Процесс представляет собой гидратацию 2-кето-L-гулоновой кислоты с последующим ее превращением в L-аскорбиновую кислоту (рисунок 19):Рисунок 19. Получение L-аскорбиновой кислоты из 2-кето-L-гулоновой кислоты. Вместе с тем, ведется активная работа по поиску биотехнологических путей решения этой проблемы. В современных исследованиях делается акцент на усовершенствование реакторови поиск новых ферментов, которые способны были бы заменить химическую стадию процесса. Так, былисообщения о выявлениииз дрожжей рода Кандида и Криптококк, штаммов, способных на подобное преобразование. Выход технической аскорбиновой кислоты из 2-кето-L-гулоновой кислоты составляет 86−90%.
2.7. Очистка технической до медицинской аскорбиновой кислоты.
В результате всех вышеприведённых реакций, мы получаем техническую аскорбиновую кислоту, которую необходимо превратить в медицинский, очищенный продукт. Для этого производится перекристаллизация технической формы и аскорбиновой кислоты из маточников. Для процесса из-за термолабильностиаскорбиновой кислоты необходимы следующие условия:
процессы растворения, упаривания, сушки проводят быстро, при температуре не выше 70 °C;растворы хранят на холоду;
для осветления применяют специально подготовленный уголь и ограничивают его количество;
полностью исключают контакт с железом. К этапам получения медицинской аскорбиновой кислоты можно отнести: Получение дистиллированной воды осуществляется путем перегонки умягченной поды или артезианской поды. Воду анализируют на содержание ионов железа, хлоридов, сульфатов и органических примесей. Величина рН воды должна быть в пределах 4,5 — 7,8.Восстановление активированного угля (регенерация).
проводится глюкозой в щелочной среде в присутствии кальцинированной соды при температуре 85 — 90 °C, отфильтровывают и промывают горячей дистиллированной водой до нейтральной реакции среды. Перекристаллизация технической аскорбиновой кислоты ведут при температуре 80 — 85 °C в присутствии активированного угля от трилона Б. Фильтрацию от угля проводят при температуре 65 — 75 °C. Продукт кристаллизуют в течение 4 — 6 ч при перемешивании и температуре 0 — 2 °C и отфильтровывают. Фильтрация осуществляется на фильтре путем промывания дистиллированной водой, охлажденной до 0 — 2 °C. Затем следует промывка охлажденным этанолом и суша в вакуумной сушке при температуре горячей воды 80 — 85 °C. Выход медицинской аскорбиновой кислоты I-ой кристаллизации 66,7% от теоретически возможного. Получение аскорбиновой кислоты II-ой кристаллизацииосуществляется путем использования маточных растворов аскорбиновой кислоты, которые упаривают и кристаллизуют. Получение аскорбиновой кислоты III-ей и IV-ой кристаллизации осуществляется при переработке маточных растворов аскорбиновой кислоты II-ой и Ш-ей кристаллизации. Суммарный выход медицинской аскорбиновой кислоты с учетом перекристаллизации аскорбиновой кислоты 11, III, IV кристаллизации составляет 92,2% в пересчете на техническую ее форму. Все растворители, используемые в синтезе аскорбиновой кислоты, регенерируют. Продуктовый расчет стадии ферментации биотехнологической производства L-аскорбиновой кислоты, а именно синтеза 2-кето-L-гулоновой кислоты посредством культивации бактерий штамма Erwinia SHS-2011 в водной питательной среде.
Перед расчетом материального баланса предприятия по биохимическому производству аскорбиновой кислоты следует отметить, что аскорбиновая кислота и сорбит в РФ производится на одном предприятии ОАО «Марбиофарм» (г. Йошкар-Ола) в объемах, достаточных для внутреннего потребления. Но даже эти крохи трудно назвать производством, поскольку оно представляет собой получение медицинской аскорбиновой кислоты из технической, поставляемой из Китая. Производство фармацевтической аскорбиновой кислоты (витамин С) химическим и, тем более, биотехнологическим методами в РФ отсутствует. В настоящее время, учитывая санкционную войну и внутрироссийскую тенденцию на импортозамещение, открываются производства по глубокой переработке пшеницы. Среди таких Биотехнологический комплекс-Росва в Калуге. Здесь производят как сорбит, так и глюкозу, необходимую для производства аскорбиновой кислоты. В планах и открытие этого самого производства, но на данном этапе его пока не существует. Есть также предприятие ООО НПК «Карбоник», базирующееся в городе Новоалтайск, но пока производство аскорбиновой кислоты не запущено и там. Будущий завод рассчитан на производство 5 тысяч тонн аскорбиновой кислоты в год. Возьмем за исходные данные именно этот показатель, а также исследовательские данные иностранных компаний по биотехологическом упроизводству 2-кето-L-гулоновой кислоты с дальнейшей ее переработкой до L-аскорбиновой кислоты [20]. Производственная мощность предприятия — 5,0 тыс.
