Влияние токсикантов на личиночное развитие озерной лягушки

[Введите текст]

1. Аналитический обзор

1.1 Влияние тяжёлых металлов на развитие головастиков

1.2 Влияние нефти на икру и головастиков земноводных

1.3 Влияние пестицидов на икру и головастиков земноводных

1.4 Влияние металлов в наноформе на живые организмы

2. Материал и методы исследований

3. Влияние токсикантов на личиночное развитие озёрной лягушки

3.1 Влияние токсикантов на выживаемость головастиков озёрной лягушки

3.2 Влияние токсикантов на темпы роста головастиков озёрной лягушки

3.3 Влияние токсикантов на темпы развития головастиков озёрной лягушки Заключение Библиографический список

Токсиканты антропогенного происхождения многообразны, как многообразна человеческая жизнедеятельность [Яржомбек, Михеева, 2007].

Это пестициды (инсектициды, гербициды, фунгициды), дефолианты, промышленные и бытовые сточные воды. Потенциальную опасность отравления представляют тяжёлые металлы и токсически действующие неметаллы, масла, полихлордифенилы и фталаты; антибиотики и сульфонамиды, а также биотоксины. В списке наиболее значимых антропогенных загрязнителей среды первые места занимают пестициды, тяжёлые металлы, диоксид углерода, диоксид серы и продукты ее окисления, взвеси; разливы нефти, сточные воды промышленных предприятий [Инге-Вечтомов, 1998]. В последние годы появился абсолютно новый тип загрязнителей — «нановещества», частицы которых имеют размеры 10−100 нм. Их влияние на живые организмы почти не изучено, хотя проникающая способность значительно выше, чем у обычных токсикантов, и, следовательно, их влияние на живые организмы потенциально велико [Магнитные наночастицы, 2005].

Гидробиологической науке и одному из её разделов — водной токсикологии принадлежит ведущая роль в обосновании мероприятий, направленных на охрану чистоты водной среды [Флеров, 1989].

В обнаружении антропогенного загрязнения урбанизированных территорий всё чаще используют животных, жизненный цикл которых охватывает как водную, так и наземную среду. Наиболее пригодны для этих целей земноводные. Одним из преимуществ земноводных в данном случае является их постоянное присутствие в наземных и околоводных (водных) биотопах урбоэкосистем. При этом они реагируют как на краткосрочные и залповые выбросы токсических веществ, так и на хроническое загрязнение [Можановский, Сытник, 2005].

Личинки амфибий являются превосходным материалом для экспериментальных исследований. Головастиков легко добывать в больших количествах и многочисленных пресных водоёмах. Постэмбриональное развитие протекает в течение нескольких недель [Пястолова, 1989]. Личиночные стадии развития земноводных обладают высокой чувствительностью по отношению к самым разным токсикантам. Среди ответных реакций личинок земноводных выделяют как общие, так и специфические морфологические и физиологические изменения, по которым возможно судить о качественных и количественных показателях загрязнения водоёма. Объектом данного исследования является озёрная лягушка. Предмет данной магистерской диссертации динамика показателей головастиков озёрной лягушки под действием различных типов токсикантов, загрязняющих водоёмы. Цель данной магистерской диссертации в лабораторных условиях выяснить влияние различных типов токсикантов на биологические показатели головастиков озёрной лягушки.

Для этого надо было решить следующие задачи:

1. Сравнить смертность головастиков озёрной лягушки в контроле и растворах различных токсикантов;

2. Сравнить скорость роста и развития головастиков озёрной лягушки в контроле и растворах исследованных концентраций токсикантов;

3. Оценить влияние оксидов металлов в наноформе на биологические показатели головастиков при их добавлении к исследуемым токсикантам.

Научная новизна и теоретическое значение работы Установлены как общие тенденции влияния органических и неорганических загрязнителей на личиночные стадии развития озёрной лягушки, так и специфика воздействия исследованных токсикантов различной природы на головастиков.

Практическая значимость результатов Полученные материалы могут быть использованы Краевым Комитетом по охране окружающей среды и природных ресурсов при оценке антропогенного воздействия на водные биотопы. Основные результаты исследования и положения магистерской диссертации могут быть использованы в учебном процессе на биологическом факультете КубГУ при чтении лекций в курсах Водной токсикологии, Биологии развития водных животных, Герпетологии.

Апробация результатов исследования Результаты исследования докладывались на 23 Межреспубликанской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий» в апреле 2010 г.

Был получен диплом участника первого тура конкурса «Лучшая научная и творческая работа студентов высших учебных заведений Краснодарского края», Краснодар, 2011.

Публикации по теме магистерской диссертации Опубликована статья на тему «Влияние нефти на биологические показатели головастиков озёрной лягушки» в сборнике «Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий», Краснодар, 2012, С.102−104. А также в сборнике всероссийской научной конференции «Животные: экология, биология и охрана» на тему «Влияние пестицидов на развитие головастиков озерной лягушки», Саранск, 2012, С. 178−180.

Основные положения, выносимые на защиту Органические вещества оказывают более токсичное воздействие на выживаемость головастиков озёрной лягушки, чем неорганические загрязнители. Гибель головастиков в растворах пестицидов и нефти начинается сразу после их помещения в раствор, а в солях тяжёлых металлов гибнуть головастики начинают на 10−15 день.

Большинство исследованных токсикантов (нефть, пестицид — цинеб, соли металлов) замедляют темпы роста тела головастиков. Пестициды лондакс и фозалон, а также оксиды Co и Ni в наноформе в смеси с другими токсикантами не изменяют скорость роста головастиков озёрной лягушки.

3. Большинство исследованных токсикантов замедляет скорость развития головастиков озёрной лягушки. Пестицид лондакс, соли Al2(SO4)3 и Co (NO3)2 не влияют на этот показатель. CoО при добавлении к Al2(SO4)3, Co (NO3)2 и Ni (NO3)2 убыстряет сроки наступления основных стадий развития головастиков.

Магистерская диссертация написана на 81 странице машинописного текста, состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы, в котором приведено 70 литературных источников, из них 17 иностранных. В диссертации 17 таблиц и 1рисунк.

1. Аналитический обзор

В качестве универсальных биоиндикаторов и биомониторов состояния окружающей среды предлагается использовать земноводных. Многие особенности биологии делают их наиболее удобными объектами биоиндикации [Леонтьева, Семёнов, 1997]. Эмбрионы и молодь водных животных являются уникальной природной моделью для исследования механизмов повреждений, вызванных токсическими агентами, т. е. нарушения субклеточных процессов, возникающих в момент воздействия, в результате развития эмбриона быстро визуализируются и могут быть зарегистрированы морфометрически (появление уродств, изменение скорости или остановка развития) [Мелехова, 1994].

