоверным снижением общего пула предшественников на 21% (162=ЫЗ 206±23 клеток на 1 миллион лейкоцитов, р=0,03) через 1 сутки после процедуры (см. рис. 8).
ДоТБКА.
1 сут после ТБКА 3−5 сут после ТБКА.
Рис. 8. Влияние коронарного вмешательства на количество циркулирующих СЭ34+ клеток у больных со стенокардией напряжения.
Учитывая экспериментальные данные об участии циркулирующих клеток-предшественников в репарации эндотелия [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004a], можно предположить, что это снижение обусловлено их привлечением в область повреждения и участием в репаративном процессе в сосудистой стенке. К 3−5 суткам число клеток-предшественников восстанавливалось почти до исходного уровня. Количество ПЭК (CD34+VEGFR2+) в кровотоке уменьшалось на 40% через сутки после коронарного вмешательства, но изменения не достигли уровня статистической значимости (см. рис. 9).
До ТБКА 1 сут после ТБКА 3−5 сут после ТБКА.
Рис. 9. Влияние коронарного вмешательства на количество циркулирующих С034+УЕСГК2+ клеток у больных со стенокардией напряжения.
Не было установлено связи между количеством циркулирующих клеток-предшественников и распространенностью атеросклеротического поражения коронарного русла. Численность, как общего пула предшественников, так и ПЭК не различалась у больных с 1-, 2- и 3-сосудистым поражением коронарного русла (см. табл. 7).
Табл. 7. Количество СЭ344, С034+УЕСП12+ клеток в кровотоке у больных ИБС с.
различной степенью поражения коронарного русла поданным ангиографии.
Количество СП34″ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество С034″ УЕ0РЯ2″ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл.
Iсосудистое поражение, п= 15 186 ± 16 10 ± 3 7,76 ± 0,57.
Продолжение табл. 7.
2-сосудистое поражение, п=14 208 ±32 8 ± 2 6,55 ± 0,47.
3-сосудистое поражение, п=9 181 ±24 6 ± 2 6,65 ± 0,65.
р=0,73 р=0,93 р=0,22.
При сопоставлении количества циркулирующих клеток-предшественников с объемом интракоронарного вмешательства, а именно числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий, у больных со стабильной стенокардией напряжения через 1 сутки и через 3−5 суток после процедуры (см. табл. 8) мы обнаружили, что общее число клеток-предшественников в крови у больных стабильной ИБС через 3−5 суток после коронарного вмешательства негативно коррелирует с количеством эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий (см. рис. 10). То есть, чем большее количество сегментов коронарных артерий подвергалось ангиопластике, тем ниже был уровень клеток-предшественников в крови. Это может косвенным образом свидетельствовать о привлечении СБ34+ клеток в области внутрисосудистого повреждения.
Табл. 8. Корреляции между количеством циркулирующих клеток;
предшественников и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных.
артерий у больных стенокардией напряжения через 1 и 3−5 суток после коронарного вмешательства.
1 сутки после коронарного 3−5 суток после коронарного.
вмешательства, п=20 вмешательства, п=20.
СЪ34+ г=-0,34 г=-0,47.
р=0,14 р=0,04.
СЭЗ 4+УЕЮРК2+ г=-0,25 г=0,34.
р=0,29 р=0,14.
г=-0,47 р=0,04.
50 100 150 200 250 300 350 Число CD34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов.
Рис. 10. Корреляция между количеством циркулирующих СШ4+ клеток и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий у больных со стенокардией напряжения на 3−5 сутки после коронарного вмешательства.
В экспериментальных работах показано, что ПЭК участвуют в репарации эндотелия после повреждения, в том числе после баллонной ангиопластики [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004а]. Полученные данные о кратковременном снижении числа циркулирующих клеток-предшественников после ангиопластики и об отрицательной корреляции между количеством клеток-предшественников и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий хорошо согласуются с результатами экспериментальных работ и свидетельствуют об участии этих клеток в репаративных процессах в сосудистой стенке. Несмотря на существенное уменьшение числа циркулирующих клеток-предшественников через 1 сутки после коронарной ангиопластики, достоверной корреляции между количеством клеток;
предшественников в крови и числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий у больных со стенокардией напряжения выявлено не было. Данные результаты, возможно, обусловлены тем, что после коронарного вмешательства на численность циркулирующих клеток-предшественников, помимо эндотелиального повреждения, влияют также и другие факторы: устранение хронической миокардиальной ишемии, развитие локальной воспалительной реакции. Поэтому взаимосвязь между количеством клеток-предшественников в крови и объемом эндотелиального повреждения «проясняется» только через несколько суток.
Учитывая, что количество клеток-предшественников снижено у больных ИБС, можно предположить, что для усиления репаративных процессов (реэндотелизации) после ангиопластики и стентирования целесообразно введение предшественников эндотелиальных клеток, полученных из крови или костного мозга пациентов и наращенных in vitro до необходимого количества.
