Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Влияние органических растворителей на связывание профлавина и каталитическую активность бычьего панкреатического ?-химотрипсина

Диссертация: Влияние органических растворителей на связывание профлавина и каталитическую активность бычьего панкреатического ?-химотрипсина
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Интегральный анализ кинетических кривых ферментативной реакции. Научная новизна работы. В ходе работы было впервые исследовано влияние смесей воды с семью протоноакцепторными растворителями и рядом моноатомных алифатических спиртов во всем интервале составов, а также ряда гидрофобных органических растворителей, на каталитическую активность химотрипсина. Впервые разработана методика, позволяющая… Читать ещё >

Влияние органических растворителей на связывание профлавина и каталитическую активность бычьего панкреатического ?-химотрипсина (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
    • 1. 1. Каталитическая активность ферментов в неводных средах
    • 1. 2. Влияние содержания воды в системе вода-органический, растворитель на каталитическую активность ферментов
    • 1. 3. Влияние природы органического растворителя на свойства ферментов
    • 1. 4. Селективность и специфичность белков.40' в органических средах
    • 1. 5. Влияние способа приготовления белкового препарата на его свойства
    • 1. 6. Стабильность ферментов в органических средах
  • ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
    • 2. 1. Постановка задачи, выбор объектов исследования
    • 2. 2. Реактивы и материалы
    • 2. 3. УФ-спектрофотометрический эксперимент
    • 2. 4. Изучение каталитической активности фермента
    • 2. 5. Обработка кинетических кривых
    • 2. 6. Активность воды в органических средах.,
  • ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Влияние протоноакцепторных органических растворителей на каталитическую активность
    • 3. 2. Влияние органических растворителей на связывание < профлавина
      • 3. 2. 1. Спектры профлавина в воде и органических растворителях
      • 3. 2. 2. Связывание профлавина а-химотрипсином в воде
      • 3. 2. 3. Связывание профлавина а-хжютрипсипом в смесях воды с органическими растворителями
    • 3. 3. Сопоставление физико-химических параметров протоноакцепторных органических растворителей и воздействия водно-органических смесей на свойства фермента
    • 3. 4. ВЛИЯНИЕ СПИРТОВ НА КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ХИМОТРИПСИНА
    • 3. 5. Влияние гидрофобных растворителей на каталитическую активность химотрипсина
    • 3. 6. Интегральный анализ кинетики ферментативных реакций в случае протекания процессов денатурации/ренатурации

Актуальность работы. Ферментативный катализ в органических средах является одним из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии. На сегодняшний день ферментативный катализ в органических растворителях нашел применение в синтезе лекарственных препаратов, пищевых продуктов, реагентов тонкого химического синтеза. Исследование ферментативного катализа в органических средах позволяет не только оптимизировать многие биотехнологические процессы, но и значительно расширяет наше представление о факторах, определяющих каталитическую активность и стабильность биокатализаторов, предоставляя информацию, которая зачастую недоступна в рамках традиционных «водных» исследований.

Однако анализ литературных данных свидетельствует о том, что, не смотря на значительный практический интерес к ферментативному катализу в органических средах, многие фундаментальные особенности этого явления до настоящего времени не ясны. В частности, не ясны факторы, определяющие каталитическую активность и стабильность ферментов в водно-органических смесях во всем диапазоне составов.

Это предопределило наш интерес к свойствам белков в органических средах и, в частности, влиянию смесей воды с различными органическими растворителями на свойства модельного фермента — бычьего панкреатического а-химотрипсина.

Цель научной работы. Основной целью настоящей работы является установление физико-химических параметров, определяющих влияние водно-органических смесей во всем интервале составов на каталитическую активность бычьего панкреатического а-химотрипсина. Для достижения этого необходимо было решить следующие задачи.

— изучение влияния смесей органических растворителей с водой на каталитическую активность химотрипсина,.

— изучение связывания конкурентного ингибитора профлавина химотрипсинам в смесях протоноакцепторных растворителей с водой,.

