Возбудитель туляремии. 
Схема лабораторной диагностики, иммунитет, средства специфической профилактики, лечение

Туляремия (лат. — Tularemia) — природно-очаговая, трансмиссивная инфекционная болезнь млекопитающих животных многих видов, птиц и человека, проявляющаяся септицемией, лихорадкой, поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и кишечника, увеличением и творожистым перерождением регионарных лимфатических узлов (лимфаденитами), появлением воспалительно-некротических фокусов в печени, селезенке и легких, исхуданием, маститами, абортами, поражением нервной системы и параличами.

Впервые заболевание было обнаружено в 1908 г. в графстве Туляре (Калифорния, США) у грызунов. Мак-Коу и Чепин (1911) первыми выделили культуру возбудителя болезни. Затем в том же штате США болезнь обнаружили у людей и овец (1921).Э. Френсис предложил назвать ее туляремией. Туляремия регистрируется в Северной Америке, Японии, страах Европы, Азии и Африки. Болезнь распространена преимущественно в ландшафтах умеренного климатического пояса Северного полушария. В нашей стране ее впервые зарегистрировали в 1921 г. Экономический, ущерб, причиняемый туляремией животноводству, в целом незначительный, так как у сельскохозяйственных животных клинически выраженная болезнь встречается редко. Однако больших затрат требует проведение противотуляремийных мероприятий.

Возбудитель болезни

В настоящее время род Francisella включает два вида — Francisella tularensis и Francisella philomiragia, а вид F. tularensis представлен четырьмя подвидами — F. tularensis subsp tularensis (тип A), F. tularensis subsp holarctica (тип В), F. tularensis subsp mediaasiatica и F. tularensis subsp novicida.

Тип, А вызывает более тяжелые формы болезни у человека и патогенен для кроликов. Встречается только в Северной Америке. Рассматривается как вероятное бактериологическое оружие. Для решения проблемы национальной биологической безопасности издан Указ Президента Российской Федерации № 2194 от 4 12 2003 г. Возбудитель включен в «Перечень возбудителей (патогенов) человека, животных и растений, генетически измененных микроорганизмов, токсинов, подлежащих экспортному контролю в целях защиты национальных интересов и обеспечения выполнения международных обязательств Российской Федерации, вытекающих из Конвенции о запрещении разработки, производства и пополнения запасов бактериального (биологического) и токсинного оружия и об их уничтожении» (Указ Президента РФ № 1004 от 8 08 2001)

Тип В встречается в Северной Америке, Европе и Азии. Он вызывает более легкие заболевания человека, не ферментирует глицерин и цитруллин и не патогенен для кроликов (при инфицировании возбудителем типа, А кролики погибают при введении даже 1 микробной клетки, типа В — 1 млрд клеток). Возбудитель устойчив во внешней среде. В воде сохраняется до 3 мес., в зерне, соломе — до 6 мес., в органах павших животных — 2−3 мес., в шкурках — до 40 дней. Возбудители чувствительны к стрептомицину, левомицетину, тетрациклину. По отношению к эритромицину на территории нашей страны циркулирует два варианта — устойчивый и чувствительный.

Вирулентные разновидности содержат О-, Н-, V-антигены, а авирулентные — только О-антиген.

Возбудитель туляремии проявляет значительную устойчвость во внешней среде, особенно при низких температурах, но вместе с тем весьма чувствителен к различным физическим (солнечные, ультрафиолетовые лучи, ионизирующая радиация, высокая температура) и химическим воздействиям.

Этиология

Возбудитель — Francisella tularensis — представляет собой мелкие коккоподобные палочки (0,3−0,5 мкм), неподвижные, грамотрицательные. Микроб не образует спор, имеет небольшую капсулу. В культурах характерно образование бактериями слизи, легко обнаруживаемой при изготовлении мазков на стекле. Бактерии туляремии окрашиваются всеми красками, обычно применяемыми в лабораторной практике, но заметно бледнее, чем многие бактерии. Строгие аэробы. В серологических реакциях хорошо реагируют с бруцеллами. Плохо растут на питательных средах (необходимы специальные обогащенные среды).