Циркулирующие клетки-предшественники и факторы ангиогенеза у больных ИБС.
Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в мобилизации клеток-предшественников из костного мозга участвуют ангиогенные факторы роста: фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и фактор роста гепатоцитов (HGF) [Asahara Т. et al., 1999bIshizawa К. et al., 2004]. Учитывая это, мы сопоставили количество циркулирующих клеток-предшественников с концентрацией VEGF и HGF в крови больных ИБС. Хотя отмечалась тенденция к увеличению концентрации данных ангиогенных факторов у больных ИБС по сравнению с контрольной группой, достоверных различий между группами мы не обнаружили (см. рис. 11, 12). Коронарная ангиопластика со стентированием не вызывала значимых изменений содержания VEGF и HGF в крови через 1 сутки и на 3−5 сутки после вмешательства (см. рис. 11, 12).
Контроль ОКС Стен. напр. 1 сут после 3−5 сут.
(до ТБКА) ТБКА после ТБКА.
п=16 п=22 п=20 п=20 п=20.
Рис. 11. Концентрация УЕСР в сыворотке крови.
Контроль ОКС Стен. напр. 1 сут после 3−5 сут.
(до ТБКА) ТБКА после ТБКА.
п=16 п=15 п—20 п=20 п=20.
Рнс. 12. Концентрация НвР в сыворотке крови.
В экспериментальных работах показано, что ингибитор ангиогенеза эндостатин, являющийся С-концевым фрагментом коллагена XVIII, стимулирует апоптоз эндотелиальных клеток, ингибирует эндотелизацию внутрисосудистого повреждения, препятствует мобилизации ПЭК из костного мозга, стимулируемой фактором роста сосудистого эндотелия [ОЬапаЬа! М. ех а!., 1999; НиПег Я. Ы а1., 2003; ВсЫсИ в. еХ а1., 2003]. В связи с этим у части больных мы определили содержание эндостатина в крови. Однако значимых различий между группами выявлено не было (см. рис. 13).
160 140 120 100 80 60 40 20 0.
1 р=0,24 р=0,86 р=0,23 -л.
Контроль п=7.
ОКС п—11.
Стен. напр. п=19.
Рис. 13. Концентрация эндостатина в сыворотке крови.
С целью определения взаимосвязи между концентрацией nEGF, НОИ и количеством клеток-предшественников в кровотоке нами были изучены корреляции между данными параметрами у больных ОКС, у больных со стенокардией напряжения и контрольных лиц (см. табл. 9).
Табл. 9. Корреляции меяеду числом циркулирующих клеток-предшественников и концентрацией VEGF, HGF.
Контроль OKC без подъема сегмента ST Стенокардия напряжения.
VEGF HGF VEGF HGF VEGF HGF.
CD34+ r=-0,13 р=0,63 r=0,13 p=0,63 r=0,12 p=0,59 r=-0,02 p-0,93 r=-0,06 p=0,80 r=0,51 p=0,03.
CD34+VEGFR2+ r=0,05 р=0,84 r=0,19 P=0,47 r=-0,07 p=0,75 i=0,06 p=0,84 r=-0,15 p=0,53 r=0,43 p=0,07.
Несмотря на наличие большого количества данных о роли VEGF в мобилизации ПЭК из костного мозга [Kalka С. et al., 2000аMoore М.А. et al., 2001], мы не обнаружили достоверных корреляций между количеством клеток-предшественников и концентрацией VEGF в крови. В то же время количество циркулирующих клеток-предшественников достоверно положительно коррелировало с уровнем HGF (см. рис. 14), что согласуется с экспериментальными данными, показавшими способность фактора роста гепатоцитов мобилизовать предшественники эндотелиальных клеток из костного мозга [Ishizawa К. et al., 2004]. Схожая корреляция, не достигшая, однако, статистической значимости, наблюдалась между числом циркулирующих ПЭК и. концентрацией HGF у больных со стабильной стенокардией (см. рис. 15).
г=0,51 р=0,03.
0 100 200 300 400 500.
Число С034+ клеток на 1 млн. лейкоцитов.
Рис. 14. Корреляция между числом циркулирующих С034+ клеток и концентрацией ЬЮГ в сыворотке крови у больных со стенокардией напряжения.
к х 3″ ш а.
4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 Число С034+УЕ6РР2+ клеток на 1 млн. лейкоцитов.
Рнс. 15. Корреляция между числом циркулирующих С034″ УЕСРК2+ клеток и концентрацией НвГ в сыворотке крови у больных со стенокардией напряжения.
Показано, что введение эндостатина животным значительно снижало мобилизацию ПЭК фактором роста сосудистого эндотелия [БсЬисЬ О. е1 а1., 2003]. Однако в нашей работе достоверных корреляций между количеством циркулирующих клеток-предшественников и концентрацией эндостатина в крови выявлено не было (см. табл. 10), что может быть связано, в частности, с отсутствием значимых различий в концентрации УЕОБ между исследуемыми группами, а также недостаточным количеством больных, у которых мы определяли уровень эндостатина.