— интегральный анализ кинетических кривых ферментативной реакции. Научная новизна работы. В ходе работы было впервые исследовано влияние смесей воды с семью протоноакцепторными растворителями и рядом моноатомных алифатических спиртов во всем интервале составов, а также ряда гидрофобных органических растворителей, на каталитическую активность химотрипсина. Впервые разработана методика, позволяющая исследовать связывание конкурентного ингибитора профлавина ,. в низководных органических средах. Связывание профлавина химотрипсином впервые изучено в широком диапазоне активностей воды в смесях воды с семью протоноакцепторными органическими растворителями. Разработаны подходы, позволяющие анализировать воздействие медленных процессов денатурации/ренатурации на протекание ферментативной реакции.

На защиту выносятся следующие положения:

Обнаружено, что смешивающиеся с водой протоноакцепторные растворители можно разделить на две группы по их влиянию на каталитическую активность и связывание конкурентного ингибитора профлавина бычьим панкреатическим а-химотрипсином. В растворителях первой группы (ацетонитрил, ацетон, диоксан и тетрагидрофуран) каталитическая активность подавлена в области активности воды -0.8, а зависимость связывания профлавина от состава водно-органическойсмеси имеет максимум в области средних активностей воды (0.5−0.6) — в растворителях второй группы (ДМФА, ДМСО, пиридин) положения минимума каталитической активности варьирует, связывание профлавина подавлено, либо (в ДМСО) на зависимости доли связанного профлавина от состава водно-органичской смеси отсутствует максимум в области средних активностей воды.

Деление растворителей на группы согласуется с различием в протоноакцепторной способности растворителя.

В ряду моноатомных алифатических спиртов (метанол, этанол, пропанол-1 и бутанол-1) в области высоких и низких активностей воды наблюдается противоположные зависимости между длиной углеводородного радикала и влиянием спирта на каталитическую активность фермента. В области низких активностей воды наибольшее инактивирующее действие проявляют спирты с небольшим размером радикала (метанол и этанол), а в области высоких активностей спирты с большей длиной радикала (пропанол-1 и бутанол-1). По влиянию на каталитическую активность фермента метанол близок к протоноакцепторным растворителям второй группы, а пропанол-1 и бутанол-1 к растворителям. первой, группы, этанол занимает промежуточное положение.

Установлено, что снижение каталитической активность фермента при его инкубации органических средах не сопровождается значимыми изменениями величин константы Михаэлиса, при этом максимальная скорость ферментативной реакции снижается, что свидетельствует о снижении доли каталитически активной формы фермента. Исключение представляют ароматические органические растворители, такие как толуол и бензол, которые являются конкурентными ингибиторами химотрипсина, они вызывают повышение величин константы Михаэлиса ферментативной реакции в воде.

Предложены модифицированные формы интегрального уравнения Михаэлиса-Ментен, которые позволяют учитывать искажение форм кинетических кривых за счет процессов денатурации/ренатурации. Полученные кинетические уравнения хорошо аппроксимируют экспериментальные кинетические кривые.

Практическая значимость работы состоит в том, что полученные в настоящей работе зависимости каталитической активности химотрипсина от состава водно-органических смесей позволяют определять оптимальный состав реакционной среды для проведения биокаталитических процессов. Проведенные в настоящей работе исследования являются основой для поиска путей повышения каталитической активности ферментов в органических растворителях. Предложены модифицированные формы интегрального уравнения Михаэлиса-Ментен, которые позволяют учитывать протекание, процессов ренатурации/денатурации фермента в ходе протекания реакции.

Структура работы. Работа изложена на 177 страницах, содержит 17 таблиц, 104 рисунка и 118 библиографических ссылок. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ.