1.1 Влияние тяжёлых металлов на развитие головастиков

Был проведён опыт по влиянию различных токсикантов на зародыши (гаструлы) травяной (Rana temporaria L.) и шпорцевой (Xenopus laevis D.) лягушек. Для каждого опыта отобрали по 25 зародышей, стандартизированных по возрасту. Опыты осуществляли следующим образом: инкубировали зародыши в присутствии токсикантов различной природы в концентрациях, близких к предельно допустимым хозяйственным. Время инкубации — 90 мин. 100%-ная гибель головастиков наблюдалась в опытах с медным купоросом (0,4 мг/л), хлористым литием (1,5 мг/л), ДДТ (следы 0,1 мг/л), атразина (0,005 и 0,0005 мг/л). С такими же веществами, как медный купорос (0,0004 мг/л), солярное масло (0,01 мг/л), хлористый литий (0,015 мг/л), вызывалась гибель 40?60% исследуемых объектов. Наименьший процент гибели зародышей (20%) вызывали: медный купорос (0,0004 мг/л) и солярное масло (0,0001 мг/л). Все эти вещества встречаются в сточных водах в техногенных зонах [Мелехова, 1994].

Был проведен ряд опытов по влиянию Cd на развитие головастиков. З. С. Токтамысовой и Е. В. Кайдауловой были взяты личинки озёрной лягушки (Rana ridibunda Pall.). Из них для исследования были отобраны особи, по таблице стадий нормального развития травяной лягушки [Дабагян, Слепцова, 1975] соответствовавшие возрасту 45−54 дня (исходные масса и длина тела используемых личинок составляли в среднем 223,2 15,0 мг и 30,0 0,6 мм соответственно. Личинок контрольной и опытных групп (по 20 экземпляров в каждой) содержали в стеклянных кристаллизаторах с отстоявшейся водой объёмом 1 л при температуре 20оC. На протяжении опыта личинок кормили протёртыми листьями одуванчиков. Кадмий добавляли в количестве 5 и 15 мг/л. При измерении веса и размеров тела личинки находились на влажном фильтре. Рост, развитие и интенсивность дыхания личинок оценивали в течение 14 дней. Развитие и рост личинок в контроле и при концентрации 5 мг/л кадмия в растворе отмечается незначительно: к 5-му дню наблюдения фиксируются изогнутость на уровне колен, а к 7-му — появление тупого угла в коленном суставе и видимость очертаний передних конечностей с брюшной поверхности (в эти же дни длина хвоста достигает максимума — 20 мм), к 12-му — последовательный выход левой и правой передних конечностей и начало редукции хвоста (14 мм), к 14-му — тазобедренный и коленные суставы находятся по отношению друг к другу под прямым углом. При концентрации Cd в растворе 15 мг/л картина резко меняется: за исключением двух головастиков, развитие которых происходит аналогично контролю, рост и развитие остальных останавливается и находится на уровне первого дня наблюдения. На 12?14-й дни отмечается загибание хвостов, пассивное поведение, а также гибель четырёх особей.

В другом опыте с озёрными лягушками в течение 10 дней их экспонировали в воде, содержащей 200 мг/кг кадмия (CdCl2), а затем помещали в чистую воду на срок до 30 дней для детоксикации. Показано, что накопление Cd в печени и почках происходило и после перевода лягушек в чистую воду; концентрация Cd в коже и кишечнике значительно возрастала при экспозиции [Vogiatriz, Loumbourdis, 1997]. Влияние Cd изучали и на развитии американских жаб (Bufo americanus) и леопардовых лягушек (Rana sphenocephala). Их содержали в модельной среде, имитирующей условия нахождения в пруду при концентрации Cd2+ 5?200 мкг/л на протяжении до 43 дней. Выживаемость американских жаб при воздействии Cd2+ в концентрации 18?200 мкг/л снижалась с 88,6 до 70 (16%), а леопардовых лягушек при воздействии Cd2+ в концентрации 5?60 мкг/л — с 90,5 до 75 (11,6%). Влияние Cd на метаморфоз не обнаружено. В максимальной концентрации Cd2+ тормозил метаморфоз леопардовых лягушек до 60%. Накопление Cd у жаб было более значительным, чем у лягушек [Stasy, Little, Semlitsch, 2005]. В другой работе определяли 24-часовую, 48-часовую, 72-часовую и 96-часовую LC50, LC100, LC0 и безопасную концентрацию для головастиков Rana chenensis, содержавшихся в воде с ионами Cd2+. Смертность головастиков увеличивалась с увеличением концентрации Cd в воде и с увеличением длительности экспозиции, причём токсичность Cd была выше в деионизированной воде. Безопасные концентрации Cd для головастиков на стадии развития 26?27 были 0,05; 0,1; 0,2 и 0,4 мг/л. Линейный и весовой рост головастиков сильно понижался с увеличением концентрации Cd. Даже в безопасных концентрациях Cd может быть причиной отставания в росте и задержки метаморфоза у головастиков [Huang, Zhang, 2006]. Также было изучено инотропное действие Cd2+ на сердце лягушки. Установлено, что Cd2+ в концентрациях 1, 10 и 20 мкМ дозозависимо (21,3; 50,3 и 72,0% соответсвенно) уменьшает амплитуду мышечного сокращения, что объясняется его конкурентным действием на потенциал управляемые Cа2+ ?каналы L? типа (Cа, 1,2) [Шемаров, Коротков, Нестеров, 2011]. Также была изучена токсичность кадмия для головастиков Rhinella arenarum [Mastrangelo, Dos, Ferrari, 2011].

