Зависимость нейротропных эффектов салицилатов кобальта и цинка от кальция

• Список условных сокращений
• Введение
• Раздел 1. Обзор литературы
• 1.1 Нервная система улиток рода Helix
• 1.1.1 Общая характеристика нейронов подглоточного комплекса ганглиев виноградной улитки
• 1.2 Салициловая кислота и её производные
• 1.2.1 Биологическое действие салицилатов
• 1.2.2 Эффекты салицилатов кобальта и цинка на нервную систему
• 1.3 Роль кальция в нервной системе
• Раздел 2. Методы исследований
• 2.1 Подготовка моллюска к эксперименту
• 2.2 Метод внутриклеточного отведения биопотенциалов
• 2.3 Приготовление растворов тестируемых веществ
• 2.4 Программа эксперимента и внеклеточная аппликация веществ
• 2.5 Регистрация данных и обработка результатов
• Раздел 3. Результаты исследований и их обсуждение
• 3.1 Особенности нейротропных эффектов салицилатов кобальта и цинка при блокировании входящего кальциевого тока хлоридом кадмия
• 3.2 Особености нейротропных эффектов салицилатов кобальта и цинка при блокировании входящего тока кальция и выделения этого иона из внутриклеточного депо хлоридом бария
• Выводы
• Список литературы

Список условных сокращений

Актуальность темы

Выяснение физиологических механизмов действия на нервную систему различных веществ, обладающих полезными фармакологическими свойствами, является актуальной задачей современной нейронауки.

Салицилаты кобальта и цинка, значительно превосходящие по противоспалительным свойствам салициловую кислоту [27, 28], обладают нейротропным действием [15, 16], механизм которого не раскрыт. Поскольку эффекты многих фармакологических веществ реализуются с участием сигнальных молекул [4], в частности кальция [2, 7, 19, 23], вполне возможно, что нейротропные эффекты салицилатов кобальта и цинка связаны с изменением внутриклеточной концетрации этого иона.

В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение зависимости нейротропных эффектов салицилатов кобальта и цинка от содержания кальция.

Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Ознакомиться с данными литературы по теме исследования.

2. Определить роль входящего кальциевого тока в нейротропных эффектах салицилатов.

3. Выяснить роль выделения кальция из внутриклеточных депо в нейротропных эффектах салицилатов

Объектом исследования служила нервная система улитки (Helix albescens Rossm.), которая обитает в Крыму. Систематическое положение объекта: царство Животные (Zoa), подцарство Многоклеточные (Metazoa), тип Моллюски (Mollusca), класс Брюхоногие моллюски (Gastropoda), подкласс Лёгочные моллюски (Pulmonata), отряд Стебельчатоглазые (Stylommatophora), семейство Хелициды (Helicidae), род Helix, вид H. albescens Rossm.

салицилат нервная система моллюск Карта нейронов подглоточного комплекса ганглиев H. albescens Rossm. практически идентична с таковой виноградной улитки (Helix pomatia L.). Выбор этого объекта обусловлен тем, что полученные на гигантских нейронах моллюсков данные хорошо сопоставимы с результатами исследований на нейронах млекопитающих, поскольку имеют сходные с ними механизмы электрогенеза и поэтому являются общепризнанной моделью в изучении влияния фармакологических препаратов на работу нейронов [4, 21, 22].

Раздел 1. Обзор литературы

1.1 Нервная система улиток рода Helix

Нервная система моллюсков рода Helix разбросанно-узлового типа; она состоит из окологлоточного нервного кольца, в котором наибольшее развитие получает надглоточный нервный узел («головной мозг»), представленный двумя церебральными ганглиями. От него отходят нервные стволы, соединяющие нервные ганглии разных отделов тела [21, 22]. Церебральные ганглии соединяются двумя парами коннективов с подглоточным комплексом, в состав которого входят семь ганглиев: дорзальную часть комплекса образуют ганглии висцеральной дуги (два плевральных, два париетальных и непарный абдоминальный), а вентральную — парные педальные ганглии. С окологлоточным кольцом тесно связаны лежащие у основания пищевода буккальные ганглии [12, 22].

1.1.1 Общая характеристика нейронов подглоточного комплекса ганглиев виноградной улитки

В подглоточном комплексе ганглиев улитки расположены нейроны, часть из которых идентифицированы и имеют свой номер, под которым эти клетки известны в литературе [11, 21, 22]. Каждая клетка обозначена сокращенным названием ганглия и порядковым номером, например, ППа1, ППа2, В1, В8 и т. д. (рис. 1.1 а). Также исследователями выделены группы мелких нейронов, которые обладают сходными свойствами, однако они не идентифицированы. Скопления однородных нейронов обозначаются заглавными буквами латинского алфавита: А, В, С и т. д. (рис. 1.1 б). Наиболее изучены нейроны правого париетального (ППаГ) и висцерального ганглиев (ВГ) виноградной улитки, характеристика которых приведена ниже.

Рис. 1.1 Карты дорзальной поверхности париетальных, плевральных и висцерального ганглиев.

Цифрами отмечены идентифицированные нейроны (а), латинскими буквами обозначен ы группы нейронов (б). ЛПл, ППл — левый и правый плевральный ганглии; ЛПа и ППа — левый и правый париетальные ганглии, ВГ — висцеральный ганглий.

Нейрон ППа1 самый крупный (300 мкм) в заднемедиальной доле ППаГ (рис. 1.1) и всегда примыкает к складке, отделяющей её от латеральной области ганглия. Эта клетка обычно более бледная и прозрачная, чем другие гигантские нейроны. Основная масса разветвлений её аксодендритного дерева находится в ВГ, а небольшая часть расположена в ППаГ [11, 22]. ППа1 — пептидергическая и кардиорегулирующая нейросекреторная клетка, синтезирующая нейрогормон, который выделяется в предсердие [12, 15, 23].

Нейрон ППа1 легко идентифицировать не только по локализации, но и по электрофизиологическим показателям: залповому (пачечному) типу активности, мембранному потенциалу (МП) в пределах — 45 — 60 мВ, потенциалу действия (ПД) с амплитудой до 100 мВ и выше, большим овершутом и задержкой на нисходящей фазе (рис. 1.2). Для данного нейрона характерен богатый синаптический приток, проявляющийся как в возбуждающих постсинаптических потенциалах (ВПСП), так и в тормозных постсинаптических потенциалах (ТПСП). Следует отметить, что нейрон ППа1 не всегда работает в пачечном режиме: в период зимней и летней спячки улиток медленные волны МП не наблюдаются, а возникают лишь при переходе моллюска к активному образу жизни или при добавлении во внеклеточный раствор Са-ионофора или серотонина. Пачечная его активность подвержена влияниям солнечных и лунных ритмов. Кроме того, нейрон ППа1 иногда может генерировать одиночные импульсы, либо совсем не проявлять импульсной активности, даже после прокола микроэлектродом его мембраны.