1. В соответствии с данными по влиянию смесей воды с протоноакцепторными растворителями (ацетонитрил, ацетон, диоксан, ТГФ, пиридин, ДМФА и ДМСО) во всем интервале составов на каталитическую активность и связывание профлавина а-химотрипсином, изученные органические среды можно-разделить на две группы. Первую группу растворителей представляют ацетонитрил, ацетон, диоксан и тетрагидрофуран, вторую — пиридин, ДМФА и ДМСО. Деление растворителей на группы согласуется с протоноакцепторной способностью растворителя.

2. На основании данных по влиянию смесей воды с моноатомными алифатическими спиртами (метанолом, этанолом, пропанолом-1 и бутанолом-1) во всем интервале составов установлено, что в области высоких содержаний воды наибольшее денатурирующее действие проявляют пропанол-1 и бутанол-1. Величины пороговой термодинамической активности воды денатурации химотрипсина в высоководной области согласуются с гидрофобностью спиртов (1о§, Р). В' низководной области наибольшим инактивирующим действием обладают спирты с небольшим размером алкильного радикала — метанол и этанол, что согласуется-с представлениями ю доминирующей роли кинетических факторов в низководных средах.

3. Сопоставление данных полученных в протоноакцепторных растворителях и спиртах демонстрирует, что форма зависимости каталитической активности фермента от состава водно-органической смеси определяется соотношением между размером углеводородного радикала и способности растворителя к специфическому межмолекулярному взаимодействию.

4. Определены, величины максимальной скорости и константы Михаэлиса ферментативной, реакции катализируемой а-химотрипсином после инкубации в водно-органических смесях. Установлено, что инкубация фермента в органических средах не приводит значимым изменениям константы Михаэлиса, при этом наблюдается снижение максимальной скорости ферментативной реакции, что свидетельствует о снижении доли каталитически активной формы фермента. Исключение представляют ароматические органические растворители, такие как толуол и бензол, которые являются конкурентными ингибиторами химотрипсина, они вызывают повышение величин константы Михаэлиса ферментативной реакции в воде.