Много работ по изучению влияния солей тяжёлых металлов было проведено Песковой Т. Ю. Так, в одной из работ по влиянию солей тяжёлых металлов на смертность головастиков бесхвостых амфибий [Пескова, 1997] было исследовано влияние сульфата меди CuSO4*5H2O в концентрациях 1, 2, 3, 10 и 20 мг/л на головастиков озёрной лягушки, зелёной жабы и гладкой шпорцевой лягушки; а также сульфата кадмия 3CdSO4*8H2O в концентрациях 1, 2 и 3 мг/л. В контроле личинки находились в чистой, отстоянной воде. В эксперимент взяты головастики всех видов земноводных сразу после выклева. Плотность личинок в аквариуме — 3 особи/л, начальное количество личинок — 15?20 особей, температура воды 23?25оС. Сульфат меди практически во всех исследованных концентрациях наиболее токсичен для головастиков гладкой шпорцевой лягушки, на 2? м месте головастики зелёной жабы, а наименьшая токсичность отмечена для головастиков озёрной лягушки. Сульфат кадмия (в трех изученных концентрациях), наоборот, наименее токсичен для личинок шпорцевой лягушки, за этим видом амфибий идёт озёрная лягушка, а на 3-м месте краснобрюхая жерлянка. 50% гибель головастиков краснобрюхой жерлянки в растворах соли кадмия происходит на 8?23 дней раньше, чем у озёрной лягушки. У головастиков озёрной лягушки уродств и аномалий было отмечено сравнительно немного, а у остальных видов вообще не было. Из аномалий наблюдали искривление хвоста, водянку полости тела, белые пятна на голове.

В другом исследовании того же автора [Peskova, 1998] показано, что для головастиков озёрной лягушки, токсичность солей тяжёлых металлов убывает в следующем порядке: Cu > Cd > Pb > Zn. Динамика гибели головастиков этого вида и день достижения 50% гибели определяется не природой токсиканта, а его концентрацией и продолжительностью воздействия. Токсичность солей тяжёлых металлов с возрастом увеличивается для головастиков озёрной лягушки, а для головастиков зелёной жабы снижается.

В другом опыте изучали общую токсичность ионов меди, цинка и кадмия для головастиков Bufo bufo gargarizans. Острая токсичность Cu2+, Cd2+ и Zn2+ снижалась в ряду Cu2+ > Cd2+ >Zn2+ 48-час. LC50 для Cu2+, Cd2+ и Zn2+ была 0,288; 8,142 и 30,76 мг/л, соответственно. При экспозиции головастиков к различным смесям ионов, обнаружено, что Zn2+ с Cu2+, и Cd2+ с Zn2+ были антагонистами, а Cu2+ и Cd2+ оказывали синергическое действие [Yang, Jia, 2006].

В лабораторных условиях проведено сравнение действия одинаковых концентраций сульфата железа на головастиков двух видов бесхвостых амфибий — озёрной лягушки и зелёной жабы [Пескова, Жукова, 2000]. Анализировались смертность головастиков и её динамика, продолжительность личиночного развития, размеры метаморфизирующих животных, отмечались аномалии и уродства у головастиков. Взятые концентрации: 0,5; 5,0; 10,0 мг/л Так все исследованные концентрации сульфата железа были значительно токсичнее для головастиков зелёной жабы: Самый разбавленный раствор (0,5 мг/л) вызывал гибель 78% головастиков этого вида, в то время как у озёрной лягушки в этом растворе погибают только 38%; уровень 50%?ной смертности для головастиков зелёной жабы отмечен на 8?26 день после начала эксперимента, а для озёрной лягушки он вообще не достигнут даже в самом концентрированном растворе сульфата железа (10 мг/л), в растворах соли железа концентрации 5 и 10 мг/л гибнут 100% головастиков зелёной жабы на 70-й и 60-й дни соответственно.

В начале эксперимента, при посадке, головастики зелёной жабы в контроле и опытных группах имеют одинаковую длину тела. До 40 дня контрольные головастики по линейным размерам достоверно превосходят всех опытных. К 50-му дню в контроле головастики дальше всех продвигаются в развитии, у отдельных особей начинается редукция хвоста и в результате их средняя величина тела начинает уменьшаться. В растворах с сульфатом железа головастики продолжали расти в длину и достигали максимальных размеров, отмеченных у контрольных в предыдущий день наблюдения, поэтому при сравнении головастиков на 50 день опытные крупнее контрольных (t=2,69). На 60?70 день развития головастики из раствора сульфата железа достоверно меньше, чем контрольные животные, а при метаморфозе достоверно превосходят контрольных особей.

В контроле основные фиксируемые стадии развития наступают относительно рано и одновременно у всех. В растворе FeSO4 0,5 мг/л наступление этих стадий растянуто во времени. Так, на 40 день лишь у 33,3% головастиков появляются задние конечности и только к 50? му дню они появляются у всех. Передние конечности отмечены у всех опытных головастиков на 60 день — на 10 дней позднее, чем в контроле. Метаморфоз происходит одновременно в растворе соли железа и контроле? на 70 день. В растворе концентрации 10 мг/л идёт резкое ингибирование роста и развития головастиков зелёной жабы, которые в основном (72,5%) гибнут в первые 20 дней после помещения их в раствор соли, за следующие 20 дней число оставшихся в живых сокращается до 7,5%, последние гибнут к 60 дню на 39 стадии. Таких размеров в контроле головастики достигают на 40 день, и у них при этом хорошо развиты задние конечности (46 стадия). Сульфат железа в изученных концентрациях не оказывает существенного влияния на длительность процессов развития головастиков озёрной лягушки, и только в растворах 5 и 10 мг/л редукция хвоста заканчивается позднее на 3 дня. У 10?20% головастиков и сеголеток озёрной лягушки при развитии в растворах сульфата железа отмечено потемнение кожных покровов при одновременном нарушении двигательной и пищевой активности [Пескова, Жукова, 2000].

В другом опыте [Пескова, 2003в] были изучены такие концентрации FeSO4 как 1,0 и 3,0 мг/л. Общий объём материала: 450 головастиков озёрной лягушки и 225 зелёной жабы. Установлено, что исследованные концентрации FeSO4 по всем показателям значительно токсичнее для головастиков зелёной жабы. Результаты проведённого эксперимента позволяют утверждать, что более широкое распространение в условиях антропогенного загрязнения озёрной лягушки с зелёной жабой объясняется, в частности большей устойчивостью этого вида к токсикантам на ранних стадиях индивидуального развития.

Еще в одном исследовании [Пескова, 2001] были изучены аномалии развития головастиков озёрной лягушек в растворах солей тяжёлых металлов. Для опыта взяты личинки озёрной лягушки на 31?32 стадиях развития, плотность посадки 5 особей на литр. В сосуды помещены чистая отстоявшаяся вода (контроль) и растворы следующих солей тяжёлых металлов — 1) Cd; 2) Cd и Cu; 3) Cd, Cu и Fe; 4) Cd, Cu, Fe и Pb; 5) Cd, Cu, Fe, Pb и Zn (CuSO4, CdSO4, FeSO4 и ZnSO4; PbNO3; концентрации всех солей, кроме ZnSO4,? 0,5 мг/л, а ZnSO4 — 6 мг/л).

