Сигналы, стимулируемые эпидермальным фактором роста (ЭФР), играют исключительно важную роль на ранних стадиях формирования клеток эпителиальной линии, в регуляции пролиферации и дифференцировки/дедифференцировки зрелых клеток различных тканей, в регуляции выживаемости и подвижности клеток, а нарушения в их функционировании зачастую приводит к злокачественной трансформации. Биологические эффекты ЭФР опосредуются в клетке его рецепторомтрансмембранным белком, цитоплазматический домен которого обладает тирозинкиназной активностью. Рецепторы ЭФР чрезвычайно широко экспрессируются различными типами клеток.
Взаимодействие ЭФР с рецептором стимулирует два ряда событий: с одной стороны, инициируются каскадные сигнальные пути, с другой стороны, происходит поступление ЭФР-рецепторных комплексов внутрь клетки с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза. Схематично этот процесс можно представить следующим образом: после связывания лиганда с рецептором ЭФР-рецепторные комплексы интернализуются и попадают в ранние эндосомы (РЭ), где происходит их сортировка: часть комплексов рециклирует обратно на плазматическую мембрану (ПМ), а остальные попадают в предлизосомальный компартмент, называемый поздними эндосомами (ПЭ), после чего деградируют в лизо. сомах (Никольский и др., 1987). В последние годы появляются данные, отводящие рецептору, находящемуся в эндосомах (как ранних, так и поздних), самостоятельную роль в реализации сигнала, стимулируемого ЭФР. В связи с этим изучение механизмов регуляции вступления рецептора на путь деградации и продвижения по нему приобретает большое значение.
Несмотря на длительную историю исследований, ответа на вопрос о том, как именно происходит сортировка ЭФР-рецепторных комплексов на путь лизосомальной деградации (т.е. переход из РЭ в ПЭ), до сих пор нет.
Все больше подтверждений получает точка зрения, в соответствии с которой переход из РЭ в ПЭ связан с попаданием белков, направляемых в лизосомы, в везикулярные домены мембраны РЭ, на которых в дальнейшем образуются инвагинации. Эти инвагинации превращаются затем во внутренние пузырьки, что приводит к формированию так называемых мультивезикулярных эндосом (МВЭ), встречающихся на поздних стадиях эндоцитоза практически у всех известных организмов (Felder et al., 1990; Ullrich, Schiessinger, 1990; Dunn, Maxfield, 1992). Образование инвагинаций (и заякоривание в них направляемых на деградацию белков) начинается, по-видимому, уже на стадии РЭ, полностью сформированная МВЭ соответствует по характеристикам ПЭ. Таким образом, РЭ превращаются в ПЭ в ходе процесса, называемого созреванием. Молекулярные основы этого процесса неясны. В настоящее время можно считать установленным, что для перехода в ПЭ рецептор ЭФР должен обладать активированной тирозинкиназой (ТК) (Благовещенская и др., 1994). Известен также ряд белков и белковых комплексов, нарушения в функционировании которых в той или иной степени нарушают доставку рецепторов в лизосомы. Это фосфатидилинозитол-3-киназа (PI3K), убиквитин-лигаза c-Cbl, адапторный белок SNX1, субстрат рецепторной тирозинкиназы HRS, комплексы ESCRT I, II, III и др. Сайты действия этих белков не всегда известны, а механизм координации их действия практически не изучен.