5. Предложены модифицированные формы интегрального уравнения Михаэлиса-Ментен, которые позволяют учитывать искажение форм кинетических кривых за счет процессов денатурации/ренатурации. Полученные уравнения хорошо аппроксимируют обнаруженные в работе искаженные кинетические кривые.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzymecatalysis and protein folding / A. Fersht. -Freeman&Co. New York. -1999. 631 p.
  2. Cooper, A. Thermodynamics of protein folding and stability / A. Cooper. -Published in Protein: A Comprehensive’Treatise. JAI Press Inc. -1999. -V.2. -P.217—220.
  3. Hailing, P. Why did biocatalysis in organic media not take off in the 1930s? / P. Halling, L. Kvittingen // Trends Biotechnol. -1999. -V.17. -P.343−344.
  4. Zaks, A. Enzyme-catalyzed processes in organic solvents / A. Zaks, A. M. Klibanov // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1985. -V.82. -P.3192−3196.
  5. Zaks, A. Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents / A. Zaks, A.M.Klibanov // J. Biol. Chem. -1988. -V.263. -P.3194−3201.
  6. Hudson, E.P.' Biocatalysis in semi-aqueous and nearly anhydrous conditions / E.P. Hudson, R.K. Eppler, D.S. Clark // Current Opinion in Biotechnology. -2005. —V.16. —P.637—643.
  7. Chaudhary, A.K. Rational control of polymer molecular weight and dispersity during enzyme-catalyzed polyester synthesis in supercritical fluids / A.K. Chaudhary, E.J. Beckman, A.J. Russell // J. Am. Chem. Soc. -1995 -Y.l 17. -P. 3728−3733.
  8. Bordusa, F. Proteases in organic synthesis. / F. Bordusa // Chem. Rev. -2002. -V.102. -P.4817−4867.
  9. Doolittle, M. Lipase and phospholipase protocol / M. Doolittle, K. Reue // -Humana. -1999. -354 p.
  10. Dai, L. Striking activation of oxidative enzymes suspended in nonaqueous media / L. Dai, A.M. Klibanov // Proc. Natl.Acad. Sci. -1999. -V.96. 94 759 478.
  11. Pedersen, N.R. Effcient transesterification of sucrose catalysed by the metalloprotease thermolysin in dimethylsulfoxide / N.R. Pedersen, P J. Hailing, L.H. Pedersen, R. Wimmer, R. Matthiesen, O.R. Veltman // FEBS Letters. -2002.-Y.519.-P. 181−184.
  12. Qian, C. Promiscuous acylase-catalyzed aza-Michael additions of aromatic N-heterocycles in organic solvent// C. Qian, J:-M. Xu, Q. Wu, D.-S. Lu, X.-F. Lin // Tetrahedron Letters. -2007. -V.48. -P.6100−6104. -
  13. Michizoe, J. Activation of manganese peroxidase, in an organic medium using- a mediator- / J. Michizoe, Y. Uchimura, H. Ichinose, T. Maruyama, N. Kamiya, H. Wariishi, S. Furusaki’i M. iGoto // Biochemical Engineering Journal -2004. —Y.19. -P.43−46.
  14. Zaks, A. The Effect of Water on Enzyme Action in Organic Media / A. Zaks, A.M. Klibanov//J. Biol. Chem. -1988. -V.263. -P.8017−8021.
  15. Yang, L. Hydration of enzyme, in nonaqueous media is consistent with solvent dependence of its activity". / 'L. Yang, J.S. Dordick, S. Garde // Biophysical Journal. -2004. -V.87. -P.812−821.
  16. Tomiuchi, Y. Fluorescence-?spectroscopic study of a-chymotrypsin as relevant to catalytic activity in aqueous-organic media / Y. Tomiuchi, T. Kijima, H. Kise // Bull.Chem. Soc. Jpn. -1993. -V.66. -P. 1176−1181.
  17. Sasaki, T. Active conformation of a-chymotrypsin in organic solvents as studied by circular dichroism / T. • Sasaki, M. Kobayashi, H. Kise // Biotechnology Techniques. 1997. — V. l 1. -P.387−390.