В процессе эксперимента у головастиков наблюдались аномалии развития в виде изменения окраски тела и сколиоза — искривление позвоночника в латеральном направлении (в области перехода туловищного отдела в хвостовой). Следствием этого было нарушение координации движения и общей двигательной активности животных. В контроле аномалий в развитии головастиков не было. В смеси пяти солей со сколиозом появились раньше всех других вариантов опыта (на 13 день) и общее число мутантных головастиков здесь было максимальным — 30%. Наименьшее число особей с искривлённым позвоночником отмечено в растворе одного кадмия, а также в тройной смеси солей — их всего по 5%, хотя в двойной смеси (Cu и Cd) их 15%. Искривление позвоночника наблюдается у головастиков при длине тела от 18 до 38 мм, при этом мелкие особи погибают очень быстро, а крупные при сколиозе ещё некоторое время продолжают расти, после чего их развитие замедляется, снижается плавательная активность и наступает гибель.

Среди головастиков озёрных лягушек с нормальной тёмно? серой окраской тела были отмечены в эксперименте особи с более светлой окраской. Такие головастики появились на разных стадиях развития и сохраняли данный признак до окончания опыта или момента гибели. В целом сделан вывод, что состав смесей растворов солей тяжёлых металлов влияет на изменение окраски головастиков и их последующее развитие. Наименьшее число посветлевших головастиков отмечено в растворе кадмия. Добавление меди в раствор увеличивает количество посветлевших особей, которые развиваются хуже других в этой выборке. В присутствии смесей железа, хоть и растёт число более светлых головастиков, но последние развиваются нормально. При добавлении соли свинца окраска меняется у меньшего числа головастиков, которая развивается медленнее других. В присутствии цинка возрастает число особей с более светлой окраской, их развитие замедляется, что приводит к гибели. Т.о., в проведённом опыте в наименьшей степени зарегистрировано появление аномалий в растворе сульфата кадмия, а также в растворе смеси трёх солей — сульфатов кадмия, меди и железа [Пескова, 2001].

Также было доказано, что смертность головастиков озёрной лягушки и зелёной жабы в присутствии смесей солей тяжёлых металлов, как правило, ниже, чем в растворах отдельных солей, однако выжившие головастики медленнее развиваются и завершают метаморфоз при меньших размерах тела [Пескова, 2003а].

В.И. Крюковым было исследовано влияние свинца на индукцию микроядер у личинок бесхвостых амфибий. Материалом для исследований служили личинки зелёной жабы (Bufo viridis), отловленные в искусственном водоёме на 46-й и 47-й стадиях развития. Личинок по 7 особей группами помещали на 6, 12, 18 и 24 часов в раствор азотнокислого свинца с конечной концентрацией Pb+2 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 мг/л. Контролем служила группа личинок, которая не подвергалась воздействию свинца. После экспозиции головастиков переносили в чистую воду на 24 час. По истечении указанного срока у пяти выбранных в каждой группе личинок отсекали заднюю треть хвостового плавника и готовили мазки крови, которые после высыхания окрашивали. На окрашенных препаратах анализировали по 2000 нормальных эритроцитов от каждого животного, фиксируя при этом число клеток с микроядрами. Выявлено, что повышение концентрации свинца в воде и увеличение продолжительности его воздействия на животных ведут к увеличению частоты клеток с микроядрами. Шестичасовая экспозиция приводит к статистически достоверному увеличению числа микроядер при концентрации 1,0 мг/л и более. Экспозиции 12, 18 и 24 часов вызывают статистически достоверное увеличение частоты микроядер у головастиков уже при концентрации Pb+2 0,2 мг/л [Крюков, 2000].

В Киевском национальном университете им. Т. Шевченко [Можановский, Сытник, 2005] была проведена работа по выявлению содержания тяжёлых металлов в организме бурых лягушек. В задачи исследования входило изучение уровней содержания и распределения тяжёлых металлов (свинца, кадмия, цинка, меди и хрома) в организме двух видов бурых лягушек Rana temporaria (Linnaeus, 1758) и Rana arvalis (Linnaeus, 1758) из биотопов, прилегающих к некоторым водоёмам городской зоны Киева. Определяли содержание металлов в следующих органах и тканях: лёгкие, печень, кожа, мышцы. Изучаемые металлы были зафиксированы во всех исследуемых органах и тканях. Из всех исследованных возрастных групп, наибольшее содержание тяжёлых металлов обнаружено в организме сеголеток обоих видов бурых лягушек из всех биотопов. С увеличением возраста до 2+ происходит снижение содержания тяжёлых металлов в органах и тканях, после чего следует постепенное повышение содержания с его последующей относительной стабилизацией для особей трёх? пятилетнего возраста. Содержание хрома в меньшей степени подвержено колебаниям. Наибольшее содержание свинца, кадмия и меди у Rana arvalis практически во всех исследуемых образцах.

Г. С. Суровой было изучено влияние кислой среды на жизнеспособность икры травяной лягушки. Так, сравнивали влияние высокой кислотности на жизнеспособность крупных и мелких яиц в двух географических популяциях: на севере (о?в Соловецкий) и в центре ареала (Подмосковье) в природных водоёмах и эксперименте. На севере яйца в кладках гораздо крупнее, чем самые крупные из икринок в Подмосковье. Показано, что размер яйца не влияет на выживаемость зародышей ни в кислой, ни в нейтральной среде. Кислая вода достоверно (хотя и незначительно — до 5%) повышает смертность в эксперименте. При обследовании 14 искусственных водоёмов (pH от 4,5 до 7,0) установлена чёткая корреляция между уровнем гибели и величиной pH. Отмечено, что крупные размеры кладок и их скоплений защищают зародышей, располагающихся в их центральной части от губительного воздействия кислой воды.

В другом опыте [Северцова, Северцов, 2001] изучали влияние химического состава воды на гаструляцию травяной лягушки. Это исследование проводилось на естественных нерестилищах этого вида, расположенных в черте г. Москвы и Подмосковье. Пробы икры из московского водоёма сразу после оплодотворения делись на две серии. Зародыши серии 2 развивались в воде из московского водоёма, загрязнённого поллютантами (Al, Fe, Zn, Pb и нефтепродукты). Зародыши серии 1, взятые от тех же кладок, что и зародыши серии 2, развивались в чистой отстоянной воде. В состав серии 3 входили зародыши травяной лягушки из подмосковной популяции. Так, выявлено, что, во? первых, химический состав воды оказывает существенное влияние на эмбриогенез травяной лягушки, увеличивая изменчивость основных морфометрических признаков гаструл. Также возрастает скоррелированность эмбриогенеза за счёт установления не жёстких, но значимых связей между формирующимися структурами гаструлы; во? вторых, повышение концентрации потенциально токсических элементов оказывает наиболее существенное влияние на те структуры гаструлы, формирование которых происходит на стадии исследования.