Нейрон ППа2 — гигантская, оранжевато-прозрачная клетка. Она локализована возле щели, разделяющей ППаГ и ВГ (рис 1.1 а). Аксодендритное дерево нейрона ППа2, как и ППа1, имеется только в паллиальных нервах. Нейрон ППа2 является командным нейроном и вызывает сокращение ипсилатеральной половины тела, мантийного валика и дыхальца улитки. Для данной клетки характерно спонтанное появление двухфазного возбуждающе-тормозящего постсинаптического потенциала (ПСП). В спонтанном синаптическом притоке есть одиночные и залповые ВПСП. Присутствуют и ТПСП, которые достаточно редко можно зарегистрировать в фоне. Следует отметить, что у ППа2 наблюдаются колебания МП, однако их выраженность значительно меньшая по сравнению с таковыми у нейрона ППа1. Уровень МП находится в пределах 35 — 45 мВ, ПД с аксонным и соматическим компонентами и в отличие от нейрона ППа1, без задержки на нисходящей фазе. Для нейрона ППа2 типичной является ритмическая активность в виде последовательности одиночных ПД с мономодальным распределением МИИ, однако она изменчива. Длительность межспайковых интервалов у нейрона ППа2 зависит от номера ПД по параболичекому закону, а амплитуда и частота осцилляций МП плавно изменяются при поляризации мембраны, что свидетельствует в пользу ритмоводящего характера электрической активности данного нейрона. Показано, однако, что иногда нейрон ППа2 спонтанно способен генерировать медленную пачечную активность.

Крупные серотонинэргические кардиостимулирующие клетки ППа7, В1, В5 (диаметр 100−120 мкм) расположены вблизи границы ВГ и ППаГ, обладают редкой фоновой импульсной активностью, активируются общими синаптическими входами и посылают отростки во все главные периферические нервы. Показано, что нейрон В5 по физиологическим характеристикам соответствует клетке ППа2, для него характерен МП около 35−45 мВ, ПД с аксонным и соматическим компонентами и без задержки на нисходящей фазе (амплитуда соматического потенциала близка к 70−80 мВ).

Нейрон ППа7 имеет относительно высокочастотную электрическую активность с быстрым развитием ПД (длительность не более 10 мс) благодаря интенсивному синаптическому притоку. Отличительной особенностью ППа7 от всех других крупных клеток ППаГ является малая величина кадмийчувствительного кальциевого тока (в 30−50 раз меньше, чем у других нейронов), определяющая малую продолжительность ПД. Установлено, что нейрон ППа7 является пейсмекерным, так как при искусственной стимуляции способен генерировать высокочастотные разряды (до 30 Гц), практически не проявляющие адаптации к поляризующему току.

При одновременной регистрации активности в нейронах ППа1 и ППа7 выявлена корреляция функционирования этих нейронов. Исходя из того, что пачечная активность в нейроне ППа1 возникает при действии на его рецепторы специфического соединения, секретируемого интернейроном, полагают, что это же соединение действует и на рецепторы нейрона ППа7, вызывая в нём деполяризацию.

Крупная белая клетка В3 (рис. 1.1 а) нерегулярно активна. ПД двухкомпонентные с большим овершутом и задержкой на нисходящей фазе, есть ВПСП и ТПСП.

Нейрон В4 крупная (рис. 1.1 а), хорошо пигментированная клетка с регулярной активностью, которая определяется богатым притоком ВПСП, создающим постоянный фон деполяризации. ТПСП нет. ПД двухкомпонентные, не большие (до 50−70 мВ), с небольшим овершутом.

Клетка В6 расположена ближе к левому париетальному ганглию, на краю выпуклой дольки в задней части висцерального ганглия (рис. 1.1 а). Для данного нейрона характерна меняющаяся активность и обилие синаптического притока, в котором выделяются крупные ВПСП и серии крупных ТПСП. Этой клетке присуща изменчивость амплитуды потенциалов действия.

Нейрон В7 имеет значительные размеры и беловатый цвет, характерный для пептидергических клеток. Его главный отросток направлен в интестинальный нерв. Нейрон В7, так же, как и нейрон ППа1, может демонстрировать пачечную или ритмическую активность, состоящую из одиночных ПД, либо его собственная активность отсутствует. Распространено мнение, что ритмоводящая активность нейрона B7 не является эндогенной и связана с постоянной активацией пептидэргических входов данной клетки нейропептидом, который обнаружен в гомогенате мозга Helix albescens и секретируется неидентифицированным интернейроном, расположенном вблизи нейрона ППа1 [12, 15].

Интернейрон В8 имеет высокий уровень ПП (-70 мВ), высокий порог генерации ПД и является пептидергическим. Одна из аксонных ветвей этого интернейрона моносинаптически контактирует с нейроном ППа1. При этом В8 обладает мономодальной ритмической активностью, которая тормозится при его активации.

Кроме идентифицированных нейронов, у улиток рода Helix известно семь групп неидентифицированных нейронов: A, B, C, D, E, F и G (рис. 1.1 б).

Группы нейронов А и В включают белые клетки, расположенные в области переднего конца ВГ так, что их часть (группа А) попадает в состав ВГ, а часть (группа В) — в состав левого париетального ганглия (Рис. 1.1 б). Клетки этих групп обычно имеют нерегулярную активность и при деполяризации ведут себя как мономодальные осцилляторы, имеют ВПСП и отдельные небольшие ТПСП. ПД с аксонным и соматическим компонентами, причём у группы В больший овершут и задержка на нисходящей фазе. Размеры клеток в разных препаратах изменчивы, но обычно небольшие (не более 50−60 мкм).

В состав группы С (рис. 1.1 б) входит небольшое число крупных белых клеток, расположенных вдоль медиальной границы левого париетального ганглия. Исследованы они не достаточно и соответствуют по своим характеристикам клеткам трупп, А и В.