Табл. 10. Корреляции между числом циркулирующих клеток-предшественников и концентрацией эндостатина.
Контроль ОКС без подъема сегмента ST Стенокардия напряжения.
CD34+ г=0,71 г=0,46 г=0,07.
р=0,07 р=0,15 р=0,77.
CD34+VEGFR2+ г=0,56 г=0,36 г=-0,04.
р-0,19 р=0,27 р=0,87.
Циркулирующие клетки-предшественники и факторы риска сердечно-сосудистых осложнений у больных ИБС.
В настоящее время имеются данные о влиянии факторов риска сердечнососудистых осложнений (гиперхолестеринемии, ожирения, сахарного диабета 1 и 2 типа, курения, артериальной гипертонии) на различные популяции клеток-предшественников [Vasa М. et al., 2001аTepper О.М. et al., 2002; Hill J.M. et al., 2003; Chen J.Z. et al., 2004aLoomans C.J.M. et al., 2004; Fadini G.P. et al., 2006; Werner N. et al., 2006]. Однако в большинстве работ влияние факторов риска изучалось у людей без ишемической болезни сердца. В нашей работе мы сопоставили количество CD34+ и CD34+VEGFR2+ клеток в кровотоке с наличием факторов риска сердечно-сосудистых осложнений у лиц с.
верифицированной ИБС, а также определили корреляции с возрастом, концентрацией общего холестерина и триглицеридов в крови (см. табл. 11). Для увеличения достоверности оценки группа больных с ОКС без подъема сегмента ВТ и группа больных со стабильной стенокардией напряжения были объединены в группу больных с ИБС.
Табл. II. Сопоставление количества циркулирующих СЭ34+, СЭ34+УЕСЕЯ2+ клеток с наличием факторов риска сердечно-сосудистых осложнений у больных.
Фактор Количество С034″ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество С034+УЕСРЯ2+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл.
Пол мужской п=34 205 ± 15 9 ± 2 6,91 ±0,36.
женский п=8 120 ± 16 5 ± 2 7,45 ± 0,56.
Р 0,01 0,58 0,50.
Возраст, лет корреляция г=-0,26 р=0Д0 г=-0,О2 р=0,89.
Возрастная группа <55 лет п=21 194 ± 17 9 ± 2 7,02 ±0,51.
>55 лет п=21 183 ± 21 7 ± 1 7,01 ±0,35.
Р 0,66 0,74 0,98.
ИМ в анамнезе Нет п=30 185 ± 17 7 ± 2 7,17 ±0,39.
Да п=12 198 ±21 10±3 6,63 ± 0,45.
Р 0,67 0,20 0,43.
Курение Нет п=26 190 ± 16 10 ±2 6,23 ± 0,30.
Да п=16 186 ±23 5 ± 1 8,29 ± 0,50.
Р 0,87 0,24 0,01.
АГ Нет п=11 202 ±32 11 ±3 6,91 ±0,60.
Да п=31 184 # 14 7 ± 1 7,05 ± 0,36.
Р 0,57 0,29 0,84.
Ожирение Нет п=31 180 ± 16 9 ± 2 7,15 ±0,34.
Да п=8 221 ±32 5 ± 1 6,10 ±0,77.
Р 0,26 0,52 0,18.
Продолжение табл. 11.
гхс Нет п=7 197 ±21 10 ± з 6,82 ± 0,34.
Да п=35 187 ± 16 7 ± 2 7,05 ± 0,36.
Р 0,52 0,27 0,78.
охс, корреляция г=-0,10 г=-0,11.
ммоль/л р=0,53 р=0,49.
тг, корреляция г=-0,01 г=-0,22.
ммоль/л р=0,93 р=0,17.
Было установлено, что у женщин с ИБС общее число циркулирующих клеток-предшественников снижено почти в 2 раза по сравнению с мужчинами (р=0,01). При этом число лейкоцитов в крови у мужчин и женщин достоверно не различалось. Влияния других факторов риска (возраста, инфаркта миокарда в анамнезе, курения, артериальной гипертонии, ожирения, нарушения липидного обмена) на количество клеток-предшественников в кровотоке не обнаружено. При сопоставлении концентрации УЕвР и НОР у больных ИБС разного пола мы не обнаружили существенной разницы (см. табл. 12), хотя среднее значение концентрации НОР было у женщин на 15% ниже, чем у мужчин.
Табл. 12. Сопоставление концентрации HEGF и в сыворотке крови у.
больных ИБС разного пола.
УЕОР, пг/мл НОР, пг/мл.
Мужчины п=34 424 ± 54 п=27 1120± 136.
Женщины п=8 474± 140 п=7 973 ± 144.
р=0,88 р=0,77.