В.А. Бахарев изучал влияние техногенных поллютантов на особенности постнатального развития личинок травяной лягушки. Результаты эксперимента показывают, что при изначально одинаковой стадии развития личинок (23?25) через неделю начало проявляться влияние поллютантов на рост и развитие личинок: а) растворы солей Cr, Mn, Pb, Cd, Cu с этого времени вызывали ингибирование, а в некоторых случаях (5 ПДК) — летальный исход. При меньших концентрациях (1 ПДК) отмечали адаптацию к поллютантам и даже некоторое ускорение развития к концу третьей — началу четвёртой недели по сравнению с контрольными (растворы солей Cd и Mo, Cu); б) фенол к концу эксперимента (срокам метаморфоза) ускорял развитие, а анилин, наоборот, вызывал отставание по сравнению с контролем; в) Mo вначале тормозит развитие личинок, но на заключительных этапах оказывает стимулирующее воздействие. В результате переход к метаморфозу происходил значительно раньше, чем в контроле. Была изучена хроническая пищевая экспозиция полибромированного дифенилового эфира на выживаемость, рост и развитие головастиков Rana pepiens [Coyle, Karasov, 2010].

1.2 Влияние нефти на икру и головастиков земноводных

Работ по влиянию нефти и нефтепродуктов на развитие головастиков земноводных значительно меньше. Есть статья о воздействии нефти и бензина на личиночное развитие земноводных [Пескова, Жукова, Белоконь, 1998]. В эксперименте исследовали влияние нефти концентраций от 0,005 до 0,05 мл/л, а также бензина АИ 76 концентраций от 0,02 до 1,0 мл/л. Пребывание головастиков озерной лягушки Rana ridibumda в растворах нефти значительно дозозависимо сдвигает вперед начало гибели их по сравнению с контролем, а также день наступления 50%-ной гибели. Общее количество головастиков, завершивших метаморфоз, практически одинаково во всех растворах нефти и в контроле. Однако в опыте наблюдали сильное ингибирование процесса метаморфоза. Бензин в концентрациях 0,5 и 1,0 мл/л вызывает гибель всех головастиков через 0,51 час после внесения. В меньших концентрациях 0,02 и 0,05 мл/л в среднем завершают метаморфоз 80% животных, как и в контроле. Общая продолжительность метаморфоза одинакова в растворах бензина и контроле, но растут они в опыте медленнее, чем в контроле. У зеленой жабы Bufo viridis в растворе нефти единственной исследованной концентрации 0,025мл/л вылупление головастиков из икры происходит позднее? на 78-й день, в то время как в контроле на 5-й), а метаморфоз задерживается на 12 дней по сравнению с контролем. Таким образом, нефть и бензин в малых концентрациях, как правило, изменяют темп роста и развития головастиков бесхвостых амфибий, а в увеличенных вызывают их повышенную смертность.

Для выяснения влияния нефти на рост и выживаемость личинок остромордой лягушки Rana arvalis были поставлены опыты в трех вариантах, имитирующих загрязнение нефтью воды (1), озерного грунта (2) и песка (3) [Данилова, 1985]. Сырая нефть добавлялась из расчета 16,5 мл/л воды, 10 и 50 мл на 0,5 кг грунта и песка. В 1-м варианте у всех животных наблюдали отставание по длине и массе тела, а на 23 сутки все они погибли. Во 2-м варианте гибель животных наступила на 19 10-е сутки (в зависимости от концентрации нефти). В 3-м варианте через 30 суток подопытные особи превосходили по размерам контрольных, метаморфоз у них начался позднее, чем у контрольных амфибий (36 и 28-е сутки соответственно), однако на стадии рассасывания хвоста все они погибли. Автор резюмирует полученные данные таким образом: попадание даже небольших количеств нефти в воду и грунт оказывает на выживаемость и рост личинок остромордой лягушки губительное воздействие.

В более поздней работе М. Н. Данилова пришла к выводу, что дозы нефти от 0,0005 мл/л и выше обладают ингибирующим действием на развитие лягушек остромордой Rana arvalis и шпорцевой Xenopus laevis, дозы, равные и превышающие 0,05 мл/л летальны. Для дальневосточной жерлянки Bombina orientalis пороговая ингибирующая концентрация больше, чем для указанных выше лягушек: в пределах 0,010,05 мл/л. Отрицательное действие нефтяных углеводородов проявляется в первую очередь в качественных характеристиках развития. Количественные показатели оказались менее эффективными.

В другом опыте было изучено влияние фенола на возникновение аномалий у озёрной лягушки. В данной работе использовали материал, полученный при содержании икры головастиков озёрной лягушки в лабораторных условиях. Контролем служила икра и головастики, которые развивались в чистой отстоянной воде. Заложены следующие варианты опыта: растворы фенола концентрации 0,001; 0,01; 0,1 и 1,0 мг/л. По полученным данным, устойчивость к действию фенола (в плане возникновения аномалий) больше у головастиков по сравнению с эмбрионами озёрной лягушки [Жукова, Шипкова, 2006]. Бисфенол, А нарушает у (Y) Xenopus laevis на стадии нейрулы сигнальный каскад Notch путём ингибирования г? секретазы, расщепляющей внутриклеточный домен Notch, что приводит к дисплазии глаз и к последующей депигментации головастиков. Выяснено, что Y нарушает у Xenopus laevis дифференцировку нервной системы, ингибируя активность гамма? секретазы [Bisphenol A distrupts…, 2009].