  18. Hailing, P. J. High affinity binding of water by proteins is similar in air and in organic solvents./ P. J. Hailing, // Biochim.Biophys.Acta —1990. -V.1040. — P.225—228.
  19. McMinn, J. H. The hydration of proteins in nearly anhydrous organic solvent suspensions / J. H. McMinn, M. J. Sowa, S. B'. Charnick, M. E. Paulaitis. // Biopolymers. -1993. -V.33. -P.1213−1224.
  20. Valivety, R.H. Reaction rate with lipase catalyst shows similar, dependence on water activity in different organic solvents / R.H. Valivety, P J. Hailing, A.R. Macrae //Biochim.Biophys.Acta. -1992. -V.Ill8. -P.218−222:
  21. Affleck, R. Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environments / R. Affleck, Z. Xu, V. Susava, K. Focht, D.S. Clark, J.S.Dordick // Proc. Natl. Sci. USA.-1992.-V.89,-P. 1100−1104. .
  22. , К. Взаимодействие конкурентных ингибиторов с активным центром а-химотрипсина / К. Мартинек, А. В. Левашов, И. В. Березин // Молекулярная Биология. -1970. -Вып. 3. -С.339−347.
  23. , К. Гидрофобное взаимодействие алифатических спиртов сактивным центром а-химотрипсина, / К. Мартинек, А. В. Левашов, И.В.
  24. Березин // Молекулярная Биология. -1970- -Вып. 4. -С.517−527.1. I. I.,. ч. 1. ли.>h.'167
  25. Fink, A.L. Effect of Dimethyl Sulfoxide on the Interaction of Proflavine with oc-Chymotrypsin / A.L. Fink // Biochemistry. -1974. -V.13. -P.277−280.
  26. Affleck, R. Solvent dielectric affects on protein dynamics / R. Affleck, C.A. Haynes, D.S. Clark//Proc. Natl. Sci. USA. -1992. -V.89. -P.5167−5170.
  27. Fitzpatrick, P.A. Enzyme crystal1 structure in neat organic solvent / P.A. Fitzpatrick, A.C.U. Steinmetz, D. Ringe, A. M. Klibanov // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1993. -V.90. -P.8653−8657.
  28. Schmitke, J.L. The crystal structure of subtilisin Carlsberg in anhydrous dioxane and its comparison with those in water and acetonitrile / J.L. Schmitke, L.J. Stern, A.M. Klibanov //-Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1997. -V.94. -P. 4250−4255. 1 .
  29. Schmitke, J.L. Organic solvent binding to crystalline subtilisin in mostly aqueous media* and< in the neat solvents / Schmitke J.L., Stern L.J.-, Klibanov A.M. // Biochemical and Biophysical' Research Communications. -1998. -V.248. —P.273−277. .?.
  30. Yennavar, N.H. X-ray crystal structure of y-chymotrypsin in hexane / N.H. Yennavar, H.P. Yennavar, G.K. Farber // Biochemistry. -1994. -V.32, -P.7326−7336.
  31. Wang, Z. X-ray studies on cross-linked lysozyme crystals in acetonitrile-water mixtures / Z. Wang, G. Zhu, M. Qian, M. Shao, Y. Jia, Y. Tang // Biochim. Biophys. Acta. -1998. -V.1384. -P.335−344.
  32. Zhu, G. X-ray studies on two forms of bovine p-trypsin crystals in neat cyclohexane / G. Zhu, Q. Huang, Z. Wang, M. Qian, Y. Jia, Y. Tang // Biochim. Biophys. Acta. -1998. -V.1429. -P. 142−150.
  33. Dennis, S. Computational mapping identifies the binding sites of organic solvents on proteins / S. Dennis, T. Kortvelyesi, S. Vajda // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2002. -V.99. -P.4290−4295.
  34. Gribenow, K. Lyophilization-induced reversible changes in the secondary structure of proteins / K. Gribenow, A.M. Klibanov // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1995. -V.92. -P. 10 969−10 976.
  35. Costantino, H.R. Fourier-transform infrared spectroscopic investigation of protein stability in the lyophilized form / H.R. Costantino, K. Griebenow, P. Mishra, R. Langer, A.M. Klibanov // Biochim. Biophys Acta. -1995. -V.1253. -P.69−74. -l4.