Выявленное значительное снижение количества СС)34+ клеток у женщин (почти в 2 раза) по сравнению с мужчинами оказалось зависимым также от возраста (см. табл. 13), вероятно, может быть связано с более высокой.
концентрацией общего холестерина в крови и, возможно, меньшим приемом статинов женщинами.
Табл. 13. Сравнительная характеристика мужчин и женщин с ИБС.
Мужчины, п=34 Женщины, п=8.
Возраст, лет 54,2 ± 1,3 62,0 ± 2,4 р=0,01.
Курящие, % 41 25 р=0,69.
Артериальная гипертония, % 71 88 р=0,66.
Индекс массы тела, кг/м2 27,8 ± 0,5 28,4 ± 1,4 р=0,63.
Гиперхолестеринемия, % 82 88 р=1,00.
Концентрация общего холестерина в крови, ммоль/л 5,57 ± 0,30 6,68 ±0,51 р=0,10.
Статины, % 56 25 р=0,24.
0/½/3-сосудистое поражение, % 3/37/40/20 13/25/25/37 р=0,48.
Число значимо пораженных сегментов на 1 больного 2,6 ± 0,3 2,9 ± 0,7 р=0,58.
При исследовании зависимости количества клеток-предшественников в кровотоке от функционального класса стенокардии у больных со стабильной стенокардией напряжения мы не выявили статистически значимых отличий между больными со 2 и 3 функциональным классом (см. табл. 14).
Табл. 14. Сопоставление количества циркулирующих клеток-предшественников.
у больных с различным функциональным классом стенокардии напряжения.
Количество СБ34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество СБЗ 4+УЕСР112+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл.
Функциональный класс 2 п=14 213 ±32 7 ± 3 6,57 ± 0,49.
3 п=6 190 ±23 15 ±6 6,73 ± 0,97.
р=0,66 р=0,23 р=0,88.
В настоящее время уровень С-РБ в крови рассматривается как дополнительный фактор сердечно-сосудистого риска. Считается, что умеренное повышение концентрации С-РБ в крови (не более 10 мг/л) отражает хроническое субклиническое воспаление сосудистого эндотелия, которое, в свою очередь, способствует развитию и прогрессированию атеросклероза [Pearson Т.A. et al., 2003; Szmitko Р.Е. et al., 2003].
Хотя средний уровень С-РБ в группе больных с ОКС без подъема сегмента ST был выше, чем у больных со стабильной стенокардией напряжения (соответственно 3,27 ± 0,63 мг/л и 2,00 ± 0,58 мг/л, р=0,10), статистически значимая разница между ними отсутствовала.
Для выявления возможного влияния хронического субклинического воспаления в сосудистой стенке на циркулирующие клетки-предшественники мы исследовали корреляции между их количеством и концентрацией С-РБ в сыворотке крови у больных ИБС (см. табл. 15). Кроме того, мы сравнили численность клеток-предшественников в кровотоке между группами низкого, среднего и высокого риска сердечно-сосудистых осложнений, разделенными на основании уровня С-РБ в сыворотке крови [Pearson T.A. et al., 2003] (см. табл. 16).
Табл. 15. Корреляции между числом циркулирующих клеток-предшественников.
и концентрацией С-реактивного белка в сыворотке крови.
ОКС без подъема Стенокардия Объединенная группа.
сегмента ST, напряжения, больных ИБС,.
п=22 п=20 п=42.
CD34+ г=-0,19 г=0,04 г=-0,14.
р=0,39 р=0,85 р=0,37.
CD3 4+VEGFR2+ г=-0,06 г=-0,39 г=-0,23.
р=0,78 р=0,09 р=0,15.
Табл. 16. Количество СБ34 СБ34+УЕСГЫ2+ клеток в кровотоке у больных ИБС различных групп риска, выделенных на основании уровня С-РБ в сыворотке крови.
Количество CD34+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Количество CD34+VEGFR2+ клеток на 1 млн. лейкоцитов Число лейкоцитов, млн/мл.
Низкий риск С-РБ < 1 мг/л, п=20 187 ± 18 10 ± 2 6,73 ± 0,39.
Средний риск 1 < С-РБ < 3 мг/л, п=10 183 ±27 7 ± 3 6,78 ± 0,64.
Высокий риск 3 < С-РБ < 10 мг/л, п=12 196 ±31 6± 1 7,68 ± 0,67.
р=0,94 р=0,54 р=0,40.
Значимых различий между группами риска и статистически значимых корреляций между численностью клеток-предшественников в кровотоке и концентрацией С-РБ в сыворотке крови выявлено не было.
В экспериментальных исследованиях in vitro было показано, что гомоцистеин снижает количество культивируемых ПЭК и негативно влияет на их способность к адгезии, пролиферации, миграции и ангиогенезу [Chen J.Z. et al., 2004Ь]. Предполагают, что избыточная концентрация гомоцистеина приводит к повреждению сосудистого эндотелия, нарушению локальной секреции компонентов гемостаза и возникновению тромбозов [Карпов Ю.А. и др., 2003; Woo K.S. et al., 1997]. В группе больных с ОКС без подъема сегмента ST и больных со стабильной стенокардией напряжения средние концентрации гомоцистеина в сыворотке крови статистически не различались (12,39 ± 0,82.