1.3 Влияние пестицидов на икру и головастиков земноводных

Также в некоторых работах представлены результаты изучения влияния пестицидов различной природы (хлорорганических, фосфорорганических, пиретроидных) на головастиков бесхвостых земноводных. Так, изучали влияние гексахлорциклогексана (ГХЦГ) на выживаемость икры и головастиков озёрной лягушки. ГХЦГ относится к группе хлорорганических пестицидов (ХОП) и используется в качестве протравителя семян в сельском хозяйстве. Группы ХОП представляют собой стойкие, длительно не разрушающиеся в естественных условиях и сохраняющие токсичность пестициды, обладающие свойством кумуляции в организме. В лабораторных условиях исследовали влияние различных концентраций ГХЦГ на выживаемость икры и головастиков распространённого вида бесхвостых земноводных — озёрной лягушки. Концентрация ГХЦГ 0,01 мл/л принята за контроль, т.к. соответствует естественному фону в центральной части Краснодарского края. Варианты опыта — 0,05; 0,1; 0,5; 1,0 мл/л. На основании проведённого эксперимента можно говорить о высокой токсичности концентраций ГХЦГ 1,0 и 0,5 мл/л для икры и головастиков озёрной лягушки — растворы этих концентраций вызывают 100% гибель икры и личинок. К действию растворов более низких концентраций ГХЦГ икра более устойчива, чем головастики [Жукова, Малахов, 1995].

В другой работе Жуковой Т. И. были поставлены опыты по выявлению влияния на личиночное развитие малоазиатской лягушки двух минеральных удобрений: нитрата аммония (азотное удобрение) и аммофоса (фосфорное удобрение). Для опыта были взяты следующие концентрации: нитрата аммония — 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 мг/л; аммофоса — 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мг/л. Сравнение двух исследованных удобрений на выживаемость земноводных показывает, что более сильное влияние оказывает фосфорное удобрение. Так, в растворе концентрации 0,5 мг/л гибнут 76,7% (нитрат аммония) и 96,7% (аммофос) головастиков; в растворе концентрации 1,0 мг/л гибнут 83,3% и 100% головастиков соответственно. Все 100% головастиков, взятых в опыт, погибают при концентрациях 3,0 мг/л нитрата аммония и 1,0 мг/л аммофоса, т. е. втрое меньшей. При этом практически в растворах всех концентраций аммофоса 50%-ная гибель головастиков наблюдается на 37-й день наблюдений, т. е. позднее, чем в растворах нитрата аммония, но затем кривая количества живых животных очень быстро и резко падает вниз. Следовательно, кратковременные повышения концентрации аммофоса сказываются на выживаемости головастиков малоазиатской лягушки в меньшей степени, чем повышение концентрации нитрата аммония.

Песковой Т.Ю. было изучено влияние гербицида лондакса на эмбриональное и личиночное развитие гладкой шпорцевой лягушки. В опытах использовали концентрации лондакса — 0,25 и 0,50 мг/л. Содержание икры, а затем появившихся из неё головастиков в растворах с концентрацией лондакса 0,25 и 0,50 мг/л при плотности 1особь/л не привело к удлинению сроков развития. При плотности 2 особи/л удлиняется период личиночного развития шпорцевой лягушки при нахождении её в растворе лондакса 0,25 мг/л — до 65 дней по сравнению с 60 дней в контроле. В тоже время более высокая концентрация гербицида при такой же плотности посадки не только не отодвигает срок окончания метаморфоза, но даже несколько укорачивает его — до 58 дней. Т.о., продолжительность метаморфоза шпорцевой лягушки (55?65 дней) зависит не столько от внесения гербицида лондакса, сколько от плотности личинок. В растворах лондакса сдвигается время вылупления личинок из икры: это происходит на четвёртый день, в то время как в контроле головастики вылупляются на 2? ой и 3? й день. Общий процент завершивших метаморфоз животных достоверно снижается в растворах лондакса по сравнению с контролем в 2?8 раз (плотность 1 особь/л) и в 3,5?14 раз (плотность 2 особи/л). Токсичность лондакса для головастиков шпорцевой лягушки возрастает при увеличении концентрации гербицида, а также при увеличении плотности животных. Лондакс в исследованных концентрациях не влияет на линейные размеры закончивших метаморфоз животных, но оказывает тератогенное воздействие — вызывает аномалии развития позвоночника и задних конечностей у 40% животных.

Тем же автором [Пескова, 2003б] было изучено влияние и других пестицидов на смертность головастиков. Так, в лабораторных условиях проведены 2 серии опытов по влиянию дозы загрязнителя на головастиков озёрной лягушки. В первой серии использовали пиретроидные пестициды — децис и каратэ, концентрации 0,0002?0,05 мл/л; пиретроидные пестициды в смеси с сульфатом меди концентрации 0,5 мг/л (вариант «фон»). Во второй серии использовали фосфорорганический пестицид фозалон, концентрации 0,001?1,0 мл/л и гербицид купрозан — смесевой препарат (содержит в качестве действующих веществ цинеб с добавлением 5% меди), концентрации 0,1?1,0 мл/л. Полученные данные показывают, что характер кривой гибели головастиков определяется не столько природой токсиканта, сколько его концентрацией и продолжительностью воздействия. В целом можно говорить о большой токсичности пестицидов для головастиков озёрной лягушки по сравнению с солями тяжёлых металлов. При этом, как показал эксперимент, для каждого токсиканта существует собственная пороговая концентрация, превышение которой вызывает изменение характера динамики гибели личинок того или иного вида амфибий. Например, для озёрной лягушки такими пороговыми концентрациями являются 0,0007 мл/л каратэ и 0,0013 мл/л дециса, 0,01 мл/л фозалона и 1,0 мл/л купрозана. Другой опыт поставлен с использованием следующих концентраций пестицидов: карбарил 0,50,0010,002 мг/л; феноксикарб 0,005 0,010,02 мг/л, то есть для каждого пестицида использовали концентрации, составляющие 1, 2 и 4 ПДК [Пескова, Якушева, 2010]. Головастики озерной лягушки находились в контроле и растворах инсектицидов до завершения метаморфоза или до гибели всех животных. Концентрации из исследованных обоих карбаминовых пестицидов, при которых завершают метаморфоз 25 и 24% головастиков озёрной лягушки, составляют 1 ПДК, но при этом сроки метаморфоза удлиняются на 5 (карбарил) и 12 (феноксикарб) дней. Экспозиция в более высоких концентрациях (2 и 4 ПДК) инсектицидов приводит к 100% смерти земноводных на 30-й57-й день, причем позднее в растворах карбарила по сравнению с растворами феноксикарба соответствующих концентраций.

Доказано, что пестицид карбарил оказывает асимметричное влияние на выживаемость двух видов головастиков Rana pipiens и Bufo americans при различной плотности [Distel, Boone, 2011]. А пестицид нувакрон влияет на углеводный обмен зелёной лягушки Euphlyctis hexadactylus [Renuka, Andres, 2009]. Широко используемый органофосфатный пестицид хлорпирит влияет на выживаемость, рост, развитие и активность личинок азиатской обыкновенной жабы [Chlorpyrifos — induced toxicity…, 2011].