  36. Griebenow, K. Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carlsberg in organic solvents? / K. Griebenow, A.M. Klibanov // Biotechnol. Bioeng- -1997. -V.53. -P.351−362., .
  37. Dong, 1 A. Effect of secondary structure on the activity of enzymes suspended in’organic solvent / A. Dong, J.D. Meyer, B.S. Kendrick, M.C. Manning, J.F. Carpenter//Arch. Biochem. Biophys. -1996. -V.334. -P.406−414.
  38. Singer, S.J. The propeties of proteins in nonaqueous solvents // Adv. Protein Chem. -1962. -V.17. -P.l-68.
  39. Chang, N. Protein separation and purification in neat dimethylsulfoxide / N. Chang, S.J. Hen, A.M. Klibanov // Biochem. Biophys Res. Comm. -1991. -V. 176.-P. 1462−1468.
  40. , Ю.И. Влияние диметилсульфоксида на вторичную структуру некоторых5 глобулярных.I?белковь'/п Ю. И. Хургин, Ю. М. Азизов, JLB. Абатуров, Г. Н. Коган, В. Я. Росляков //Биофизика. -1972. -Т. 17. -С.390.
  41. Jackson, М. Beware of proteins in DMSO / M. Jackson, H.H. Mantsch // Biochim. Biophys. Acta. -1991. -V.1078. -P.231−235.
  42. Sirotkin, V.A. Interaction enthalpies of solid bovine pancreatic a-chymotrypsin with organic solvents: comparison with FTIR-spectroscopic data /
  43. V.A. Sirotkin, A.N. Zinatullin, B.N. Solomonov, D.A. Faizullin, V.D. Fedotov // Thermochimica Acta. -2002. -V.382. -P. 151−160.
  44. Benson, S.W. Surface areas of protein. II. Adsorption of non-polar gases / S.W. Benson, D.A. Ellis // J. Am. Chem. Soc. -1950. -V.72. -P.2095−2102.
  45. Gorbatchuk, V.Y. Vapor sorption of organic compounds on human serum albumin / V.V. Gorbatchuk, M.A. Ziganshin, B.N. Solomonov, M.D. Borisiver // J. Phys. Org. Chem. -1997. -V.10. -P.901−907.
  46. Gorbatchuk, V.V. Homotropic cooperative binding of organic solvent vapors by solid trypsin / V.V. Gorbatchuk, M.A. Ziganshin, N.A. Mironov, B.N. Solomonov // Biochim. Biophys. Acta. -2001. -V.1545. -P.326−338.
  47. Graber, M. Solvent as a competitive inhibitor for Candida antarctica lipase B / M. Graber, R. Irague, E. Rosenfeld, S. Lamare, L. Franson, K. Hult // Biochim. Biophys. Acta. -2007. -V.1774. -P. 1052−1057.
  48. Tawaki, S. Inversion of enzyme enantioselectivity mediated by the solvent / S. Tawaki, A.M. Klibanov // J. Amer. Chem. Soc. -1992. -V.114. -P.1882−1884.
  49. Wescott, C.R. The solvent dependence of enzyme specificity / C.R. Wescott, A.M. Klibanov //Biochim. Biophys. Acta. -1994. -V.1206. -P. 1−9.
  50. Zaks, A. Substrate specificity’of enzymes in organic solvents vs. Water is reversed / A. Zaks, A.M. Klibanov // J. Am. Chem. Soc. -1986. -V.108. -P.2767−2768.
  51. Carrea, G. Role of solvents in the control of enzyme selectivity in organic media / G. Carrea, G. Ottolina, S, Riva. // TIBTECH. -1995. -V.13. -P.63−70.
  52. Wescott, C. R' Rational control of enzymatic enantioselectivity through solvation? thermodynamics / C.R. Wescott, H. Noritomi, A.M. Klibanov // J. Am. Chem. Soc. -1996. -V.l 18. -P. 10 365−10 370.
  53. Zacharis, E. Volatile buffers can override the «pH memory» of subtilisin catalysis in organic media / E. Zacharis, P.J. Hailing, D.G. Rees // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1999- -V.96.-P.1201−1205.
  54. Ke, T. On Enzymatic activity in organic solvents as a function of enzyme history/ T. Ke, AMI Klibanov // Biotech: Bioeng. -1998. -V.57. -P:746−750.