Давно показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию — пострансляционной модификации, заключающейся в ковалентном присоединении убиквитина к остаткам лизина, содержащимся в молекуле рецептора (Galcheva-Gargova et al., 1995). Убиквитинирование, как известно, является маркером для деградации на протеасомах (Wilkinson, 2000; Myuang et al., 2001), однако в последнее время появились указания на то, что убиквитинирование может быть необходимо также для интернализации и включения лиганд-рецепторных комплексов во внутренние пузырьки МВЭ (Бирге е1 а1., 2001). Показано, что рецептор ЭФР подвергается убиквитинированию убиквитин-лигазой с-СЫ (Ьеук0уй2 е1 а1., 1999). Данные о том, на каком этапе с-СЫ ассоциируется с рецептором, как долго сохраняется комплекс, каков статус убиквитинирования рецептора, т. е количество убиквитинов и убиквитиновых цепочек, присоединенных к одной молекуле рецептора, так же как и «молекулярный» смысл этой модификации, противоречивы и неполны. Не исключена вероятность того, что убиквитинированный рецептор узнается протеасомой и подвергается частичному протеолизу, в результате чего он становится доступен белкам, вовлекающим его на путь лизосомальной деградации. Существует ряд работ, авторы которых делают вывод об участии протеасом в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР (Longva е! а1., 2002), рецептора липопротеинов низкой плотности (Ме1шап а1., 2002) и рецепторов гормона роста (Так^ & а1., 2001). Подобное заключение делается ими на основании того, что ингибиторы активности протеасом, в частности, наиболее широко применяемый синтетический ингибитор МО 132, подавляют процессинг рецепторов по лизосомальному пути. Этими авторами, однако, не анализируется и не учитывается неоднозначность действия ]УЮ132 на клетку. Таким образом, вопрос о том, насколько протеасомы вовлечены в регуляцию внутриклеточного процессинга рецепторов ЭФР на поздних стадиях эндоцитоза, и какова роль убиквитинирования рецептора, остается открытым.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы заключалась в том, чтобы проанализировать возможное участие протеасом в регуляции разных стадий эндоцитоза рецептора ЭФР, а также исследовать поведение убиквитинирующего рецептор белка с-СЫ в процессе эндоцитоза.
В связи с этим задачи исследования были сформулированы следующим образом:
1. Проанализировать влияние ингибитора протеасом ]УЮ132 на динамику эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов, определить, на каком этапе он действует;
2. Изучить поведение убиквитин-лигазы с-СЫ в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов;
3. Сравнить спектр убиквитинирования рецептора ЭФР в различных эндосомальных компартментах;
4. Идентифицировать фосфатидилинозитол-3-киназу, участвующую в регуляции сортировки рецептора ЭФР в поздние эндосомы;
5. Определить последовательность действия с-СЫ и Р13К в ходе эндоцитоза.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Рецептор ЭФР в эндосомах не является непосредственной мишенью действия протеасом.
2. Убиквитинирование рецептора ЭФР в ранних и поздних эндосомах различновысокоубиквитинированные формы составляют относительно небольшую долю общего пула интернализованного рецептора, и именно эти формы преимущественно сортируются в поздние эндосомы.
3. Синтетический ингибитор протеасом МС132 может замедлять как переход ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, так и взаимодействие поздних эндосом с лизосомами, основной сайт его действия зависит от скорости процесса эндоцитоза в конкретных клетках, а механизм связан в основном с истощением пула свободного убиквитина.
4. Убиквитин-лигаза с-СЫ после стимуляции эндоцитоза ассоциируется с рецептором ЭФР как в ранних, так и в поздних эндосомах, при этом сайт ее первоначального действия находится выше по эндоцитозному пути, чем сайт действия фосфатидилинозитол-3-киназы.
5. В регуляцию перехода рецептора из ранних в поздние эндосомы вовлечена не Р13К I класса р85р110, а Р13КIII класса ЬУР834.
2. Обзор литературы.
2.1. Общие понятия о везикулярном транспорте.
Эукариотическая клетка состоит из мембранных компартментов, которые взаимодействуют между собой с помощью тубуловезикулярного транспорта. В клетке постоянно происходит отпочковывание мембранных пузырьков, от одного компартмента и последующего слияния их с другим. Ряд возбудителей опасных заболеваний человека и животных способны проникать через отпочковывающиеся везикулы внутрь клетки, при этом микроорганизмы меняют свойства этих пузырьков таким образом, что они теряют способность сливаться с лизосомами, тем самым, приводя к беспрепятственному размножению патогенных микроорганизмов. Кроме того, с помощью везикулярного транспорта экспортируются вновь синтезированные белки и другие молекулы во внеклеточную среду, обеспечивая тем самым регуляцию на уровне организма. Поступление внутрь клетки питательных веществ, транспорт иммуноглобулинов и многие другие процессы также опосредуются перераспределением мембран. Возможно, что с помощью везикулярного транспорта регулируется внутриклеточный и трансмембранный сигналинг, позволяя влиять на такие процессы, как дифференцировка, пролиферация, апоптоз, выброс ионов кальция из внутриклеточного депо и др. Нельзя не сказать, что везикулярный транспорт контролирует гомеостаз мембран в течение всей жизни клетки.