Установлено, что дильдрин укорачивает метаморфоз амфибий, а лондакс, дикват, дихлобенил, наоборот, не влияют на продолжительность личиночного развития; гербициды не приводят к снижению длины и массы тела земноводных, а некоторые даже способствуют их возрастанию [Пескова, 2005].

Была изучена токсичность для амфибий химикалий, используемых в системе спортивного рыболовства, удобрений; косвенное отрицательное влияние инсектицидов, уничтожающих кормовую базу. Низкие уровни гербицида атразина изменяют соотношение полов и уменьшают успех метаморфоза у головастиков Rana pipiens [Low levels of the herbicide atrazinealter…, 2010]. Изучена и токсичность четырёх глифосад? содержащих гербицидов для головастиков Rhinella arenarum [Toxicity of four herbicide…, 2011]. Также изучена токсичность двух обычных зероновых пестицидов для развития угрожаемой лягушки Litoria ranifirmis [Developmental…, 2011].

Загрязнения приводят к деформации, нарушению гормональных реакций, низкой выживаемости икры [Bishop, Gendron, 1997], синтетических инсектицидов на биохимический состав головастиков Rana pepiens [Jayakumar, Kandlepan, 2009], инсектицида карботокса на гистологические и физиологические показатели Rana ridibunda [The influence of carbetox…, 2009], сельскохозяйственное влияние на яйца, рост, метаморфоз и половую дифференциацию у обыкновенной жабы [Orton, Routledge, 2011].

1.4 Влияние металлов в наноформе на живые организмы

В последние годы во всём мире сельскохозяйственной продукции, выращенной без применения пестицидов, отдаётся большое предпочтение. В практику сельского хозяйства внедряются многочисленные безъядные препараты, способные заменить пестициды. В МСХА им. Тимирязева с 1987 г. проводятся исследования по использованию для обработки семян и растений составов, содержащих нанопорошки металлов. Известно, что в ультрадисперсной форме металлы — наночастицы металлов размером 10?50 нм приобретают уникальные свойства, используемые в различных отраслях народного хозяйства, из которых для биологов наиболее интересными являются их бактерицидные свойства и возможность использования их в качестве микроэлементов. Наночастицы электронейтральны, что позволяет им равномерно распределяться в плёнкобразователе и тонким слоем обволакивать семена, обеспечивая их надёжную защиту от патогенов. Постепенно окисляясь в почве, они создают неблагоприятные условия для патогенных микроорганизмов, и используются растениями как микроэлементы в процессе роста.

В одной из работ описан опыт по изучению влияния обработки семян озимой пшеницы ультрадисперсным порошком меди на ростовые процессы и устойчивость семян и проростков к почвенным патогенам. Исследовали 8 образцов ультрадисперсного оксида меди, различающегося по размерам удельной поверхности S от 70,23 м2/г до 1,43 м2/г. и d — от 0,01 мкг/час — 0,479 мкг/час. Испытывали две концентрации каждого препарата 0,1 и 0,2 г/ на 1 кг семян. В результате установили, что более высокие концентрации всех препаратов снизили на 10% энергию прорастания семян, но не повлияли на их всхожесть. Все препараты проявили положительные защитные свойства от почвенных патогенов. Этим опытом было показано, что чем больше поверхность наночастиц и меньше их размеры, тем эффективнее композиция, которую используют при работе [Райкова, Паничкин, Райкова, 2008].

В другой работе исследовали влияние ультрадисперсных порошков железа, меди, кобальта при обработке семян растений лапчатки гусиной и горца птичьего на накопление каротина, аскорбиновой кислоты и углеводов. Так, обработка семян лапчатки гусиной ультрадисперсными порошками металлов Fe и Cu в дозе 0,03 г на гектарную норму высева способствовала достоверному повышению всхожести, изменению первичных ростков и корешков. Под их действием у растений на экспериментальных участках были сформированы более высокие побеги с повышенным числом листьев и более крупными листовыми пластинками, чем на контрольном участке. На 7 дней раньше наступило цветение. Под действием нанопорошков металлов по отношению к контролю увеличилось содержание биологически активных веществ растений: аскорбиновой кислоты на 24?37%, каротина на 23?50%, углеводов на 23?50%. Обработка семян перед посадкой порошками нанометаллов не влияет на содержание данных элементов в почве. Химический анализ почвы на содержание железа, меди и кобальта после уборки урожая показал, что их уровень практически не изменялся независимо от видов и вводимых доз и был на уровне контроля [Чурилов, 2009].

Фитотоксические исследования свойств наночастиц цинка и его оксида на кукурузе (Zea mays L.), редисе (Raphanus sativus), рапсе (Brassica napus napus), огурце (Cucumis sativus) показали, что их концентрация 2000 мг/л отрицательно действует на прорастание семян кукурузы и подавляет удлинение корней. Была рассчитана пятидесяти процентная ингибиторная концентрация (IC50) для редьки, которая составила 50 мг/л, рапса — 20 мг/л Воздействие различных концентраций суспензий микрочастиц, наночастиц и ионов цинка на водные культуры дафний (Daphnia magna) и бактерий (Vibrio fischeri) выявило летальные концентрации (ЛК50) — 8,8, 3,2 и 6,1 мг/л для дафний и 1,8, 1,9 и 1,1 мг/л для бактерий, соответственно. Различия в токсичности наночастиц и микрочастиц цинка также были показаны на взрослых мышах. Причем микрочастицы цинка оказались токсичнее, чем наночастицы. В обоих случаях наблюдалось поражение почечной функции, также нано? цинк вызывал анемию и нарушение системы свертывания крови [Токсичность наноматериалов, 2010].

Проведенные исследования биологической активности наночастиц металлов на экспериментальных животных позволили установить, что нанокристаллическое железо и цинк в биотических дозах ускоряют рост животных и птиц, усиливают регенерацию печени после частичной гепатэктомии, ускоряют заживление тканей [Изучение безопасности введения наночастиц…, 2009].

Кроме влияния нанометаллов на сельскохозяйственные растения и животных, в некоторых работах рассматривается их воздействие на природные биоценозы и их компоненты.