  55. Stahl, M. Induced stereoselectivity and substrate selectivity of bio-imprinted a-chymotrypsin. in anhydrous organic media / Ml Stahl, U. Jeppson-Wistrand, M.-O. Mannson, K. Mosbach // J. Am. Chem. Soc. -1991. -V.113. -P.9366−9368.
  56. Rich, J O. Controlling subtilisin activity and selectivity in organic media by imprinting with nucleophilic substrates / J-.O. Rich, J.S. Dordick // J. Am. Chem. Soc. -1997. -V.T19. -P.3245−3252.
  57. Rich, J.O. Molecular imprinting- of. enzymes with water-insoluble ligands for nonaqueous biocatalysis / Js Ol Rich, .V.V. Mozhaev, J-S1 Dordick, D.S. Clark, Y.L. Khmclnitsky // J. Am. Chem. Soc. -2002. -V.124.-P.5254−5255.
  58. Khmelnitsky, Y.L. Salts -dramatically enhance activity of enzymes suspended in organic solvents / Y.L. Khmelnitsky, S.H. Welch, D.S. Clark, J.S. Dordick // J. Am. Chem. Soc. -1994. -V.l 16. -P.2647−2648.
  59. Ooe, Y. Increase of catalytic activity of a-chymotrypsin in organic solvent by co-lyophilization with cyclodextrins / Y. Ooe, S. Yamamoto, M. Kobayashi, H. Kise // Biotech. Lett. -1999. -V.21. -P.385−389.
  60. Distel, K.A. Biocatalysis using an organic-soluble enzyme for the preparation of poly (lactic acid) in- organic solvents / K.A. Distel, G. Zhu,.P. Wang // Bioresource Technology. -2005. -V.96. -P.617−623.
  61. , A.K. Стабильность ферментов в системах с органическими^ растворителями / А. К. Гладилин, А. В. Левашов // Биохимия —1998. -Т.63.1. C.408−421.
  62. Zaks, A. Enzymatic- catalysis in organic media at 100 °C / A. Zaks, A.M. Klibanov // Science. -1984.-V.224. -P. 1249−1251.
  63. Volkin, D.V. Enzyme thermoinactivation in anhydrous organic solvents /
  64. D.V. Volkin, A. Staubli, R. Langer, A.M.- Klibanov // Biotechnol. Bioeng. -1991. —V.37. —P.843−853.
  65. Ayala, G. Thermostability of membrane enzymes in organic solvents / G. Ayala, M.T. Gomez-Puyou, A. Gomez-Puyou, A. Drszon // FEBS Lett. -1986. -V.203. —P.41—43.
  66. Pazhang, M. Effects of water-miscible solvents and polyhydroxy compounds on the structure and enzymatic activity of thermolysin / M. Pazhang, K. Khajeh,
  67. B. Ranjbar, S. Hosseikhani // Journal of Biotechnology. -2006. -V.127. -P.45−53.
  68. Gribenow, К. On protein denaturationin Aqueous-Organic Mixtures but not in Pure Organic Solvents / K. Gribenow, A.M. Klibanov // J. Am. Ghem. Soc. -1996.—V.l 18.-P.l 1695−11 700. n:. .
  69. , B.A. Сорбция паров воды и ацетонитрила сывороточным альбумином человека / В. А. Сироткин, Б. Н. Соломонов, Д. А. Файзуллин, В. Д. Федотов // Журнал физической химии. -2002. —Т. 76. -С.2255−2262.
  70. Ogino, H. Stabilities and conformational transitions of various proteases in the presence of an organic solvent / H. Ogino, Y. Gemba, Y. Yutori, N. Doukyu, K. Ishimi, H. Ishikawa // Biotechnol. Prog. -2007. -V.23. -P. 155−161.
  71. Mozhaev, Y.V. Catalytic activity and denaturation of enzymes in water/organic cosolvent mixtures. / V.V. Mozhaev, Y.L. Khmelnitsky, — M.V. Sergeeva, A.B. Belova, N.L. Klyachko, A.V. Levashov, K. Martinek // Eur. J. Biochem: -1989: -V.184. -P-597−602:
  72. Gupta, M.N. Polarity index: the guiding solvent parameter for enzyme stability in aqueous-organic cosolvent-mixtures / M.N. Gupta, R. Batra, R. Tyagi, A. Sharma // Biotechnoh. Prog-.M997:v^V-.13- -PI284−288:
  73. Simon, L.M. Stability of hydrolytic enzymes in water-organic solvent systems / L. M: Simony K. Laszlo, A. Vertesi, K. Bagi, B. Szajeni // J. Mol. Catal. B: Enzym. -1998.-V.4. -P.41−45.