мкмоль/л и 10,67 ± 0,43 мкмоль/л, соответственнор=0,17). При сопоставлении количества клеток-предшественников и концентрации гомоцистеина в сыворотке крови у больных ИБС мы не обнаружили статистически значимых корреляций (см. табл. 17).
Табл. 17. Корреляции между числом циркулирующих клеток-предшественников и концентрацией гомоцистеина в сыворотке крови у больных ИБС.
ОКС без подъема Стенокардия Объединенная группа.
сегмента ST, напряжения, больных ИБС,.
п=22 п=20 п=42.
CD34+ г=0,31 г=0,12 г=0,19.
р=0,15 р=0,60 р=0,22.
CD34+VEGFR2+ г=0,05 г=0,23 г=0,10.
р=0,83 р=0,33 р=0,54.
Циркулирующие клетки-предшественники и медикаментозная.
терапия.
В ряде работ показано влияние таких препаратов, как статины, ингибиторы АПФ, на количественные и функциональные характеристики циркулирующих клеток-предшественников [Dimmeler S. et al., 2001; Vasa M. et al., 2001aMin T.Q. et al., 2004]. При исследовании связи между численностью циркулирующих клеток-предшественников у больных ИБС с получаемой на момент взятия крови медикаментозной терапией мы не выявили значимой разницы между лицами, получавшими и не получавшими статины, ингибиторы АПФ, нитраты, клопидогрель и гепарин (см. табл. 18).
Табл. 18. Сопоставление количества циркулирующих С034+, С034+УЕСЕН2+ клеток у больных ИБС с получаемой медикаментозной терапией на момент взятия крови.
Лекарственный Количество Количество Число.
препарат С034″ клеток CD34+VEGFR2+ лейкоцитов.
на 1 млн. клеток на 1 млн. млн/мл.
лейкоцитов лейкоцитов.
Статины да п=21 188 ± 19 9 ± 2 6,57 ± 0,47.
нет п=21 189 ±20 7 ± 1 7,46 ± 0,38.
Р 0,98 0,90 0,14.
Ингибиторы АПФ да п=18 191 ±22 7 ± 2 7,80 ±0,46.
нет п=24 187 ± 17 5 ± 2 6,42 ± 0,38.
Р 0.88 0,38 0,02.
Нитраты да п=19 163 ± 14 7 ± 3 7,56 ± 0,46.
нет п=23 210 ±21 5 ±2 6,56 ± 0,39.
Р 0,08 0,60 0,10.
Клопидогрель* да п=17 165 ± 17 5 ± 1 7,58 ± 0,47.
нет п=5 201 ±22 9 ± 5 6,68 ± 1,02.
Р 0,29 0,70 0,39.
Гепарин* да п=10 152 ±23 5 ± 1 7,89 ±0,52.
нет п=12 190 ± 16 7 ± 2 6,95 ± 0,65.
Р 0,17 0,44 0,28.
Примечание: * - для оценки влияния терапии клопидофелем и гепарином исследовались лишь больные ОКС без подъема сегмента 8 Т в связи с отсутствием сопоставимых групп среди больных со стабильной стенокардией.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Десять лет назад было обнаружено, что в крови взрослых людей существует популяция недифференцированных клеток костномозгового происхождения, способных приобретать эндотелиальный фенотип [Asahara Т. et al., 1997]. В экспериментальных работах на животных было показано, что ПЭК привлекаются в места сосудистого повреждения, возникающего в частности, после баллонной ангиопластики [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004a], и значительно ускоряют реэндотелизацию области повреждения. Установлено, что число ПЭК в периферической крови здоровых лиц снижено при наличии факторов риска ИБС [Vasa M. et al., 2001bHill J.M. et al., 2003]. Несмотря на большое количество исследований и интенсивное накопление экспериментальных и клинических данных, до сих пор нет однозначного мнения как об изменениях числа ПЭК у больных с различными формами ИБС, так и об их роли в неоваскуляризации и репарации поврежденного эндотелия. Исследование числа циркулирующих ПЭК у больных ИБС, как острого, так и хронического течения, и роли данных клеток в процессе репарации сосудистой стенки представляет значительный интерес и имеет большое значение для разработки в перспективе методов терапевтического применения клеток-предшественников как для ускорения регенерации эндотелия, так и для стимуляции васкуляризации миокарда. Данная работа была посвящена исследованию количества циркулирующих клеток-предшественников у пациентов с острым коронарным синдромом без подъема сегмента ST и пациентов со стабильным течением ИБС, исследованию влияния коронарной ангиопластики на число клеток-предшественников в кровотоке у больных со стенокардией напряжения.