Около 30 бледных, реже белых клеток группы D размером до 150 мкм образуют выпуклую долю в ППаГ и всегда лежат латеральнее области, занятой нейронами ППа1, ППа2 и ППа4 (рис. 1.1 б). Однако, размеры и позиция доли изменчивы, иногда она разделяется складкой на две доли. Клетки группы D обычно молчащие или имеют редкую активность, обладают выраженной способностью генерировать ПД в безнатриевой среде. ПД двухкомпонентные, длительностью не менее 30 сек. Соматический компонент имеет большой овершут и задержку на нисходящей фазе, иногда может отсутствовать. После залпа активности может развиться глубокая, до 70 мВ, гиперполяризация.

Некомпактное скопление относительно небольших, пигментированных клеток, лежащее в ППаГ позади коннектива, связывающего его с ВГ, образуют группу Е (рис. 1.1 б). Характерный их признак — быстрая аккомодация к деполяризующему току.

К группе F относят крупные, лежащие в заднелатеральной части ВГ пигментированные нейроны с довольно регулярной активностью, которая определяется богатым притоком ВПСП, создающим постоянный фон деполяризации (рис. 1.1 б). ТПСП нет. ПД двухкомпонентные (до 50−70 мВ) и с небольшим овершутом.

Для крупных или средних размеров клеток группы G часто характерна многокомпонентная спайковая активность. Генерация ПД происходит в нескольких аксонных ветвях, тогда как сома неактивна. Характерный признак — тормозное действие серотонина (у зимних улиток). Клетки этой группы расположены на дорзальной поверхности ВГ и смешаны с нейронами группы F (Рис. 1.1 б).

1.2 Салициловая кислота и её производные

Салициловая кислота (СаК) — ароматическая фенольная гидроксикислота, гидроксильная группа которой связана с бензольным кольцом [24]:

Это бесцветное кристаллическое вещество, легко растворимое в этаноле, диэтиловом эфире и плохо — в холодной воде (1,8 г/л при 20С). Температура плавления 159 С, а кипения — 211 С (20 мм. рт. ст.) [1, 24].

СаК имеет два центра кислотности — карбоксильную и фенольную гидроксильную группу и по химическим свойствам проявляет себя как одноатомный фенол и одноосновная кислота (pK=2,98).

При взаимодействии СаК с сильными основаниями образуются соли как по карбоксильной группе, так и при участии более слабого кислотного центра — фенольной гидроксильной группы (рис. 1.2 А). СаК вытесняет слабые кислоты из их солей, например угольную (рис 1.2 Б).

Рис. 1.2 Взаимодействие салициловой кислоты с гидроксидом натрия (А) и с карбонатом натрия (Б).

При взаимодействии карбоксильной группы СаК со спиртами образуются сложные эфиры (рис. 1.3 А) [1, 24]. Эта кислота также способна образовывать простые и сложные эфиры за счёт фенольной гидроксильной группы, при её ацетилировании уксусным ангидридом образуется ацетилсалициловая кислота (рис. 1.3 Б).

Рис. 1.3 Реакции карбоксильной (А) и фенольной гидроксильной (Б) групп салициловой кислоты.

В природе СаК встречается в виде гликозида её метилового эфира в эфирных маслах растений.

Основной промышленный способ синтеза СаК и её производных (рис. 1.4) — карбоксилирование сухого фенолята натрия действием СО₂ при давлении 0,6 МПа, температуре 185С в течение 8−10 часов (реакция Кольбе-Шмитта).

Рис. 1.4 Реакция Кольбе-Шмитта.

СаК и её производные — салицилат натрия, салициламид, ацетилсалициловая кислота (АК), ацетилсалицилат лизина, салол — являются важными лекарственными веществами [1, 7, 19, 23]. СаК — антисептик, раздражающее и кератолитическое средство [7, 19]. Она входит в состав мазей, паст, присыпок и растворов для лечения кожных заболеваний и грибковых заболеваний ногтей. СаК применяют также в качестве консерванта некоторых пищевых продуктов, полупродукта в синтезе красителей и фунгицидов. Салицилат натрия, салициламид, ацетилсалициловая кислота, ацетилсалицилат лизина известны как жаропонижающие, противовоспалительные и болеутоляющие средства; фениловый эфир (фенилсалицилат, салол) — антисептик; метисалицилат — противоревматическое средство; п-аминосалициловая кислота — противотуберкулёзное средство [1, 7, 19].

1.2.1 Биологическое действие салицилатов

Салицилаты — нестероидные противовоспалительные препараты, оказывающие антипиретическое (жаропонижающее), анальгезирующее, и противовоспалительное действие [1, 7, 24], а аспирин обладает ещё и антиагрегантным (уменьшает агрегацию тромбоцитов) и антиподагрическим действием.

Основным механизмом действия салицилатов в качестве фармакологических препаратов является необратимая инактивация ацетилированием обоих изоформ ЦОГ — ключевого фермента в синтезе из арахидоновой кислоты простагландинов, простациклинов и тромбоксана [7, 19, 23].

Предполагают, что противоспалительное действие АК и других салицилатов не исчерпывается только влиянием на систему простагландинов. Так, ацетилированная ЦОГ-2 может образовывать 15-R-гидроксиэйкозатетраеновую кислоту, превращающуюся при помощи 5 липооксигеназы в 15-эпилипоксин А₄, который обладает мощным противовоспалительным действием и усиливает эффект салицилатов. Кроме того, салицилаты снижают активность гиалуронидазы и ограничивает энергетическое обеспечение воспалительного процесса путём торможения образования АТФ [7, 19, 23].

Известно, что салицилаты в больших дозах тормозят сокращение поперечнополосатой мускулатуры, а АК ингибирует спазмогенное действие простагландинов на гладкую мускулатуру.

Отрицательное действие салицилатов на организм связано с их ингибирующим влиянием на изоформу фермента ЦОГ — ЦОГ-2 [3, 7, 19, 29]. К таким побочным эффектам относят ульцерогенное действие (появление язв желудка и желудочных кровотечений) [7, 8, 19, 29, 36], лекарственное поражение печени (редкое осложнение в виде гепатита или печёночной недостаточности) [7, 19, 20], синдром Рейе [2, 7, 8].

Ульцерогенный эффект аспирина обусловлен торможением факторов свёртывания крови и угнетением синтеза простогландина Е₁, оказывающего цитопротекторное действие на слизистую оболочку желудка [19], а образующаяся при его распаде СаК угнетает кишечную микрофлору.