т аскорбиновой кислоты в год.
Время работы оборудования в году — 345 дней. Продуктивность культуры (содержание 2-кето-L-гулоновой кислоты в культуральной жидкости при использовании штамма erwina) — 19,8 кг/ м3 [20]. Объем ферментатора — 100 м³. Продолжительность ферментации — 20 ч. Оборот ферментатора — 42 ч. Коэффициент заполнения ферментатора — 0,7.Объем исходной питательной среды (ИПС) — 40 м³, в том числе посевного материала — 5 м³. Состав исходной питательной среды, кг/м3. Поскольку в исходной прописи состава среды компоненты заданы в % масс., то изначально седует подсчитать среднюю плотность среды. Она будет равна сумме производных от массовых долей составных частей на их плотность, кг/м³. Средняя плотность расчетной среды будет равна 0,01×1540 + 0,05×1260 + 0,001×2340 + 0,005×2660 + 0,025×2740 = 16,4+63+2,34+13,3+68,5+931,5 (вода 0,9315 с плотностью 1000 кг/м³) = 1094,04. Масса раствора для 40м³ будет равна 1094,04×40 = 43 761,6. Масса каждого компонента высчитывается путем умножения массы раствора на значение % масс. Выражается в кг. D-глюкоза — 43 761,6×0,01 = 437,62; Кукурузный экстракт — 43 761,6×0,05 = 2188,08; Дигидроортофосфат калия (KН2РО4) — 43 761,6×0,001 = 43,76; Сульфат магния (MgSO4) — 43 761,6×0,005 = 218,81; Карбонат кальция (СаCO3) — 43 761,6×0,025 = 1094,04;Вода — остальное. Повторим предыдущие действия, но в пересчете на объем в 30м³ подпитки. Масса и объем каждого компонента: D-глюкозу — 32 821,2×0,01 = 328 кг;Кукурузный экстракт — 32 821,2×0,05 = 1641,06 кг; Дигидроортофосфат калия (KН2РО4) — 32 821,2×0,001 кг/м³ = 32,82 кг;Сульфат магния (MgSO4) — 32 821,2×0,005 = 164,11 кг; Карбонат кальция (СаCO3) — 32 821,2×0,025 = 820,53 кг;Вода — остальное [20]. Испарение и каплеунос при ферментации — 8% от КЖ. Объем производства L-аскорбиновой кислоты составляет 5000 т в год, или 5000/345 = 14,49 т/сут.Так как из 2-кето-L-гулоновой кислоты можно получить от 86% L-аскорбиновой кислоты, то объем производства 2-кето-L-гулоновой кислоты должен составлять 16,52 т/сут (114% от объема производства L-аскорбиновой кислоты).Количество культурной жидкости, получаемой с одной операции по биосинтезу 2-кето-L-гулоновой кислоты, с учетом испарения жидкости и каплеуноса в процессе ферментации составит:
64,4 м3(общий объем коультурной жидкости и подпитки за минусом потерь).Количество 2-кето-L-гулоновой кислоты в КЖ с одной операции: 64,4×19,8 = 1275,12 кг, где 19,8 — содержание 2-кето-L-гулоновой кислоты в культурной жидкости, кг/м3.Требуемое число операций за цикл (число сливов культурной жидкости): (14,49×1000): 1275,12 = 11 Расчет потребности производства в компонентах питательных сред производят на одну операцию по биосинтезу 2-кето-L-гулоновой кислоты (на одну загрузку ферментатора) исходя из прописи среды. Для приготовления исходной питательной среды объемом 40 м³ требуется: D-глюкозу — 437,62 / 1540 кг/м³ = 0,28 м³, где 1540 — плотность глюкозыв кг/м³; Кукурузный экстракт — 2188,08 / 1260 кг/м³ = 1,74 м³; Дигидроортофосфат калия (KН2РО4) — 43,76/2340 кг/м³ = 0,02 м³; Сульфат магния (MgSO4) — 218,81/2660 кг/м³ = 0,08 м³; Карбонат кальция (СаCO3) — 1094,04/2740 кг/м³ = 0,4 м³;Вода — остальное. Общий объем всех компонентов с учетом посевного материала составит: 0,28+1,74+0,02+0,08+0,4+5 = 7,52Количество воды для приготовления среды: 40 — 7,52 = 32,48 м3Повторим предыдущие действия, но в пересчете на объем в 30м³ подпитки. Масса и объем каждого компонента: D-глюкозу — 328,21 кг/1540 кг/м³ = 0,21 м³;Кукурузный экстракт — 1641,06 кг/1260 кг/м³= 1,3 м³; Дигидроортофосфат калия (KН2РО4) — 32,82 кг/2340 = 0,01 м³; Сульфат магния (MgSO4) — 164,11 кг/2660 кг/м³ = 0,6 м³; Карбонат кальция (СаCO3) — 820,53 кг/ 2740 кг/м³ = 0,3 м³.Вода — остальное [20]. Общий объем всех компонентов для подпитки = 0,21+1,3+0,01+0,6+0,3 = 2,42 м³. Количество воды составит: 30−2,42 = 27,58 м3Полученные данные сведем в таблицу 1. Суточный расход компонентов определяют исходя из потребности в них на одну операцию и числа операций (сливов культуральной жидкости) за сутки. Таблица 1Материальный баланс процесса ферментации.
