Валидационная оценка методов качественного и количественного анализа ингредиентов лекарственного средства

Пятигорский филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Курсовая работа

Валидационная оценка методов качественного и количественного анализа ингредиентов лекарственного средства Папаверина гидрохлорида 2% раствора для инъекций

Исполнитель: студент 5 курса 16 группы Семенов Сергей Юрьевич Руководитель: к. ф. н., старший преподаватель А. Г. Курегян Пятигорск, 2012

Введение

Глава 1. Анализ папаверина гидрохлорида в субстанции и в лекарственных формах

1.1 Способы анализа папаверина гидрохлорида в субстанции

1.1.1 Подлинность

1.1.2 Посторонние примеси

1.1.3 Количественное определение

1.2 Методы анализа папаверина гидрохлорида в лекарственных формах

1.2.1 Папаверина гидрохлорид в растворе для инъекций

1.2.2 Папаверина гидрохлорид в таблетках

1.2.3 Папаверина гидрохлорид в суппозиториях Глава 2. Валидация методик анализа папаверина гидрохлорида в растворе для инъекций 2%

2.1 Приготовление модельной смеси

2.2 Линейность (linearity)

2.3 Правильность (accuracy)

2.4 Прецизионность (precision)

Валидация аналитической методики — это экспериментальное доказательство того, что методика пригодна для решения предполагаемых задач.

Необходимость валидации всех аналитических методик не вызывает сомнений — это один из элементов валидации всего процесса производства лекарств. Кроме этого, с практической точки зрения, валидация аналитических методик дает ряд существенных «вторичных» полезных эффектов.

Во-первых, при проведении валидации в процессе разработки новых методик можно своевременно выявить их недостатки и на ранних стадиях существенно улучшить методику. Во-вторых, при грамотно и качественно выполненной работе появляется уверенность и в методике, и в качестве анализируемого препарата. В третьих, в процессе валидации обязательно принимают практическое участие различные аналитические лаборатории. Практика валидационных экспериментов дает понимание сути методики и осознание необходимости строгого соблюдения ее параметров. В результате, при последующей эксплуатации валидированной методики значительно снижается вероятность ошибок.

Для валидации методик используются следующие параметры:

правильность (accuracy) — /

близость получаемых результатов к истинному значению, оценивается по погрешности определения;

специфичность (specificity) — /

способность измерять точно и селективно аналит (определяемое вещество) в присутствии компонентов, которые могут ожидаться в матрице образца (примеси, родственные химические соединения, продукты разложения, ингредиенты плацебо), также оценивается по погрешности определения;

точность (precision) — /

мера сходимости результатов при многократном повторении аналитической процедуры.

Точность методики определяется двумя параметрами: сходимость и воспроизводимость.

сходимость (repeatability) — /

близость результатов индивидуальных тесто в, когда процедура анализа повторяется на многочисленных пробах гомогенного образца одинаковых проб в нормальных условиях проведения анализа (иногда переводится как повторяемость), критерием является стандартное отклонение параллельных определений;

воспроизводимость (reproducibility) — /

степень сходимости результатов, полученных анализом одних и тех же образцов при различных нормальных условиях теста — разные лаборатории, химики-аналитики, инструменты, партии реактивов, температура окружающей среды, различное время проведения анализов и т. п., также оценивается по стандартному отклонению параллельных определений;

линейность (linearity) — /

способность показать, что результаты теста сразу или после определенной математической обработки пропорциональны концентрации аналита в образце в пределах данного интервала, определяется математической обработкой результатов теста образцов с различными концентрациями аналита в пределах интервала, установленного для данного метода. Обычно производится расчет линии регрессии методом наименьших квадратов для результатов с различными концентрациями аналита. Наклон регрессионной линии и его вариация дает математическую степень линейности. Для оценки степени линейности должны быть рассчитаны коэффициент корреляции, перекрывание оси Y, наклон регрессионной линии и остаточная сумма отклонений;

интервал метода (range) оценивается проверкой того, как данный аналитический метод обеспечивает точность, правильность и/

линейность при определении образцов, содержащих аналит на границах интервала и внутри его. Определяется в ходе проведения испытаний по каждому из перечисленных параметров;