В клетке можно выделить несколько основных везикулярных потоков. Так, вновь синтезированные белки поступают из эндоплазматического ретикулума в цистерны аппарата Гольджи, а затем или переносятся в составе секреторных пузырьков к плазматической мембране, где выделяются во внутриклеточную среду посредством экзоцитоза, или направляются к другим внутриклеточным компартментам. Трансцитоз — транспорт с апикальной поверхности поляризованных клеток к базальной мембране, что характерно для транспорта иммуноглобулинов. Одной из важнейших функций, осуществляемых вакуолярным аппаратом клетки, является эндоцитоз — процесс поглощения клеткой содержащегося в окружающей среде макромолекулярного материала и распределения его между внутриклеточными компартментами.
В настоящее время в клетках выделяют два основных типа эндоцитоза: жидкофазный (пиноцитоз) и рецептор-опосредованный эндоцитоз (РОЭ). В случае пиноцитоза происходит неизбирательное поступление внутрь клетки молекул, присутствующих в межклеточной среде. Этот процесс считают конститутивным, поскольку в общем случае он происходит постоянно в условиях метаболической активности клетки. Строго говоря, это не так, поскольку в ряде случаев клетка способна регулировать эффективность пиноцитоза, например, увеличивая его в ответ на стимулированную секрецию, что обеспечивает нормальный оборот мембран и поддерживает ' постоянный размер клетки. Таким образом, о пиноцитозе следует говорить не столько как о конститутивном, сколько как о неселективном, но регулируемом компенсаторном процессе.
Другим типом является рецептор-опосредованный эндоцитоз, высокоспецифический путь поступления в клетку многих биологически важных молекул после связывания их с соответствующим рецептором на плазматической мембране (ПМ). К таким молекулам относятся белки плазмы (липопротеины низкой плотности), полипептидные гормоны (инсулин), факторы роста (эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов) и др.
На самом деле оба пути в экспериментальных условиях достаточно тесно переплетены между собой. Так, было продемонстрировано, что т ростовые факторы встречаются в пиноцитозных везикулах при * определенных условиях (Hopkins et al., 1985), также как маркер конститутивного эндоцитоза, пероксидаза хрена, может поступать в клетку в одних пузырьках с ростовыми факторами (Synnes et al., 1999).
6. ВЫВОДЫ.
1. Рецептор в эндосомах не является прямой мишенью протеасом.
2. Действие синтетического ингибитора активности протеасом 1УЮ132 на прохождение ЭФР-рецепторных комплексов по эндоцитозному пути с наибольшей вероятностью связано с истощением внутриклеточного пула свободного убиквитина.
3. В ходе эндоцитоза рецептор подвергается нескольким актам убиквитинирования. Появление высокоубиквитинированных форм рецепторов ЭФР существенно как для их сортировки из ранних в поздние эндосомы, так и для полноценного созревания поздних эндосом.
4. Динамика убиквитинирования рецептора ЭФР в эндосомах коррелирует с фосфорилированием рецептора по тирозину и его ассоциацией с убиквитин-лигазой с-СЫ. Стимуляция эндоцитоза ЭФР приводит к образованию комплекса «с-СЫ-рецептор», а диссоциация комплекса происходит в поздних эндосомах, до попадания рецептора в лизосомы.
5. В сортировке рецепторов ЭФР в поздние эндосомы участвует Р13К III класса ЬУР834, а не рецептор-активируемая РОК I класса р85/р110.
6. Р13К регулирует более позднюю стадию в процессе перехода ЭФР-рецепторных комплексов из ранних эндосом в поздние, чем с-СЫ.