  74. Simon, L.M. The effects of organic solvent/water mixtures on the structure and catalytic activity of porcine pepsin / L.M. Simon, M. Kotorman, A. Szabo, J. Nemcsok, I. Laczko // Process Biochemistry. -2007. -V.42. -P.909−912.
  75. Ruth, D.M. Solvent and thermal stability, and pH kinetics, of proline-specific dipeptidyl peptidase IV-like enzyme from, bovine serum / D: M. Ruth, S. J- Buckley, B1 °F.O'Connor, C. O’Fagain // Enzyme and Microbial Technology -2007. -V.4T. -P-307−311.
  76. Fernandes, J-F.A. Operational!-Stability of High Initial Activity Protease Catalysts in Organic Solvents / J.F.A. Fernandes, P.J. Hailing // Biotechnoh Prog. -2002. -V. 18. -P. 1455−1457. .
  77. Мосолов, B. B- Протеолитические ферменты / В .В. Мосолов- -М. -1971.-404с... .
  78. , В.А. Влияние ацетонитрила на связывание конкурентного ингибитора профлавина и каталитическую активность бычьего панкреатического а-химотрипсина / В.А. Сироткин- Т. А. Мухаметзянов // Журн. физ. химии.-2006.-Т.80.-С.923−928.
  79. , В.А. Влияние диоксана на связывание конкурентного ингибитора профлавина и каталитическую активность бычьего панкреатического- а-химотрипсина / В. А. Сироткин, Т. А. Мухаметзянов Ю.В. Карманова // Журн. физ. химии.-2007. -Т81. -С. 1160−1164-
  80. Клёсов, А.А., Ферментативный- катализ / А. А. Клёсов, И.В. Березин- -Изд-во Моск. Ун-та. -1980- -Т. 1. -264 с.. i'105." Schnell^ Si. Closed--form solution! for. time-dependent enzyme kinetics / S.
  81. Schnell- C. Mendoza// J: Theor. Biol. -1997. -V.187i.^P-207−212I, ?
  82. Dixon, — M. Enzymes / M. Dixon, E.G. Webb- -kongmans. -1964. -950 p.
  83. Краткий справочник физико-химических величин / Под. ред.: Равдель А. А., Пономарева А. М-'-Л-- Химия.-1983.-231 с.
  84. Bernhard, S. A: On the interaction of the active site of a-chymotrypsimwith' chromophores: proflavine binding and enzyme conformation during- catalysis / S.A. Bernhard, B.F. Lee, Z. H- Tashjian// JC Mol. Biol: -1966. -V.18. -P.405−420.
  85. Glazer, A.N.'Spectral studies-of the interaction of a-chymotrypsin and trypsine with proflavine / A.N. Glazer // Proc. N.A.S. Biochemistry. -1965. -V.54. -P. 171—176-s
  86. Himoe, A. Investigation of the chymotrypsin catalysed hydrolysis of specific substrates / A. Himoe, K.G. Brandt, R.J. DeSa, G.P. Hess // J.Biol.Chem. -1969. -V.244. -P.3483−3493.
  87. , O.B. Электронные спектры в органической химии / О. В. Свердлова. —JL- Химия. —1978. -248 с.
  88. , М.Д. Денатурированное состояние лизоцима в диметилсульфоксиде / М. Д. Киркитадзе, А. К. Сурин, С. А. Потехин // Биоорганическая химия. -1996. -Т.22. -С.20−23.
  89. Klyosov, A.A. The reaction of a-chymotrypsin and related proteins with ester substrates in non-aqueous solvents / A.A. Klyosov, N. Van Viet, I.V. Berezin // Eur. J. Biochem. 1975. -V.59. -P.3−7.
  90. , Ю.И. Изучение твердофазных ферментативных реакций III. Необратимая инактивация а-химотрипсина бензилсульфонилфторидом / Ю. И. Хургин, Е. Ю. Максарева // Биоорганическая химия. -1991. -Т. 17. -С.76−80.
  91. Solomonov,' B.N. Calorimetric- determination of the hydrogen-bonding enthalpy for the neat aliphatic alcohols / B.N. Solomonov, V.B.Novikov, M.A.Varfolomeev, A.E.Klimovitskii // Journal of Physical Organic Chemistry. -2005.-V.18.-P.1132−1137.
  92. Бендецкий, K. M: Интегральный анализ кинетики ферментативных реакций / K.M. Бендецкий // Молекулярная биология. -1968. -Т.2. -С.3−11.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!