предел обнаружения (limit of /

detection) — параметр предельных тестов — минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть обнаружена, но не определена количественно в условиях анализа. Определение предела обнаружения варьируется в зависимости от типа метода (инструментальный или неинструментальный). Для инструментальных методов в основном определяют отношение сигнал/шум или измеряют величину фонового сигнала, после чего рассчитывают минимальный уровень (обычно принимают отношение сигнал/шум = 2:1 или 3:1). Этот предел потом оценивается анализом ряда образцов с содержанием аналита близким к пределу (реальных или специально приготовленных). Для неинструментальных методов предел обнаружения определяется анализом образцов с известными концентрациями аналита и установлением минимального уровня аналита, при котором он может быть достоверно обнаружен;

количественного определения (limit of /

quantitation) — параметр количественного определения для низших уровней содержания веществ в пробе образцов, таких как примеси или продукты разложения. Это минимальная концентрация аналита в образце, которая может быть определена с приемлемой точностью в условиях анализа. Выражается концентрацией аналита в образце. Определение, так же как и в случае предела обнаружения, различается для инструментальных и неинструментальных методов. Процедура аналогична, обычно используют значение фактора, равное 10;

устойчивость (robustness) — /

мера способности не подвергаться воздействию небольших, но запредельных отклонений параметров методики — показывает точность и правильность в нормальных условиях. Определяется проведением теста правильности при небольших отклонениях параметров методики или свойств анализируемого объекта. Рассчитывается погрешность по сравнению с результатами, полученными в нормальных условиях. Если наблюдается влияние параметров методики, это оговаривается в тексте методики.

Глава 1. Анализ папаверина гидрохлорида в субстанции и в лекарственных формах

Папаверин является алкалоидом, впервые выделенным из опия в 1884 г. Мерком. По химической структуре он относится к производным бензилизохинолина. В 1910 г. был осуществлен синтез папаверина. Природный и синтетический папаверины идентичны в фармакологическом отношении.

Химическое название: 1-(3,4-диметоксибензил)-6,7-диметоксиизохинолин Папаверина гидрохлорид субстанция представляет собой белые или почти белые кристаллы или белый или почти белый кристаллический порошок без запаха[1]. Инъекционный раствор — прозрачная бесцветная или слегка желтоватая жидкость.

По физико-химическим свойствам папаверина г/хл является солью слабого азотистого основания, обладает свойствами восстановителя, что объясняется наличием в структуре 2 ароматических фрагментов, связанных метиленовой группой, а также 4 метоксидных групп. 4] Т.пл. 147 °C.

Папаверин растворим в хлороформе, умеренно растворим в воде, мало растворим в 96% этаноле, практически нерастворим в эфире. 2]

1.1 Способы анализа папаверина гидрохлорида в субстанции

1.1.1 Подлинность

Подлинность субстанции можно определять как химическим, так и физическим методами.

Химические реакции подлинности основаны на его свойствах.

Для идентификации используют реакции со специальными реактивами на алкалоиды, действие которых основано на окислении папаверина:

· Под действием концентрированной азотной кислоты папаверина гидрохлорид приобретает желтое окрашивание, которое переходит в оранжевое при нагревании на водяной бане

· Нагревание его с концентрированной серной кислотой приводит к появлению фиолетового окрашивания.

· Окрашенные продукты также образуются при взаимодействии с реактивом Марки. При последующем добавлении бромной воды и раствора аммиака появляется фиолетовый осадок, который после растворения в этаноле окрашивает раствор в фиолетово-красный цвет (реакция является специфичной для папаверина и используется в его фотоколориметрическом определении).

· Положительную реакцию дает папаверина гидрохлорид с реактивом Фреде, при его обработке уксусным ангидридом и концентрированной серной кислотой после нагревания на водяной бане появляется желтое окрашивание с зеленой флуоресценцией.

· С перманганатом калия в кислой среде папаверина гидрохлорид образует продукты, флуоресцирующие голубым светом.

Кроме того папаверина гидрохлорид дает некоторые реакции с осадительными реактивами:

v Бромная вода выделяет из раствора желтый осадок.

v Спиртовой раствор йода — темно-красные кристаллы.

v С пикриновой кислотой образуется желтый осадок.

v Также выпадают осадки под действием реактивов Драгендорфа и Майера.

Субстанция дает характерную реакцию на хлориды[1].