Синдром Рейе — острая энцефалопатия в сочетании с жировой дистрофией печени и других внутренних органов, возникающая после приёма АК или других салицилатов при вирусных инфекциях (грипп, ветряная оспа, гепатит А, СПИД), без лечения заканчивается летальным исходом. Этим заболеванием страдают дети в возрасте от 4 до 16 лет. Патогенез синдрома Рейе связывают с повреждением митохондрий, возникающим под влиянием салицилатов и вирусной инфекции.

Ввиду описанных выше побочных действий салицилатов, создание новых лекарственных форм и средств на основе СаК и аспирина, лишённых их негативного воздействия, является важным направлением современной фармакологии. Некоторые авторы указывают на то, что производные СаК с металлами переходной валентности могут обладать рядом выгодных фармакологических свойств. При этом они не вызывают побочных эффектов, которые характерны для СаК, а в ряде других работ отмечено, что противовоспалительное действие салицилатов кобальта, цинка и меди значительно выше аналогичного действия, оказываемого СаК [27, 30, 31].

1.2.2 Эффекты салицилатов кобальта и цинка на нервную систему

В некоторых работах [16, 17] показано, что аппликация салицилатов кобальта (СК) и цинка (СЦ) — оказывают существенное влияние на электрические потенциалы сомы нейронов ППа1 и ППа2 и неидентифицированных клеток ВГ виноградной улитки. Пороговая концентрация воздействия СК и СЦ, при которой проявляются изменения параметров электрической активности нейронов, составляет 10^-4 М. Растворы СК и СЦ в концентрации 10^-3 М, оказывают активационно-модулирующее влияние на ПД нейронов улитки, увеличивая их продолжительность и инициируя или усиливая группирование в пачки.10^-2 М растворы СК и СЦ увеличивают у всех исследованных нейронов длительность ПД, а у некоторых полностью обратимо подавляют импульсную активность. Авторы предполагают, что модулирующие эффекты этих связаны с внутриклеточной системой циклических нуклеотидов (цАМФ, цГМФ).

Этими же исследователями показано, что аппликации СК и СЦ приводят к возобновлению импульсной активности нейронов ППа1 при блокировании синаптической передачи ионами кадмия. Вышеупомянутые салицилаты инициируют генерацию ПД у фоновонеактивных изолированных нейронов ППа1, а также оказывают возбуждающее влияние на «молчащие» и неидентифицированные клетки ППаГ и ВГ [16, 17]. СК и СЦ оказывают активирующее влияние на клетку ППа1, подобно влиянию инициирующего фактора (ИФ), который продуцирует генерацию пачечной активности. При активации фосфодиэстеразы цАМФ имидазолом показано, что влияние СК и СЦ связано с их воздействием на систему циклических нуклеотидов.

СК и СЦ уменьшают продолжительность синаптической задержки при межнейронной передаче сигналов у виноградной улитки. Они ускоряют передачу сигналов между нейронами на деполяризационной волне и замедляют на гиперполяризационной. Эти изменения при колебаниях МП связывают в первом случае с накоплением цАМФ, а во втором — цГМФ.

Эти сведения согласуются с имеющимися данными о психотропных эффектах СК и СЦ на поведенческие реакции крыс.

1.3 Роль кальция в нервной системе

Кальциевая (Ca²⁺) передача сигналов объединяет мембранную возбудимость и биологическую функцию нейронов. Действуя на границе между электрическими и сигнальными процессами клетки, Ca²⁺ каналы играют ведущую роль во многих ключевых аспектах нейронной функции. Известно, что ионы Ca²⁺ регулируют ионную проницаемость клеточных мембран, запускают многочисленные внутриклеточные процессы и задействованы в проведении сигналов от структур плазматической мембраны к внутриклеточным ферментам (Са²⁺-мессенджерная система), контролируют клеточную возбудимость, синаптическую передачу [9, 18]. Нейроны используют многочисленные способы управления внутриклеточным содержанием Ca²⁺, чаще всего в пределах местных сигнальных путей. Повышение концентрации Са²⁺ в нейроплазме происходит в основном за счёт его проникновения из внеклеточной среды через каналы плазмалеммы и высвобождения из внутриклеточного депо [33, 34]. В Ca²⁺ сигнализацию вовлекается большое количество Ca²⁺ каналов: потенциал-зависимые Ca²⁺ каналы плазматической мембраны, NMDA-рецепторы, AMPA-рецепторы, TRP-каналы и депо-управляемые каналы. Входящий кальциевый ток передает сигналы от мембраны вглубь цитоплазмы, где Са²⁺ связывается с различными органическими молекулами, в том числе и со структурными элементами ионных каналов, обуславливая возбудимость клеточной мембраны. Высвобождение Ca²⁺ из внутриклеточных депо эндоплазматического ретикулума осуществляется рецепторами инозитол-1,4,5-трисфосфата и рианодиновыми рецепторами. Помпа SERCA в эндоплазматическом ретикулуме, Ca²⁺ помпа и Na⁺-Ca²⁺ обменник плазматической мембраны осуществляют контроль концентрации Ca²⁺ в цитозоле в узком диапазоне значений. В формировании цитозольных Са²⁺ сигналов важную роль играют и митохондрии [37, 40]. Из-за чрезвычайной чувствительности нейронов к изменению внутриклеточной концентрации Ca²⁺ даже относительно небольшие отклонения в Ca²⁺ сигнализации могут привести к разрушительным последствиям.

Значительную роль отводят ионам кальция и в генерации пейсмекерной активности нейронов моллюсков и млекопитающих. Считается [15], что во время генерации ПД поток Са²⁺ в цитоплазму клетки может активировать Са²⁺-активируемую калиевую проводимость или же угнетать Са²⁺-ингибируемую стационарную калиевую проводимость и, таким образом, вызывать фазу гиперполяризации. Кроме того, предполагается, что стационарный кальциевый ток через низкопороговые кальциевые Т-каналы создаёт постоянную электродвижущую силу, вызывая деполяризацию мембраны и ритмоводящую активность.