Современные нанотехнологии обладают огромным потенциалом и, как утверждают эксперты, кардинально изменят общество ХХI века. Однако новые научные достижения не только способствуют развитию экономики, повышению качества жизни человека и т. д., но ставят ряд задач, которые относятся прежде всего к проблеме воздействия наноматериалов и наночастиц на качество среды обитания человека, на животный и растительный мир, на качество сельскохозяйственной продукции и воды и на здоровье человека. Это связано с особенностью наночастиц и наноматериалов, которые при попадании в организм могут быть непредсказуемыми и опасными. Наноматериалы, как правило, легче вступают в химические превращения, чем более крупные объекты того же состава, поэтому они способны образовывать комплексные соединения с неизвестными ранее свойствами. Наночастицы благодаря своим малым размерам легко проникают в организм человека и животных через защитные барьеры (эпителий, слизистые и т. д.), респираторную систему и желудочно? кишечный тракт. Общепринятые лекарственные средства, переведенные в нанопорошок (аспирин, кальция глюконат), обладают более высокой активностью, чем в обычной форме. Абсорбирующие свойства наночастиц значительно выше, чем у других молекул. Появление таких наноматериалов в окружающей среде может способствовать активному поглощению загрязнителей и их широкому распространению. Следовательно, с одной стороны, несомненна технологическая перспективность нанообъектов, с другой стороны, необходимо с особым вниманием относиться к связанным с ними рискам [Изучение безопасности введения наночастиц…, 2009]. Многие учёные считают, что наночастицы опасны из-за своей выраженной способности проникать через гематоэнцефалический и гематоплацентарный барьеры; их чрезвычайной стабильности. Наночастицы не подвергаются, также, биотрансформации и не выводятся из клетки, что вызывает в клетках стресс и приводит к их разрушению [Жолдакова, Синицына, 2008]. Наноматериалы приводят к повреждениям цитоскелета, они способны преодолевать кариолемму и располагаться в ядре клетки и коньюгировать с ДНК, индуцировать активные радикалы кислорода и азота, повреждающие ДНК [Сычёва, 2008].

В отчёте Научного комитета по новым рискам здоровья, изданном в октябре 2005 г. отмечается, что для адекватной оценки риска продуктов необходимо дополнительно получить ответы на следующие вопросы:

Характеристика механизмов и кинетики поступления наночастиц из широкого круга процессов производства и применение продуктов нанотехнологий; Реальные уровни воздействия наночастиц как на человека, так и на окружающую среду; Идентификация органов? мишеней и определение дозы для оценки токсичности; Судьба, распределение, стабильность и биоаккумуляция наночастиц в окружающей среде и живых организмах, включая микроорганизмы; Эффекты наночастиц в отношении различных живых организмов в каждом из объектов окружающей среды и являющихся представителями различных трофических уровней [Жолдакова, Синицына, 2008].

Таким образом, из проведенного анализа литературы видно, что достаточно хорошо изучены вопросы влияния солей тяжёлых металлов, таких как соли Cd, Cu, Pb, Zn и Fe на выживаемость головастиков. Также есть работы по изучению влияния других веществ, таких как, детергенты, некоторые пестициды, техногенные поллютанты.

Работ по влиянию нефти на показатели развития головастиков земноводных очень мало, также совместное влияние тяжёлых металлов в ионной и нано формах на показатели развития головастиков земноводных ранее не изучалось, с чем связан выбор темы данной диссертационной работы.

2. Материал и методы исследований

головастик земноводное лягушка токсикант В качестве объекта исследования были взяты головастики озёрной лягушки Pelophylax ridibundus, выловленные из относительно чистого искусственного водоёма (водоём глубиной 0,5 м, размеры 10×5 м) в Ботаническом саду ФГБОУ ВПО КубГУ.

Эксперимент проводился в течение ряда лет: с 1 июня по 30 июля 2009 г., с 15 мая по 2 августа 2010 г., с 1 июня по 30 июля 2011 г., с 1 мая по 30 июля 2012 г.

Плотность содержания головастиков — 10 особей на 1л воды или раствора. В опытах были взяты головастики 36?37 стадии развития [Дабагян, Слепцова, 1975]. Животных посадили в трёхлитровые ёмкости по 30 особей в каждую.

Контрольных животных содержали в отстоянной артезианской воде. В качестве токсикантов были использованы органические (нефть, пестициды, синтетические моющие средства) и неорганические (соли тяжёлых металлов) вещества. В качестве неорганических токсикантов были использованы соли металлов: Al2(SO4)3, Co (NO3)2, Ni (NO3)2, ZnSO4, Pb (NO3)2, FeSO4 (концентрация каждой соли составляла 1мг/л). ПДК по Al составляет 0,2 мг/л, Co 0,1 мг/л, Ni 0,02 мг/л, Zn 1,0 мг/л, Pb 0,01 мг/л, Fe 0,3 мг/л [Перечень…, 1995].

Из органических токсикантов было изучено влияние нефти марки Light (0,05, 0,10 и 0,20 мл/л), пестицидов фозалона (0,01, 0,1 и 1,0 мг/л), цинеба (0,1 и 1,0 мг/л) и лондакса (0,25 и 0,50 мг/л).

Нефть марки Light представляет собой смесь псевдофракций легких и средних компонентов компоненты первой и второй группы, [Кармазин, Буков, Пескова, 2010]. Они достаточно хорошо растворимы в воде, образуют «слик» и различного рода эмульсии. ПДК нефти в воде водоемов общего назначения составляет 0,5 мг/л [Перечень…, 1995].

Фозалон (бензофосфат) фосфорорганический инсектицид и акарицид. Формула C12H15ClNO4PS2. Растворим в воде, хорошо растворим в органических растворителях. ПДК в воде водоемов общего назначения составляет 0,5 мг/л [Пестицид фозалон].

Цинеб производное дитиокарбаминовой кислоты, фунгицид, использующийся для борьбы с болезнями плодовых культур и винограда. Формула C4H6N2S4Zn. Плохо растворим в воде. ПДК в воде водоемов общего назначения составляет 0,5 мг/л [Пестицид цинеб].

Лондакс (бенсульфуролметил) производное бензойной кислоты, гербицид, использующийся для борьбы с сорняками на рисовых полях. Формула C16H18N4O7S. Хорошо растворим в воде. ПДК в воде водоемов общего назначения составляет 0,4 мг/л [Пестицид лондакс].

Также были проведены серии опытов с солями металлов и с нефтью разных концентраций при добавлении оксида металла в наноформе NiO, CoO, FeO (концентраций 0,5 и 1 мл/л). Размеры наночастиц были следующие: оксид кобальта и оксид никеля 11нм, оксид железа 22,8нм. Удельная поверхность 100, 79, и 50 м2/г соответственно.

Головастики озёрной лягушки находились в контроле и растворах до завершения метаморфоза или до наступления гибели.