Физико-химические методы:

ь ИК-спектр субстанции, снятый в диске с калия бромидом, в области от 4000 до 400 см-1 по положению полос поглощения должен соответствовать рисунку спектра папаверина гидрохлорида. 1]

ь УФ-спектр поглощения 0,0005% раствора субстанции в 0,01 М растворе хлористоводородной кислоты в области от 230 до 270 нм должен иметь максимум при 251 нм[1].

ь УФ-спектр поглощения 0,0025% раствора субстанции в 0,01 М растворе хлористоводородной кислоты в области от 270 до 350 нм должен иметь максимумы при 285 и при 285нм и 09нм[1].

1.1.2 Посторонние примеси

Содержание посторонних примесей устанавливается методами тонкослойной хроматографии или ВЭЖХ.

ТСХ. Испытуемый раствор. 0,25 г субстанции растворяют в 5 мл хлороформа.

Раствор сравнения. 0,5 мл испытуемого раствора разбавляют хлороформом до 100мл.

На линию старта пластинки со слоем силикагеля 60 F254 наносят 10 мкл (500 мкг) испытуемого раствора, 10 мкл (2,5 мкг) и 2 мкл (0,5 мкг) раствора сравнения. Пластинку с нанесенными пробами сушат на воздухе, помещают в камеру со смесью толуол — этилацетат — диэтиламин (7:2:1) и хроматографируют восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы дойдет до конца пластинки, ее вынимают из камеры, сушат на воздухе в течение 20 минут и просматривают в УФ-свете при 254нм.

Пятно любой посторонней примеси на хроматограмме испытуемого раствора по совокупности величины и интенсивности поглощения не должно превышать пятно на хроматограмме раствора сравнения (0,5 мкг, не более 0,1%). Суммарное содержание примесей, оцененное по совокупности величины и интенсивности поглощения их пятен на хроматограмме испытуемого раствора в сравнении с пятном на хроматограмме раствора сравнения (2,5 мкг), не должно превышать 0,5%. Пятно на старте в расчет не принимают.

Результаты испытания считаются достоверными, если на хроматограмме раствора сравнения (0,5 мкг) четко видно пятно.

1.1.3 Количественное определение

Папаверина гидрохлорид количественно определяют химическими и физико-химическими методами:

Химические методы:

1. Методом неводного титрования в смеси муравьиной кислот и уксусного ангидрида (фармакопейный метод — ФС 42−3149−95). Около 0,3 г препарата (точная навеска) растворяют в 1мл кислоты муравьиной, прибавляют 10 мл ангидрида уксусного и титруют 0,1 М раствором кислоты хлорной до ярко-желтого окрашивания (индикатор — раствор кристаллического фиолетового 0,15 мл). Параллельно проводят контрольный опыт.

2. Методом нейтрализации в спиртовой среде (фармакопейный метод — ГФ Х, с 356) Около 0,5 г препарата (точная навеска) растворяют в 50 мл свежепрокипяченной и охлажденной воды, прибавляют 25 нейтрализованного по фенолфталеину спирта и титруют раствором натрия гидроксида 0,1 моль/л до розового окрашивания (индикатор фенолфталеин).

3. Аргентометрическим методом по хлорид-иону.

Физико-химические методы:

1) Экстракционно-фотометрическое определение. Основано на измерении светопоглощения комплексного соединения с изотиоцианатом аммония и хлоридом железа (III), а так же на избирательном взаимодействии с красителем оранжевым Ж.

2) Спектрофотометрическое определение. Проводят в тех же растворителях и при тех же длинах волн, что и подлинность, содержание рассчитывают по стандартному образцу[2].

3) Экстракционно-титриметрическое определение с использованием в качестве титранта лаурилсульфата натрия.

1.2 Методы анализа папаверина гидрохлорида в лекарственных формах

папаверин примесь хроматография Папаверина гидрохлорид выпускается в нескольких лекарственных формах, это таблетки, раствор для инъекций и суппозитории.

1.2.1 Папаверина гидрохлорид в растворе для инъекций

Подлинность:

1. Химические реакции:

o с кислотой азотной концентрированной: 1 мл препарата помещают в фарфоровую чашку, выпаривают досуха, охлаждают, прибавляют 2 капли конц. азотной кислоты; появляется желтое окрашивание, которое при нагревании на водяной бане переходит в оранжевое.

o с серной кислотой концентрированной, кислотой пикриновой, с реактивами Марки, Фреде, Эрдмана, Драгендорфа, Майера.