Поскольку у большинства нейронов моллюсков, присутствуют Са²⁺-каналы [4], они играют значительную роль в мембранотропных эффектах различных химических агентов [4, 18]. Не менее важную роль в механизмах управления рецепторной функцией нейронов на воздействие различных соединений приписывают и Са²⁺, высвобождающемуся из внутриклеточного депо [33, 34]. Возможно, что накопление ионов Са²⁺ в цитоплазме вносит существенный вклад и в нейротропные эффекты салицилатов, что предполагают и некоторые авторы [17], но пока подтверждающие это мнение сведения отсутствуют. Поэтому выяснение роли вне — и внутриклеточного кальция в механизмах воздействия салицилатов на нейроны представляет несомненный теоретический и прикладной интерес.

Раздел 2. Методы исследований

2.1 Подготовка моллюска к эксперименту

В весенне-летний период улиток собирали перед проведением эксперимента, а осенью заготавливали и хранили в сухом, хорошо проветриваемом помещении при температуре +10…+15 °С), в специальных плексигласовых коробках.

За 2−3 дня до проведения эксперимента отбирали необходимое количество улиток и помещали в эксикатор, на дно которого помещали корм и наливали тонкий слой воды. В качестве корма использовали морковь, содержащую большое количество каротиноидов. Такая пища окрашивала нейроны улитки в оранжево-коричневатый цвет для лучшей их видимости под микроскопом.

Непосредственно перед экспериментом выполняли препарирование нервной системы улиток. Процесс препарирования состоял из двух этапов: макро — и микропрепарирования.

Во время макропрепарирования осуществляли извлечение окологлоточного нервного кольца из тела улитки. Для этого сначала отделяли ногу улитки от раковины, фиксировали её на препаравальном столике из воска или парафина при помощи швейных игл. Острыми глазными хирургическими ножницами делали продольный разрез вдоль затылочной складки. Используя иглы, расширяли рану, перерезали ретракторную мышцу, и отодвигали внутренние органы. После этой процедуры становилось заметным окологлоточное нервное кольцо с отходящими от него нервами и коннективами. Его освобождали от глотки и пищевода, затем приподнимали препаровальной иглой поочередно все нервы и перерезали их с максимальной удалённостью от ганглиев. Изолированное окологлоточное нервное кольцо переносили в экспериментальную силгардовую камеру, располагая его так, чтобы дорзальная поверхность была вверху. Затем подглоточный комплекс ганглиев фиксировали за нервы вольфрамовыми крючочками к дну камеры. Её объём составлял 0,5 мл, скорость смены растворов — 20−25 мл/час. Через камеру постоянно пропускали проток раствора Рингера следующего ионного состава (в мМ/л): NaCl — 100, CaCl₂ — 10, KCl — 4, MgCl₂ — 4, трис-HCl — 10 (pH 7,5).

Затем приступали к микропрепарированию — снятию соединительнотканной оболочки с ганглиев. Наружные соединительнотканные оболочки ганглиев удалялись механическим путём, без применения обработки ферментом, поскольку фермент изменяет активность различных мембранных структур и функциональное состояние клетки. Под бинокулярным микроскопом МБС-1 (пучок света подавался оптоволоконным осветителем ОВС-1 сбоку, под углом 45) специальным микрокрючком захватывали соединительнотканные оболочки ганглия и срезали их глазными ножницами для вскрытия сенехии, после чего отчётливо были видны тела нейронов округлой формы.

При проведении экспериментов соблюдался температурный режим +20…+22С°.

2.2 Метод внутриклеточного отведения биопотенциалов

После осуществления подготовки к эксперименту производили прокол мембраны выбранного нейрона электродом, о введении которого судили по изображению луча на программной панели монитора компьютера.

Исследование активности нейронов производилось с помощью жидкостных микроэлектродов, заполненных 2,5 М раствором KCl, сопротивлением не менее 10 МОм. Микроэлектроды изготавливали из стеклянных трубочек (стекло марки «Пирекс») с внутренним капилляром на полуавтомате для вытягивания микроэлектродов МЭ-4. Диаметр трубочек составлял 1,4−1,5 мм.

В нейрон вводили один микроэлектрод, который был связан с входным предусилителем, соединенным с усилителем нейронной активности УФУ-БКН. За электрической активностью нейронов наблюдали с монитора компьютера. В качестве индифферентного электрода использовали электрод от стимулятора ЭСЛ-2 с диодным мостиком 1 Ом — 1 кОм. Через индифферентный электрод подавался калибровочный сигнал с амплитудой 75 мВ и длительностью 100 мс. Микроэлектроды были связаны с электрической частью установки через солевой мостик и Ag-AgCl электрод.

2.3 Приготовление растворов тестируемых веществ

Тестируемыми веществами служили АТФ и соли салициловой кислоты — СК и СЦ.

СК и СЦ — были синтезированы на кафедре неорганической химии Таврического национального университета им. В. И. Вернадского. Как свидетельствовали данные элементного анализа, химическая чистота этих соединений составляла не менее 95%. В качестве источника АТФ использовался 1-% раствор аденозинтрифосфата натрия («Здоровье народа», Украина).

Индивидуальные растворы СК и СЦ, а также их комбинации с хлоридом кадмия или хлоридом бария, разводили раствором Рингера для холоднокровных того же состава, что и раствор подаваемый в экспериментальную камеру. Разведение осуществляли таким образом, чтобы концентрация каждого тестируемого вещества в растворе составляла 0,5*10^-3 М. Выбор этой концентрации обусловлен тем, что она принадлежит к диапазону наиболее выраженного нейротропного действия СК и СЦ [16, 17].

2.4 Программа эксперимента и внеклеточная аппликация веществ

Эксперименты проводились по следующей программе:

1) Поиск фоновоактивного нейрона.

После анатомирования производили прокол мембраны выбранного нейрона, о попадании электрода в клетку судили по показаниям луча на экране монитора.

2) Проверка временной устойчивости нейрона, его работоспособности.

Исследование начинали в том случае, если электрофизиологические характеристики нейрона оставались стабильными на протяжении 10 — 15 мин. Соблюдение данного условия необходимо для более четкого определения принадлежности клетки к определенному идентифицированному нейрону.

3) Регистрация и запись фоновой активности нейрона в течение 1 минуты.

4) Контрольный эксперимент: регистрация и запись нейронной активности при аппликации индивидуальных 0,5*10^-3 М растворов солей салициловой кислоты (СК или СЦ) — 4 мин.

5) Непосредственно эксперимент: регистрация и запись биопотенциалов нейрона при экспозиции комбинированных растворов СК+АТФ или СЦ+АТФ — 4 мин.