Мы обнаружили, что общее количество циркулирующих клеток-предшественников (CD34+) снижено у больных ИБС, как стабильного, так и нестабильного течения, по сравнению с лицами без ИБС. Полученные данные.
согласуются с данными других работ, в которых также описано снижение числа этих клеток в кровотоке у больных ИБС [Eizawa Т. et al., 2004; Fadini G.P. et al., 2006]. В нашей работе контрольная группа была в среднем на 6 лет моложе группы с ОКС и на 4 года моложе группы больных со стенокардией напряжения. Показано, что способность ПЭК пролиферировать и мигрировать снижается с возрастом [Heiss С. et al., 2005]. Однако к настоящему моменту не проведено масштабных популяционных исследований, которые продемонстрировали бы значимое влияние разницы в 5−7 лет на уровень циркулирующих клеток-предшественников.
Хотя показано, что количество клеток-предшественников в крови негативно коррелирует с концентрацией общего холестерина [Hill J.M. et al., 2003; Chen J.Z. et al., 2004a], на наш взгляд, различия между контрольной группой и больными ИБС также не могут быть объяснены и меньшим процентом лиц с гиперхолестеринемией в контрольной группе. Повышенный уровень общего холестерина имели 73% больных ОКС, 35% больных со стенокардией напряжения, 39% контрольных лиц. Статины же получали 32% больных ОКС, 70% больных со стабильной стенокардией и 17% контрольных лиц. Следовательно, учитывая протективное действие статинов по отношению к численности и функциональным способностям ПЭК [Dimmeler S. et al., 2001; Vasa M. et al., 2001a], если бы гиперхолестеринемия оказывала негативное влияние на уровень циркулирующих клеток-предшественников, можно было бы ожидать, что различия в их количестве между контрольной группой и больными ИБС были бы еще выраженнее.
Влияние таких препаратов, как клопидогрель и гепарин, которые принимали больные ИБС, на количество ПЭК в кровотоке к настоящему моменту не исследовано. По ангиографическим характеристикам группы ОКС и стабильной стенокардии были сходны между собой. Таким образом, есть основания считать, что полученные нами данные о снижении числа клеток-предшественников в крови у больных ИБС не могут быть обусловлены.
межгрупповыми различиями в факторах риска, степени выраженности коронарного атеросклероза или медикаментозной терапии.
Мы впервые показали, что ТБКА со стентированием у больных со стабильным течением ИБС сопровождается достоверным уменьшением общего числа клеток-предшественников в крови через сутки после процедуры. Эти данные, наряду с данными об уменьшении количества клеток-предшественников у больных ОКС без подъема сегмента ST, косвенно подтверждают нашу гипотезу о повышенном привлечении циркулирующих клеток-предшественников в области внутрисосудистого повреждения как искусственного (при ангиопластике), так и «естественного» (при ОКС) происхождения, что согласуется с результатами экспериментальных работ [Griese D.P. et al., 2003; Kong D. et al., 2004a], в которых внутривенно вводимые или мобилизованные гранулоцитарным колониестимулирующим фактором ПЭК обнаруживались в месте повреждения сосудистой стенки после баллонной ангиопластики и значительно ускоряли эндотелизацию области повреждения. Эта гипотеза также подкрепляется обнаруженной нами отрицательной корреляцией между числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий и количеством CD34+ клеток в кровотоке у больных стабильной ИБС через 3−5 суток после интракоронарного вмешательства.
Нельзя исключить, что фактором, способствующим снижению числа.
циркулирующих клеток-предшественников у больных с хроническим течением ИБС, может являться нарушение процесса их мобилизации из костного мозга. Так, в работе Aicher А. [2003] было показано, что эндотелиальная NO-синтаза является важным участником процесса мобилизации ПЭК из костного мозга. Следовательно, у тех больных ИБС, у которых наблюдается выраженная системная дисфункция эндотелия, сопровождаемая сниженной активностью оксида азота, дисфункция может распространяться и на эндотелий синусоидов костного мозга, что неизбежно приведет к снижению мобилизации клеток-предшественников.
Учитывая, что количество клеток-предшественников снижено у больных ИБС, можно предположить, что для усиления репаративных процессов (реэндотелизации) после ангиопластики и стентирования целесообразно введение предшественников эндотелиальных клеток, полученных из крови или костного мозга пациентов и наращенных in vitro до необходимого количества.
Мы не обнаружили статистически значимого изменения содержания ПЭК (CD3 4+VEGFR2+) в кровотоке у исследуемых групп. Это может быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, количество этих клеток в кровообращении очень мало (единичные клетки в расчете на 1 миллион лейкоцитов). Во-вторых, причиной может являться недостаточный «ответ» данного ростка ввиду относительной слабости стимула и/или его десенсибилизации из-за хронической стимуляции. В-третьих, показано, что CD34+ клетки представляют собой гетерогенную клеточную популяцию, включающую гематопоэтические предшественники, предшественники эндотелиальных клеток, гладкомышечных клеток и кардиомиоцитов [Simper D. et al., 2002; Badorff С. et al., 2003; Yeh E.T.H. et al., 2003]. Можно предположить, что при ИБС патологические факторы влияют на различные типы циркулирующих предшественников, и это объясняет более выраженную реакцию общего пула CD34+ клеток по сравнению с реакцией ПЭК — CD34+VEGFR2+ клеток.