Микробы культивируются на желтковых средах при добавлении цистина и других питательных веществ, особенно крови. Температурный оптимум 36−37°С. Изолированные колонии удобно получать при посеве на чашки со средой Емельяновой (гидролизат рыбной муки, желатина, дрожтжи, хлористый натрий, глюкоза, цистин, агар) или средой Френсиса — (мясо-пептонный агар с 1% -ным пептоном, 0,5% -ный хлористый натрий, цистин, глюкоза). После стерилизации эти среды добавляют к 5−10 мл кроличьей дефибринированной крови. Колонии на этих средах — беловатого цвета с голубоватым оттенком, круглые, с ровным краем, выпуклые, гладкие, блестящие при разреженном посеве они достигают (через несколько дней) 1−2 мм и более в диаметре.

Эпизоотология

К туляремии восприимчивы 125 видов позвоночных и 101 вид беспозвоночных животных. В естественных условиях туляремией болеют зайцы, дикие кролики, мыши, водяные крысы, ондатры, бобры, хомяки и бурундуки. Природные очаги могут быть активными в течение 50 лет и более. Из сельскохозяйственных животных к возбудителю туляремии наиболее чувствительны и могут заболевать с клинически выраженными признаками болезни ягнята и поросята в возрасте до 2.4 мес, крупный рогатый скот, лошади и ослы. Из домашних птиц наиболее восприимчивы куры (особенно цыплята). Индейки, утки и гуси проявляют высокую устойчивость к заражению. Собаки и кошки маловосприимчивы к возбудителю. Из лабораторных животных наиболее восприимчивы морские свинки и белые мыши.

Заражение сельскохозяйственных и диких животных, происходит в основном алиментарным, аэрогенным и трансмиссивным путями.

Возбудитель туляремии проникает через микротравмы кожи и через слизистые оболочки. В этих случаях возникают кожно-бубонная или глазо-бубонная формы туляремии (последняя форма может развиться при попадании на конъюнктиву инфицированной воды).

При употреблении загрязненной грызунами воды или продуктов возникают кишечная или ангинозно-бубонная формы туляремии.

Заражение может происходить аэрогенным путем (вдыхание инфицированной пыли), что чаще приводит к развитию легочной формы туляремии.

Вспышки туляремии наблюдают как в весенне-летний (пастбищный), так и в осенне-зимний (стойловый) период, что связано соответственно с повышенной активностью кровососущих насекомых и более интенсивной миграцией грызунов в животноводческие помещения, места хранения кормов в определенные сезоны года.

Течение и клиническое проявление

Подозрение на туляремию диких животных обычно вызывают участившиеся случаи падежа крыс и мышей. Заболевшие зайцы, дикие кролики и белки теряют естественную боязливость перед человеком, не спасаются бегством и позволяют легко поймать себя.

Инкубационный период при туляремии у сельскохозяйственных животных (овца, коза, свинья, лошадь) длится от 4 до 12 сут. В зависимости от вида, породы и возраста животных болезнь может протекать остро, подостро или хронически, проявляться в типичной или атипичной (стертой, латентной, бессимптомной, иннапарантной) форме.

У больных ягнят отмечают расслабленность и парез задних конечностей, диарею и бледность слизистых оболочек (анемия вследствие снижения концентрации гемоглобина до 40.30 г/л при норме 70.80 г/л), катаральный конъюнктивит и ринит, сопровождающийся серозно-слизистым выделением из носа. Нижнечелюстные и предлопаточные лимфатические узлы увеличены, плотные, болезненные. При прогрессировании заболевания кроме указанных симптомов наблюдаются резкое беспокойство и чрезвычайная возбужденность. В этот период у некоторых животных появляются параличи, затем наступает коматозное состояние и больные в течение ближайших часов погибают. Болезнь продолжается 8.15 дней. Заболеваемость ягнят составляет 10.50%, а летальность — 30%.