Количество однократно выводимых из пипеток растворов тестируемых веществ составляло 1 мл, что обеспечивало полную замену раствора Рингера в экспериментальной камере на тестируемый раствор заданной концентрации.

2.5 Регистрация данных и обработка результатов

Сигнал с выхода усилителя тока поступал на каскад усиления с измененным коэффициентом передачи (1−100), а далее — на однокаскадный активный фильтр низких частот с программируемой частотой среза (0.5; 1; 2 и 3 кГц). С выхода фильтра сигнал поступал на аналогово-цифровой преобразователь (АЦП), который через интерфейс прямого доступа был подключен к памяти персональной ЭВМ. Интерфейс прямого доступа к памяти управлялся с терминала компьютера. Режим функционирования каналов регистрации токов, частота, амплитуда и другие параметры контролировались компьютером.

Программное обеспечение «Action Potential», необходимое для регистрации и записи электрической активности нейронов на персональном компьютере, разработано в нашей лаборатории при помощи Sybase Watcom C++ v11.0 для операционной системы Windows (95, 98 2000 или ХР) [А. с.].

Распределение экспериментальных данных сравнивались с нормальным по критерию Колмогорова-Смирнова. Поскольку весь массив полученных данных характеризовался ненормальным распределением, ри определении достоверности полученных результатов экспериментальных проводилось сравнение данных «до аппликации» — «после аппликации» с помощью W — критерия Вилкоксона.

Раздел 3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1 Особенности нейротропных эффектов салицилатов кобальта и цинка при блокировании входящего кальциевого тока хлоридом кадмия

Для выяснения роли трансмембранного входящего кальциевого тока в нейротропных эффектах СК и СЦ в серии экспериментов использовали его блокатор — хлорид кадмия. Исследования выполнены на 41 неидентифицированном нейроне правого париетального и висцерального ганглиев.

В концентрации 0,510^-4 М обнаружено пороговое действие изолированных растворов СК и СЦ на параметры электрической активности исследованных нейронов (слева рис. 3.1; 3.2, А и В), а в концентрации 0,510^-4 М проявлялась оптимальная выраженность их нейротроного действия. При сопоставлении эффектов экспозиции двух концентраций (0,510^-4 и 0,510^-3 М) изолированных и сочетанных с CdCl₂ растворов СК, СЦ достоверных изменений измеряемых показателей потенциалов нейронов улитки не выявлено.

Рис. 3.1 Эффекты изолированной (1) и сочетанной с CdCl₂ (2) экспозиции салицилата кобальта в концентрации 0,510^-3 М

Обсуждая нейротропные эффекты салицилатов и роль Ca²⁺ в их развитии, следует учитывать и особенности количественного соотношения разных типов ионных каналов входящего тока, которое существенно варьирует в плазматической мембране различных нервных клеток.

Так, есть сведения [4], что в нервной системе моллюсков 10−15% нейронов содержат в плазматической мембране только Ca²⁺-каналы входящего тока, другие 10−15% - только Na⁺-, а у остальных 70−80% присутствуют оба типа каналов. Однако, несмотря на различия в представленности Ca²⁺-каналов в нейронах моллюсков, ранее был обнаружен однонаправленный характер воздействия салицилатов как на нейроны, электрическая активность которых в значительной степени зависит от входящего кальциевого тока (клетки ППа1 и ППа2), так и тех, где такой ток отсутствует (клетка ППа7). Исходя из сказанного здесь, можно считать, что входящий кальциевый ток вряд ли играет существенную роль в нейротропных эффектах салицилатов.

Однако, мы не исключаем, что вышеуказанный ток может вносить определённый вклад в качестве дополнительного механизма влияния салицилатов на клеточную возбудимость нейронов, содержащих потенциалзависимые Ca²⁺-каналы.

Рис. 3.1 Влияние изолированной и сочетанной с CdCl₂ аппликации салицилатов кобальта (А, Б) и цинка (В, Г)

Примечание: концентрации растворов: А, В — 0,510^-4 М; Б, Г — 0,510^-3 М. Горизонтальная жирная линия на каждой диаграмме — значения фоновых показателей, принятые за 100%.1 и 1' - частота генерации импульсов, 2 и 2' - амплитуда потенциалов действия, 3 и 3' - скорость суммарных входящих ионных токов, 4 и 4' - скорость суммарных выходящих ионных токов, 5 и 5 ' - мембранный потенциал; штрихом отмечены показатели электрической активности нейронов после воздействия сочетанного раствора тестируемого вещества с СdCl₂. n — количество нейронов в эксперименте; * - p < 0,05

Поскольку блокада хлоридом кадмия входящего кальциевого тока не приводит к ослаблению или исчезновению нейротропных эффектов салицилатов, можно думать, что она компенсируется за счет выделения Ca²⁺ в цитоплазму нейронов из внутриклеточного депо, на что указывают некоторые авторы [33, 34]. В то же время известно [37], что высвобождение Ca²⁺ из внутриклеточных структур повышает возбудимость нейронов, что возможно и проявляется при действии СК, СЦ. Накопление Ca²⁺ в цитоплазме может усиливаться ещё и тем, что ионы Сd²⁺ способны ингибировать Ca²⁺-АТФ-азу плазматических мембран (PMCA) — ионный насос, способствующий выведению Са²⁺ из клетки.

3.2 Особености нейротропных эффектов салицилатов кобальта и цинка при блокировании входящего тока кальция и выделения этого иона из внутриклеточного депо хлоридом бария

Чтобы выяснить, участвуют ли ионы Са²⁺ внутриклеточного депо в механизме нейротропных эффектов салицилатов, в отдельной серии экспериментов апплицировали хлорид бария, который блокирует как входящий ток Са²⁺, так и выходящий Са²⁺-зависимый калиевый ток, а также выделение Са²⁺ из внутриклеточного депо [9, 37]. Следует напомнить, что ионы Ва²⁺ не влияют на работу Са²-АТФ-азы плазматических мембран и это способствует дополнительному уменьшению уровня Са²⁺ в нейронах при воздействии BaCl₂.

Исследования выполнены на 45 неидентифицированных нейронах висцерального иправого париетального ганглиев улитки.