В экспериментальных работах показана способность VEGF и HGF мобилизовать клетки-предшественники из костного мозга [Kalka С. et al., 2000аKalka С. et al., 2000bIshizawa К. et al., 2004]. В клинических работах продемонстрировано повышение концентрации VEGF при остром крупноочаговом инфаркте миокарда, после эпизода миокардиальной ишемии, индуцированной физической нагрузкой. Причем увеличение уровня VEGF положительно коррелировало с количеством ПЭК в кровотоке [Shintani S. et al., 2001; Adams V. et al., 2004]. Отмечено также повышение уровня HGF в крови в течение суток с момента возникновения острого инфаркта миокарда,.
нестабильной стенокардии [Yoshitomi Y. et al., 1999; Matsumori A., 2004]. В нашей работе не обнаружено достоверных различий в концентрации HGF и VEGF в крови больных ОКС, хронической ИБС и контрольных лиц. Это отчасти согласуется с данными George J. [2004], также не обнаружившим различий в концентрации VEGF между больными с нестабильной и стабильной стенокардией. В то же время наблюдаемая нами тенденция к увеличению концентрации HGF у больных ИБС согласуется с данными Matsumori А. [2004], выявившим повышение концентрации HGF у больных с нестабильной стенокардией и в первые сутки острого инфаркта миокарда. Нами впервые была обнаружена положительная корреляция между концентрацией HGF и числом клеток-предшественников в крови у больных со стабильным течением ИБС, что позволяет предположить участие HGF наряду с другими факторами в мобилизации клеток-предшественников из костного мозгаспособность HGF мобилизовать ПЭК из костного мозга была показана в экспериментальной работе Ishizawa К. [2004]. Известно также, что HGF стимулирует пролиферацию, клеточную подвижность [Matsumoto К. et al., 1996], ангиогенез [Grant D.S. et al., 1993], ингибирует апоптоз [Zamegar R. et al., 1995] и стимулирует рост CD34+ гематопоэтических предшественников [Kmiecik Т.Е. et al., 1992]. На уровень HGF в крови существенное влияние оказывает гепарин. Его внутривенное или подкожное введение (как нефракционированного, так и низкомолекулярного) сопровождается быстрым и значительным (5−50-кратным) повышением концентрации HGF [Okada М. et al., 1999; Seidel С. et al., 1999; Salbach P.B. et al., 2000]. В’озможно, одной из составных частей положительного эффекта гепарина при ОКС без подъема сегмента ST является мобилизация клеток-предшественников в кровоток, опосредованная значительным повышением уровня HGF. Однако, отсутствие статистически значимых корреляций между концентрацией HGF, VEGF и числом клеток-предшественников в группе больных с ОКС, заставляет предположить участие.
других факторов, влияющих на численность предшественников в крови у больных этой категории.
На поверхности CD34+ клеток имеются многочисленные хемокиновые рецепторы и молекулы адгезии [Rabelink T.J. et al., 2004]. Это позволяет предположить, что в их мобилизации и «хоуминге» участвуют многие факторы, которые не исследовались в нашей работе. Число этих клеток в крови при ОКС, вероятно, является результатом действия всех этих факторов, среди которых в данной ситуации VEGF и HGF не являются самыми значительными.
При сопоставлении количества циркулирующих клеток-предшественников с наличием факторов риска сердечно-сосудистых осложнений мы не обнаружили значимой взаимосвязи.
По уровню С-РБ в. сыворотке крови группы значимо не различались между собой, хотя в группе ОКС без подъема сегмента ST его концентрация была закономерно выше. Статистически значимой корреляции между концентрацией С-РБ и числом циркулирующих клеток-предшественников у больных ИБС обнаружено не было. По-видимому, сопутствующее атеросклерозу воспаление, оцениваемое нами по содержанию С-РБ в сыворотке крови, не оказывает прямого влияния на количество исследуемых клеток-предшественников в кровотоке. Однако эти данные нуждаются в уточнении с использованием дополнительных маркеров воспаления, например, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли а.
По содержанию гомоцистеина в сыворотке исследуемой крови группы также значимо не различались между собой и статистически значимых корреляций между количеством клеток-предшественников в кровотоке и концентрацией гомоцистеина в сыворотке крови не обнаружено. Однако следует отметить, что у лиц, участвовавших в нашем исследовании, значительной гипергомоцистеинемии не наблюдалось. В исследовании in vitro было показано, что гомоцистеин снижает количество культивируемых ПЭК и негативно влияет на их функциональные способности. Но данный эффект.