У взрослых свиней чаще протекает скрыто. У поросят 2.6-месячного возраста после инкубационного периода продолжительностью 1.7 дней болезнь проявляется повышением температуры тела до 42 °C, отказом от корма, угнетением, учащенным дыханием брюшного типа и кашлем. Наблюдается обильное потоотделение, вследствие чего кожа становится грязной и покрывается корками. Лимфатические узлы увеличены. Высокая температура тела удерживается 7.10 дней, и, если нет осложнений со стороны органов дыхания, начинается медленное выздоровление. В противном случае у больных животных отмечают прогрессирующее исхудание. Большинство из них погибают.

У крупного рогатого скота болезнь в большинстве случаев протекает без видимых клинических признаков (бессимптомно) и выявляется только серологическими методами исследования. В отдельных случаях у больных коров отмечают кратковременную лихорадку, увеличение лимфатических узлов и маститы. У беременных животных возможны аборты (через 50 дней после заражения). Общее состояние и аппетит остаются без изменений. Описаны случаи проявления болезни в форме параличей конечностей со смертельным исходом.

При туляремийной инфекции у лошадей наблюдаются легкие и бессимптомные формы болезни, выявляемые аллергическими и серологическими исследованиями. В условиях естественного заражения туляремия у кобыл обычно проявляется массовыми абортами на 4.5-м месяце жеребости без каких-либо последующих осложнений. Температура тела остается нормальной. У ослов температура тела повышается на 1.2°С и сохраняется на таком уровне в течение 2 нед. Наблюдаются анорексия и истощение.

Патогенез

Для развития болезни при внедрении в кожу или аспирационным путем достаточно 10−50 жизнеспособных микроорганизмов, а при алиментарном инфицировании нужно свыше 108 микробных клеток.

На месте внедрения развивается воспалительный процесс, происходит массивное размножение микробов, затем они проникают в регионарные лимфатические узлы, вызывая воспаление. Микробы размножаются, частично гибнут, выделяя эндотоксин, который поступает в кровь и вызывает явления общей интоксикации. При попадании микробов в кровь происходит гематогенная диссеминация в различные органы и ткани. Возникает множественное увеличение лимфатических узлов, могут развиваться гранулемы в разных органах (печень, селезенка, легкие). Гранулематозный процесс особенно выражен в регионарных лимфатических узлах, здесь образуются участки некроза. Большое количество гранулем обнаруживается в селезенке, печени. По клеточному составу туляремийные гранулемы напоминают туберкулезные. Перенесенное заболевание оставляет после себя стойкий иммунитет.

По данным научных исследования Романовой Людмилы Васильевны установлено, что в последние годы при эпизоотологическом обследовании природных очагов туляремии отмечается снижение количества культур возбудителя, изолированных от млекопитающих, членистоногих и из различных объектов окружающей среды (Мещерякова И С, 1998) Однако, следует отметить, что относительно благополучная эпизоотологическая обстановка не дает представления об истинной ситуации в паразитарной системе. Проводимые при этом исследования не всегда учитывают в полном объеме условия циркуляции микроба и сохранения его во внешней среде. Не учитывается возможность пребывания туляремийного микроба в окружающей среде в виде некультивируемых форм. Существование подобных покоящихся форм, получивших название «некультивируемых» у ряда патогенных бактерий, имеет прямое отношение к закономерностям резервации возбудителей в природе и их адаптации к неблагоприятным условиям среды. Обладая сниженным метаболизмом, такие формы обеспечивают выживаемость популяции в неблагоприятных (стрессовых) экологических условиях в покоящемся состоянии в результате сохранения способности реверсировать в вегетативные вирулентные формы при изменении условий существования (Литвин В Ю и др, 1998, Colwell Ret al, 1986, Colwell R, Huq К, 1994). Используемые в лабораторной практике методы определения жизнеспособности бактериальных клеток (бактериологические) непригодны для выявления некультивируемых форм (НФ) бактерий в окружающей среде. Между тем проблема НФ возбудителя туляремии представляет не только теоретический интерес, но имеет огромное практическое значение, поскольку эти формы, по-видимому, способны поддерживать существование возбудителя в окружающей среде в межэпизоотические (межэпидемические) периоды.