2. Физико-химические методы:

· УФ-спектр раствора препарата, взятого в той же концентрации, что и для количественного определения в области от 270 до 359 нм, имеет максимумы поглощения при длине волны около 284±1 и 309±1 нм.

Примеси:

Содержание примесей определяют методом тонкослойной хроматографии (не больше 1%).

Количественное определение:

1) Методом УФ-спектрофотометрии в сравнении с РСО:

2 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора 0,1 М раствором HCL до метки и перемешивают.

5 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 100 мл, доводят объем раствора 0,1 М раствором HCL до метки и перемешивают.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре в максимуме поглощения при длине волны 309 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Параллельно измеряют оптическую плотность РСО папаверина. В качестве раствора сравнения используют 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной.

Содержание папаверина г/хл в 1 мл препарата в граммах вычисляют по формуле:

где D1 — оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 — оптическая плотность раствора РСО папаверина г/хл;

а 0 — навеска РСО папаверина г/хл в граммах.

2) Методом неводного титрования в смеси муравьиной кислот и уксусного ангидрида (фармакопейный метод — ФС 42−3149−95).

3) Аргентометрическим методом по хлорид-иону.

4) Методом нейтрализации в спиртовой среде (фармакопейный метод — ГФ Х, с 356).

1.2.2 Папаверина гидрохлорид в таблетках

Подлинность:

1. Химические реакции

o См

2. Физико-химические методы:

· ИК-спектроскопия (см. в п. 1.1.3.)

· УФ-спектрофотометрия (см. в п. 1.1.3.)

· Хроматография в тонком слое сорбента

· Экстракционно-фотометрический метод Примеси:

Содержание примесей определяют методом тонкослойной хроматографии (см. в п. 1.1.2.).

Количественное определение:

1) Методом УФ-спектроскопии

2) Методом неводного титрования в смеси муравьиной кислот и уксусного ангидрида (фармакопейный метод — ФС 42−3149−95).

3) Аргентометрическим методом по хлорид-иону.

4) Методом нейтрализации в спиртовой среде (фармакопейный метод — ГФ Х, с 356).

1.2.3 Папаверина гидрохлорид в суппозиториях

Подлинность:

Химические реакции:

o См Физико-химические методы:

· Одну свечу помещают в колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл воды, нагревают на водяной бане до расплавления, тщательно взбалтывают, охлаждают до застывания основы и водный слой фильтруют. 2 мл фильтрата помещают в фарфоровую чашку и выпаривают на водяной бане досуха. К остатку прибавляют 8 капель кислоты азотной концентрированной; появляется желтое окрашивание, которое при нагревании переходит в оранжево-красное.

· 2 мл фильтрата дают характерную ракцию на хлориды (ГФ XI, вып. 1, с 159)

Примеси:

Содержание примесей определяют методом тонкослойной хроматографии (см. в п. 1.1.2.).

Количественное определение:

1) Одну свечу помещают в колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл воды, нагревают на водяной бане до расплавления, тщательно взбалтывают, охлаждают до застывания основы и водный слой фильтруют в колбу для титрования. Промывают колбу и фильтр 5 мл воды, операцию повторяют еще раз. К фильтрату добавляют 2−3 капли индикатора фенолфталеина и титруют раствором натрия гидроксида 0,02 моль/л до розового окрашивания. Содержание папаверина гидрохлорида в одной свече должно быть от 0,018 г до 0,022 г (по среднему результату трех параллельных определений).

2) Методом неводного титрования в смеси муравьиной кислот и уксусного ангидрида (фармакопейный метод — ФС 42−3149−95).

3) УФ-спектрофотометрия

Глава 2. Валидация методик анализа папаверина гидрохлорида в растворе для инъекций 2%

2.1 Приготовление модельной смеси

Около 0,05 г (точная навеска) СО папаверина гидрохлорида помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и доводят тем же растворителем до метки (раствор А).

2 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки тем же растворителем (раствор Б).

Изучают спектр поглощения раствора Б на спектрофотометре в области 230 — 270 нм. Раствор имеет максимум при длине волны 251 нм.