проявлялся при высоких концентрациях гомоцистеина 50 мкмоль/л и выше, а концентрация гомоцистеина 10 мкмоль/л не оказывала влияния на количество и функции культивируемых ПЭК [Chen J.Z. et al., 2004Ь]. Возможно, отсутствие в исследуемых нами группах больных с выраженным повышением концентрации гомоцистеина (более 50 мкмоль/л) не позволило выявить связи между его уровнем и количеством циркулирующих клеток-предшественников.
Больные ИБС с различной степенью атеросклеротического поражения коронарного русла по результатам ангиографии не различались по количеству клеток-предшественников в кровотоке. При этом выраженность периферического атеросклероза по результатам дуплексного сканирования сонных, подключичных артерий и артерий подвздошно-бедренного сегмента была одинаковой в подгруппах с 1-, 2- и 3-сосудистым поражением коронарного русла. Это могло нивелировать различия между этими подгруппами по величине «суммарного» атеросклеротического поражения.
Учитывая имеющиеся в литературе данные о влиянии некоторых групп лекарственных средств на количество циркулирующих клеток-предшественников [Dimmeler S. et al., 2001; Vasa M. et al., 2001aMin T.Q. et al., 2004], мы также исследовали взаимосвязь между получаемой медикаментозной терапией и количеством циркулирующих клеток-предшественников. В исследованной выборке больных статистически значимых различий между больными, получавшими и не получавшими статины, ингибиторы АПФ, нитраты, клопидогрель и гепарин, получено не было. В отношении статинов появляются новые данные о меньшем количестве циркулирующих ПЭК у больных стабильной ИБС, получающих большие дозы статинов, и об уменьшении числа ПЭК в кровотоке через 3 месяца лечения статинами [Hristov М. et al., 2007а]. Авторы объясняют наблюдаемый эффект стабилизацией атеросклеротических бляшек и снижением «потребности» в ПЭК. Ранее же считалось, что статины всегда способствуют увеличению количества циркулирующих ПЭК [Dimmeler S. et al., 2001; Vasa M. et al., 2001а]. В свете.
этих новых данных о статинах, так как в исследуемых группах продолжительность приема и дозировка препарата сильно варьирует, интерпретация результата еще более затрудняется.
В заключение хотелось бы отметить, что уже появились первые сообщения об исследованиях, включающих до нескольких сотен лиц, демонстрирующих прогностическую значимость количества циркулирующих CD34+ [Fadini G.P. et al., 2006] и CD34+VEGFR2+ клеток [Schmidt-Lucke С. et al., 2005; Werner N. et al., 2005]: сниженное количество клеток-предшественников ассоциируется с худшим прогнозом независимо от общеизвестных факторов риска. Тем не менее, полномасштабных, длительных исследований, прояснивших бы прогностическую значимость числа клеток-предшественников в кровотоке у больных ИБС, не проводилось, так же как до сих пор не выработано единой общепринятой методики их подсчета.
Наши данные, полученные на меньшей группе больных ИБС, хорошо соотносятся с данными этих работ и могут явиться основанием для дальнейшего, более углубленного изучения циркулирующих клеток-предшественников у больных ИБС как, возможно, нового фактора риска и предиктора неблагоприятного прогноза ишемической болезни сердца. Полученные данные также обосновывают необходимость разработки подходов к повышению количества циркулирующих клеток-предшественников при ИБС.
ВЫВОДЫ.
1. По сравнению с лицами без ИБС у больных с ОКС без подъема сегмента БТ и больных со стабильной стенокардией напряжения общее количество циркулирующих СОЭ4+ клеток снижено, соответственно, на 38 и 26%.
2. У больных со стабильной стенокардией отмечается достоверное уменьшение общего числа С034+ клеток-предшественников в крови через сутки после проведения коронарной ангиопластики со стентированием. Через 3−5 суток после коронарного вмешательства общее количество клеток-предшественников восстанавливается.
3. У больных со стабильным течением ИБС количество циркулирующих клеток-предшественников положительно коррелирует с концентрацией фактора роста гепатоцитов.
4. Взаимосвязь между факторами риска сердечно-сосудистых осложнений, выраженностью атеросклероза коронарных артерий и количеством циркулирующих клеток-предшественников не обнаружена.
5. Выявлена отрицательная корреляция между числом эндоваскулярно леченых сегментов коронарных артерий и количеством циркулирующих СБ34+ клеток у больных стабильной ИБС через 3−5 суток после коронарного вмешательства.
6. Не установлена взаимосвязь между получаемой больными ИБС медикаментозной терапией и количеством циркулирующих клеток-предшественников.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
Предложенный протокол определения количества циркулирующих С034+ клеток-предшественников в пробах цельной крови рекомендуется использовать для научно-исследовательских работ, направленных, в частности, на исследование процессов репарации внутрисосудистого повреждения у различных групп больных.