В концентрации 0,510^-4 М обнаружено пороговое действие изолированных растворов СК и СЦ на параметры электрической активности исследованных нейронов (слева рис. 3.3, А и В), а в концентрации 0,510^-4 М проявлялась оптимальная выраженность их нейротроного действия.0,510^-4 М растворы СК и СЦ (рис. 3.3, А и В; рис. 3.4) достоверно не изменяли исходные показатели электрической активности нейронов. Экспозиция сочетанного раствора СК+BaCl₂ увеличивала по сравнению с контролем (p < 0,05) только ЧГИ (рис. 3.2, А, 1 и 1'). Изменение данного показателя логично связывать с выключением хлоридом бария Са²⁺-зависимого калиевого тока. На это указывает и выраженная тенденция к снижению (на 11,4%) по сравнению с контролем скорости суммарных выходящих токов (рис. 3.3, А, 4 и 4'). Эффекты 0,510^-4 М СЦ и его сочетанного раствора с BaCl₂ достоверно не отличались между собой (рис. 3.3, В, рис. 3.4.). Такая же картина наблюдалась и при замене 0,510^-3 М растворов СК, СЦ на соответствующие сочетанные растворы с BaCl₂ (рис. 3.3, Б, Г).

В целом из анализа изменений хлоридом бария нейротропных эффектов СК и СЦ следует, что они напрямую не зависят как от ионов Са²⁺, поступающих в нейроплазму из внеклеточной среды, так и от выделяющихся из внутриклеточного депо. Лишь при воздействии СК в концентрации 0,510^-4 М ионы Са²⁺ могут оказывать влияние на функциональное состояние нейронов улитки, увеличивая Са²⁺-зависимый калиевый ток.

Однако, не исключено, что уменьшение поступления ионов Са²⁺ в цитоплазму могло компенсироваться иными механизмами, на которые использованные нами блокаторы — CdCl₂ и BaCl₂ — не оказывают существенного влияния.

Во-первых, в отношении Са²⁺-каналов плазматической мембраны сомы нейронов моллюсков известно, что среди них преобладают каналы N и L типа, однако встречаются и T каналы [4, 38].

Поскольку Сd²⁺ и Bа²⁺ эффективно блокируют потенциалзависимые L и N каналы входящего кальциевого тока, не оказывая при этом существенного влияния на Т каналы [37], не исключено, что недостаток Са²⁺ после блокады его входящего тока ионами Сd²⁺ и Bа²⁺ может частично компенсироваться за счёт его поступления через Т-каналы. Однако последние встречаются в мембране моллюсков редко.

Рис. 3.3 Влияние изолированной и сочетанной с BaCl₂ экспозиции салицилатов кобальта (А, Б) и цинка (В, Г)

Примечание: концентрации растворов: А, В — 0,510^-4 М; Б, Г — 0,510^-3 М. Горизонтальная жирная линия на каждой диаграмме — значения фоновых показателей, принятые за 100%.1 и 1' - частота генерации импульсов, 2 и 2' - амплитуда потенциалов действия, 3 и 3' - скорость суммарных входящих ионных токов, 4 и 4' - скорость суммарных выходящих ионных токов, 5 и 5 ' - мембранный потенциал; штрихом отмечены показатели электрической активности нейронов после воздействия сочетанного раствора тестируемого вещества с BаCl₂. n — количество нейронов в эксперименте; * - p < 0,05, — достоверные изменения показателей контроля по сравнению с фоном; ¦ - p < 0,05, ¦¦ - достоверные изменения показателей эксперимента по сравнению с контролем

А

Б

Рис. 3.4 Эффекты изолированной (1) и сочетанной с BaCl₂ (2) экспозиции салицилатов кобальта (А) и цинка (Б) в концентрации 0,510^-3 М

Примечание: Стрелкой отмечен момент аппликации

Во-вторых, поступление Са²⁺ в нейроплазму может обеспечиваться благодаря функционированию Na⁺-Са²⁺-обменников. Известно, что направление переноса Са²⁺ этим ионным насосом зависит от концентрации Na⁺ по обе стороны мембраны. Так, в состоянии покоя, когда содержание Na⁺ в цитоплазме низкое, Na⁺-Са²⁺-обменники выводят Са²⁺ из нейроплазмы во внешнюю среду [38], а при поступлении ионов Na⁺ внутрь клетки, Na⁺-Са²⁺-обменники работают в режиме обратного цикла, т. е. способствуют выводу Na⁺ и накоплению Са²⁺ в клетке из внеклеточной среды и внутриклеточного депо. Это может происходить и в присутствии Ва²⁺, который, хотя и замещает Са²⁺ во внеклеточных сайтах Na⁺-Са²⁺-обменников, но обладает значительно меньшим сродством к ним, чем Са²⁺. Можно предположить, что во время деполяризации мембран нейронов и при ингибировании выделения Са²⁺ из внутриклеточного депо BaCl₂, некоторое количество Са²⁺ всё же поступает внутрь клетки. Эти соображения частично подкрепляются работой [40], в которых показано, что вызванный притоком ионов Na⁺ в цитоплазму обратный натрий-кальциевый обмен вызывает высвобождение Са²⁺ из внутриклеточных депо, увеличивая Са²⁺-сигнализацию.

В-третьих, механизм компенсации снижения содержания Са²⁺ в цитоплазме нейронов после воздействия CdCl₂ или ВаCl₂ возможен за счёт конкурентного связывания циклических нуклеотидов [10], на синтез которых влияют салицилаты, и CdCl₂ или ВаCl₂ с рецепторами SMOC Ca²⁺-каналов.

Не исключено, что рассмотренные выше три механизма, не подверженные блокаде ионами Cd²⁺ и Ba²⁺, могут принимать некоторое участие в нейротропных эффектах салицилатов.

Выводы

1. Выполнен обзор литературы по теме исследования, который показал важную роль кальция в внутриклеточных процессах в нейронах и то, что роль этого вторичного посредника в эффектах салицилатов изучена не достаточно.

2. Входящий ток Са²⁺ через каналы L и N типа и выделение этого иона из внутриклеточного депо напрямую не оказывают существенного влияния на нейротропные эффекты салицилатов кобальта и цинка. Однако, эффекты салицилата кобальта (0,5*10^-3 М) испытавают опосредованное влияние поступающих в нейроплазму ионов Са²⁺, поскольку зависят от Са²⁺-зависимого калиевого тока.

3. Поступление Са²⁺ в цитоплазму нейронов и участие в изменении их функционального состояния под влиянием салицилатов может обеспечиваться и другими механизмами, например, работой Na⁺-Са²⁺-обменников в режиме обратного цикла и Са²⁺-каналов входящего тока Т типа.