Впервые описан феномен перехода возбудителя туляремии в некультивируемое состояние под влиянием условий внешней среды Показано, что ревертанты некультивируемых форм туляремийного микроба восстанавливают свои основные свойства, в том числе и вирулентность. Существование таких покоящихся форм имеет прямое отношение к резервации возбудителя и его адаптации к неблагоприятным условиям среды. Определено, что возбудитель туляремии наделен важной для персистенции адаптивной пластичностью, проявляющейся в его адекватной реакции на стрессовые факторы окружающей среды. Предложен комплекс молекулярно-биологических приемов для обнаружения и идентификации возбудителя туляремии Сконструирован и апробирован ДНК-зонд для идентификации, сконструированы специфические праймеры для индикации возбудителя туляремии. Подобраны универсальные (случайные) праймеры для изучения генома (ПЦР-типирование, геномотипи-рования, генотипирование) туляремийного микроба в системе однопраймерной ПЦР. Впервые определено место ПЦР в практике эпизоотологического и эпидемиологического надзора за туляремией в природных очагах. Метод ПЦР при условии низкотемпературного хранения проб полевого материала повышает эффективность эпизоотологического мониторинга территорий, так как обеспечивает возможность ускоренного предварительного отбора положительных проб для последующего целенаправленного бактериологического анализа, а также дает возможность обнаружения туляремийных микробов, находящихся в некультивируемом состоянии, в котором они персистируют в окружающей среде в межэпизоотический период.

Патологоанатомические признаки

Трупы павших животных истощены. Кожа в подмышечной области изъязвлена и некротизирована. Под кожей и в подкожной клетчатке различных частей тела обнаруживают уплотненные участки с кровоизлияниями и очагами некроза. Нижнечелюстные, заглоточные, предлопаточные и подмышечные (а при затяжном течении и внутренние) лимфатические узлы увеличены и гнойно воспалены. Слизистая оболочка носа отечна и гиперемирована. Глотка гиперемирована; у корня языка и в миндалинах казеозно-гнойные пробки. У ягнят и поросят, кроме того, находят фибринозный плеврит и очаговую серозно-фибринозную пневмонию, застойную гиперемию и некротические очаги в печени. Селезенка набухшая, ее пульпа на разрезе имеет темно-красный цвет и серозно-желтые узелки. На эпикарде и надпочечниках точечные кровоизлияния. В целом создается общая картина сепсиса.

Патологоанатомические признаки у грызунов сходны с изменениями, наблюдаемыми при псевдотуберкулезе.

Диагностика и дифференциальная диагностика

Подозрение на туляремию возникает при наличии этой болезни у грызунов (массовый падеж), заболеваниях сельскохозяйственных и домашних животных, а также человека.

Применяется экспресс-диагностика, основанная на агглютинации, только для анализа берется не сыворотка, а капля цельной крови больного и смешивается так же с туляремийным диагностикумом. При положительной реакции эритроциты слипаются (это происходит, если содержание антител в крови больного достаточно велико). Для более точной диагностики используют РПГА (реакция прямой гемагглютинации) и ИФА (иммуно-ферментный анализ).

Серологические методы — реакция агглютинации, РПГА (реакция прямой гемагглютинации), ИФА (иммуноферментный анализ). Диагностическим является нарастание количества антител в ходе болезни, реакция агглютинации становится положительной с 10−12 дня болезни. Сыворотки берут в начале болезни и на 2−3-й неделе. Диагностическим является нарастание количества антител против туляремийной палочки в 4 раза и более. Для постановки реакции используют туляремийный диагностикум, содержащий 10 млрд. бактерий туляремии убитых формалином в 1 мл раствора. При наличии в сыворотке больного соответствующих антител можно увидеть образование хлопьев при смешении сыворотки и диагностикума. Это — положительная реакция, основанная на фундаментальном взаимодействии антигенов и антител. Метод довольно быстрый, но прикидочный.