2.2 Линейность (linearity)

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 0,05 г СО папаверина гидрохлорида растворяют в 50 мл 0,1 М раствора кислоты хлористоводородной и доводят тем же растворителем до метки (раствор А).

В мерные колбы вместимостью 100 мл последовательно вносят 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мл раствора, А и доводят до метки тем же растворителем. Получают растворы с концентрацией 0,0005%, 0,001%, 0,0015%, 0,002%; 0,0025%.

Измеряют оптическую плотность каждого раствора при длине волны 309 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Раствор сравнения — 0,1 М раствор кислоты хлористоводородной.

Строят градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации, рассчитывают уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции. Данные заносят в таблицу 1.

Таблица 1 — зависимость оптической плотности от концентрации

2.3 Правильность (accuracy)

Приготовление трех растворов модельных смесей.

Раствор А₁ (модельная смесь 1) Точную навеску модельной смеси 0,375 г помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной и доводят этим растворителем до метки.

Раствор А₂ (модельная смесь 2) Точную навеску модельной смеси 0,500 г помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной и доводят этим растворителем до метки.

Раствор А₃ (модельная смесь 3) Точную навеску модельной смеси 0,625 г помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной и доводят этим растворителем до метки.

Далее:

Разведения модельных смесей

Раствор Б₁. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 2,5 мл раствора А₁ и доводят до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной.

Раствор Б₂. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 2,5 мл раствора А₂ и доводят до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной.

Раствор Б₃. В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 2,5 мл раствора А₃ и доводят до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной.

Итоговые разведения для спектрофотометрии.

Растворы В₁, В₂, В₃. В три мерные колбы вместимостью 50 мл вносят по 2 мл раствора Б 1 и доводят до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной.

Растворы В₄, В₅, В₆. В три мерные колбы вместимостью 50 мл вносят по 2 мл раствора Б₂ и доводят до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной.

Растворы В₇, В₈, В₉. В три мерные колбы вместимостью 50 мл вносят по 2 мл раствора Б 3 и доводят до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной.

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 309 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО папаверина гидрохлорида.

Приготовление раствора СО папаверина гидрохлорида.

Около 0,05 г (точная навеска) папаверина гидрохлорида растворяют в 0,1 М растворе кислоты хлористоводородной и доводят этим растворителем до метки (раствор А).

2 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят до метки тем же растворителем (раствор Б),

1 мл раствора Б содержит 0,2 г папаверина гидрохлорида.

Расчет содержания папаверина гидрохлорида в процентах (открываемость R) проводят по формуле:

(1),

где: Ах — оптическая плотность исследуемого раствора;

Ао — оптическая плотность раствора СО папаверина гидрохлорида;

ах — масса навески исследуемого образца папаверина гидрохлорида;

0,2 — содержание папаверина гидрохлорида в г в 1 мл раствора СО.

Результаты заносят в таблицу № и рассчитывают стандартное (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

Таблица 2 — Правильность

2.4 Прецизионность (precision)

Приготовить раствор Б₂ модельной смеси.

Растворы В₁, В₂, В₃. В три мерные колбы вместимостью 50 мл вносят по 1 мл раствора Б₂ и доводят до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной.

Растворы В₄, В₅, В₆. В три мерные колбы вместимостью 50 мл вносят по 2 мл раствора Б₂ и доводят до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной.

Растворы В₇, В₈, В₉. В три мерные колбы вместимостью 50 мл вносят по 3 мл раствора Б₂ и доводят до метки 0,1 М раствором кислоты хлористоводородной.

Измеряют оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 309 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО папаверина гидрохлорида.

Расчет содержания папаверина гидрохлорида в граммах в 1 мл проводят по формуле:

(2),

где: Ах — оптическая плотность исследуемого раствора;

Ао — оптическая плотность раствора СО папаверина гидрохлорида;

0,2 — содержание папаверина гидрохлорида в г в 1 мл раствора СО;

Va — объем аликвоты раствора Б, взятый для разведения, мл.

Результаты заносят в таблицу и рассчитывают стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

Таблица 3 — Прецизионность

1. ГФ 12. ФС 42−0267−07.

2. Беликов В. Г. Фармацевтическая химия

3. ФСП 42−0152−1850−01

4. Арзамасцев