1. Арзамасцев А. П. Фармацевтическая химия. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. — 640 с.

2. Венгеровский А. И., Батурина Н. О., Саратиков А. С. Синдром Рейе — тяжёлое осложнение терапии салицилатами // Экспер. и клин. фармакол. — 2000. — Т.63, № 2. — С.76−80.

3. Верткин А. Л., Наумов А. В., Шамуилова М. М. и др. Дилемма выбора нестероидных противовоспалительных препаратов в терапевтической практике // Клиницист. — 2008. — Т.8, № 2. — С.46−50.

4. Вислобоков А. И., Игнатов Ю. Д. Современные представления о воздействии фармакологических средств на ионные каналы // Психофармакол. биол. наркол. — 2007. — Т.7, № 3−4. — С.2121−2130.

5. Гланц С. Медико-биологическая статистика / Гланц С. — М.: Практика, 1998. — 459 с.

6. Григорьева А. С. Оптимизация фармакотерапевтической активности биометаллов при комплексообразовании с НПВП. — Микроэлементы в медицине. — 2000. — Т.2, № 1 — С.17−22.

7. Дейл М. М., Формен Дж.К. Руководство по иммунофармакологии. — М.: Медицина, 1998. — 332 с.

8. Дзяк Г. В., Викторов А. П., Гришина Е. И. Нестероидные противовоспалительные препараты. — К.: МОРИОН, 1999. — 112 с.

9. Зефиров А. Л., Ситдикова Г. Ф. Ионные каналы нервного окончания // Успехи физиол. наук. — 2002. — Т.33, № 4 — С.3−33.

10. В. П. Зинченко, Л. П. Долгачёва Внутриклеточная сигнализация — Пущино: Аналитическая микроскопия, 2003. — 84 с.

11. Иерусалимский В. Н., Захарова Е. С., Палихомова Т. А., Балабан П. М. Нервная система и картирование нейронов брюхоного моллюска Helix lucorum // Журн. высш. нерв. деят. — 1992. — Т.42, № 6. — С.1077−1086.

12. Коваль Л. М., Кононенко Н. И. Новые идентифицированные клетки виноградной улитки, связанные с генерацией ритмоводящей активности // Журн. высш. нерв. деят. — 1992. — Т.42, № 6. — С.1124−1131.

13. Кононенко Н. И. Изменчивость электрической активности нейрона ППа1 виноградной улитки // Нейрофизиология / Neurophysiology — 1981. — Т.13, № 4. — С.398−405.

14. Кононенко Н. И. Изменчивость электрической активности нейрона ППа2 виноградной улитки // Нейрофизиология / Neurophysiology — 1981. — Т.13, № 4. — С.406−412.

15. Кононенко Н. И., Костюченко О. В. Механизмы генерации ритмоводящей активности в идентифицированных нейронах виноградной улитки // Нейрофизиология / Neurophysiology — 2001. — Т.33, № 1. — С.46 — 54.

16. Коренюк И. И., Хусаинов Д. Р., Шульгин В. Ф. Влияние салициловой кислоты и её солей на электрическую активность нейронов виноградной улитки // Нейрофизиология / Neurophysiology. — 2005. — Т.37, № 2. — С.142−150.

17. Коренюк И. И., Хусаинов Д. Р., Шульгин В. Ф. Салицилаты кобальта и цинка как функциональные аналоги инициирующего фактора в нервной системе моллюска // Нейрофизиология / Neurophysiology. — 2006. — Т.38, № 1. — С.11−18.

18. Костюк П. Г. Біофізика клітини як основа сучасної фармакотерапії // Журн. АМН України. — 2004. — Т.10, № 1. — С.220−225.

19. Машковский М. Д. Лекарства ХХ века. — М.: Изд-во Новая Волна, 1998. — 320 с.

20. Низовцева О. А. Поражение печени ассоциированное с НПВП // Трудный пациент. — 2008. — Т.6, № 12. — С.35−37.

21. Сафонова Т. А., Журавлёв В. Л, Ноздрачёв А. Д. Кардиореспираторная система моллюсков: структура, функции, механизмы регуляции. — СПб.: Изд-во С. — Петерб. ун-та, 2008. — 244 с.

22. Сахаров Д. А. Генеалогия нейронов. — М.: Наука, 1974. — 184 с.

23. Сигидин Я. А., Шварц Г. Я., Арзамасцев А. П., Либерман С. С. Лекарственная терапия воспалительного процесса: экспериментальная и клиническая фармакология противовоспалительных препаратов. — М.: Медицина, 1988. — 240 с.

24. Тюкавкина Н. А., Бауков Ю. И. Биоорганическая химия. — М.: Медицина, 1991. — 528 с.

25. Хусаинов Д. Р., Катюшина О. В., Черетаев И. В. и др. Влияние салициловой кислоты и её солей на время синаптической передачи // Х Міжнародні Новорічні біологічні читання. — 2010. — Т.10. — С.325−329.

26. Шилейко А. А. Фауна СССР. Моллюски. — Т.3. — Л.: Наука, 1978. — 384 с.

27. Яковчук Т. В., Катюшина О. В., Хусаинов Д. Р. и др. Противовоспалительная активность солей салициловой и ацетилсалициловой кислот // Учёные записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского, серия «Биология, химия». — 2011. — Т.24, № 2. — С.332−338.

28. Яковчук Т. В., Катюшина О. В., Хусаинова К. Р. и др. Психотропная активность солей салициловой кислоты в условиях поведенческих тестов у крыс // Учёные записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского, серия «Биология, химия». — 2009. — Т.22, № 1. — С.25−31.

29. Lecomte M., Laneuville O. C., De Witt D. L. et al. Acetylation of human prostaglandin endoperoxide-syntase-2 (cyclooxygenase-2) by aspirin // J. Biol. Chem. — 1994. — Vоl.269, № 18. — P.13 207−13 215.

30. Sokolik J., Tumova I., Blahova M. et al. Anti-inflammatory activities of copper (II) and zinc (II) 3,5-diisopropylsalicylates // Acta Facult. Farm. Univ.comenianae. — 2004. — Vol.51, № 1. — P. 192−198.

31. Sokolik J., Tumova I., Blahova M. et al. Anti-inflammatory activities of copper (II) and zinc (II) 3,6-dimetylsalicylates and their equimolar mixture // Acta Facult. Farm. Univ.comenianae. — 2006. — Vol.53, № 1. — P.224−228.