Аллергический метод (кожная аллергическая проба). Этот метод основан на особенности больного или переболевшего туляремией отвечать местной аллергической реакцией на введение тулярина (взвесь убитых нагреванием туляремийных палочек). Этот анализ позволяет поставить диагноз «туляремия» в самые ранние сроки, поскольку внутрикожная аллергическая проба становится положительной уже с 3−5 дня болезни. Тулярин вводят внутрикожно в дозе 0,1 мл, учитывают через 24 и 48 ч. Положительная реакция проявляется появлением гиперемии и инфильтрации кожи диаметром 0,5 см и более.

Для бактериологического исследования в ветеринарную лабораторию направляют трупы грызунов и мелких животных целиком, а от трупов крупных животных — печень, почки, селезенку, сердце, пораженные лимфатические узлы. В ветеринарной лаборатории проводят бактериоскопию, делают высевы из патматериала с последующей идентификацией выделенных культур по культурально-морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам.

возбудитель туляремия патогенез болезнь При биопробе выделенной культурой, суспензией из кусочков органов и лимфатических узлов заражают морских свинок или белых мышей и в случае необходимости исследуют материал в реакции преципитации. У экспериментально зараженных при биопробе морских свинок (гибель которых отмечают через 2.3 сут) патогномоничными изменениями считают воспаление и образование язв в месте введения биоматериала (или культуры возбудителя), нагноение регионарных лимфатических узлов, увеличение селезенки и печени, узелковые и очаговые поражения в легких. Белые мыши погибают на 3.4-й день после заражения. Диагностическими признаками у них являются глинистый цвет печени, увеличение селезенки с узелками серо-белого цвета.

По результатам лабораторных исследований диагноз считается установленным:

при выделении культуры F. tularensis из присланного патологического материала;

при положительной биопробе с характерными для туляремии изменениями в органах и последующим выделением из них чистой культуры.

При дифференциальной диагностике туляремию следует отличать от анаплазмоза, псевдотуберкулеза, туберкулеза, парату-беркулеза, бруцеллеза и кокцидиоза (эймериоза) путем проведения бактериологических, серологических и аллергических исследований.

Методы борьбы и профилактики

В системе профилактических мероприятий одно из первых мест занимают меры по обезвреживанию источника возбудителя инфекции, факторов передачи и переносчиков возбудителя. Снижению численности иксодовых клещей способствуют изменение сроков (позднее начало) весеннего выпаса скота, сокращение площади естественных лугов, выпас скота на искусственных и культурных пастбищах, плановые или экстренные обработки заклещеванного скота.

Снижение численности грызунов достигается прессованием сена и соломы в тюки; качественной обработкой стогов сена и ометов соломы аммиаком, перевозкой кормов сразу после уборки урожая в хорошо оборудованные хранилища, в которые не могут проникнуть грызуны. Не рекомендуется устанавливать стога сена и ометы соломы по краям оврагов или опушкам леса.

Больных животных к убою не допускают. В случае убоя все продукты подлежат уничтожению. Продукты, соприкасавшиеся с тушами, органами или кровью животных, больных туляремией, проваривают.

Проводят систематическое уничтожение мышевидных грызунов и эктопаразитов, дезинфекцию помещений, водоисточников, загрязненных возбудителем. Для дезинфекции используют 5.10% -ные растворы лизола, 3.5% -ный раствор фенола, 5% -ные растворы хлорамина Б или ХБ, формальдегида и др.

Проводят систематическое уничтожение мышевидных грызунов и эктопаразитов, дезинфекцию помещений, водоисточников, загрязненных возбудителем. Для дезинфекции используют 5.10% -ные растворы лизола, 3.5% -ный раствор фенола, 5% -ные растворы хлорамина Б или ХБ, формальдегида и др.

Вывоз животных из неблагополучных хозяйств разрешается после исследования сывороток крови в реакции агглютинации и обработки против пастбищных клещей.