НаименованиекомпонентовКоличествона одну операцию.
Количествоза сутки.
По массе, кг.
По объему, м3По массе, тПо объему, м312 345ПРИХОДИсходная питательная среда: D-глюкоза437,620,284,833,08Кукурузный экстракт 2188,081,7424,0719,14Дигидроортофосфат калия (KН2РО4) 43,760,020,480,22Сульфат магния (MgSO4) 218,810,082,410,88Карбонат кальция (СаCO3) 1094,040,412,034,4Вода 32 480 32,48 357,28357,28Подпитка:D-глюкоза328,210,2136,12,31Кукурузный экстракт 1641,061,318,0514,3Дигидроортофосфат калия (KН2РО4) 32,820,010,360,11Сульфат магния (MgSO4) 164,110,61,816,6Карбонат кальция (СаCO3) 820,530,39,033,3Вода 2 758 027,58303,38 303,38Итого:
67 029,0465769,83 715РАСХОДЖидкость на испарение и каплеунос5362,322,2161,5957,2Культуральная жидкость61 666,7225,37 708,14657,8Итого:
67 029,0465769,83 715.
Из приведенного в таблице материального баланса следует, что плотность ферментационной среды составит в среднем:
67 029,04: 70 = 957,56 кг/м3Выход технической аскорбиновой кислоты из 2-кето-L-гулоновой кислоты после прохождения химической стадии производства составляет 86−90%, т. е. 17,82 кг на каждый м³2-кето-L-гулоновой кислоты.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Процесс производства аскорбиновой кислоты по методу Рейхштейна постепенно сдает свои позиции, уступая место биотехнологическим методикам получения витамина, которые не требуют капитальных затрат, не загрязняют окружающую среду. На данный момент времени хорошо разработано 2 этапа в технологии ферментации D-глюкозы в L-аксорбиновую кислоту — это: синтез 2,5-дикето-D-глюконовой кислоты из D-глюкозы и синтез 2-кето-L-гулоновой кислоты из продукта первой стадии. Затраты по сравнению с методом Рейхштейна ниже примерно на треть, эффективность выше. Тенденция к переводу химического производства в микробиологическое по всемумиру очевидна. Так одна из крупнейших микробиологических компаний мира Roche Holding модернизирует Шотландский завод Далрис перспективой применения новой двухступенчатойбродильной установки. Совместное предприятие компанийCeresta, химический концерн BASF и фармацевтическая компания Merck KGaAуже применяет биотехнологическую цепочку производства 2-кето-L-гулоновой кислоты на своем заводе в Крефельде (Германия). Проявляют интерес к микробиологическим технологиями такие компании как UScompany, Арчер-Дэниелс-Мидленд, которые планируют начать производство витамина.
С самое ближайшее время с использование бродильного оборудования. Ведутся и новые разработки. Компании Истман и Genencor International ведут разработки в области производства 2-кето-L-гулоновой кислоты биотехнологическими методами. Все больше совершенствуются уже имеющиеся методики., что важно для уменьшения расходов ныне существующих производств и улучшения качества конечного продукта. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫПечатные издания.
Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии / Под ред. А. А. Воробьева, А. С. Быкова. — М.: Медицинское информационное агентство, 2003.
Еренгалиев А.Е., Какимов А. К., Жаксыбаев А. М. Биотехнологическое оборудование. Учебное пособие. — Семипалатинск, 2006.
Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с. Биохимия в схемах и таблицах: пособие для студ.
биол. факультетов./сост. Семак В. И., Губич О. И., Кукулянская Т. А. — Минск: БГУ, 2011. — 91 с. Биохимия для технологов: учебник и практикум для академического бакалавриата / А. Л. Новокшанова. — М.: Издательство Юрайт, 2015.
— 508 с. — Серия: Бакалавр Академический курс. Бирюков В. В. Основы промышленной биотехнологии. — М.:Колос, 2004.
— 296 с. Бортников, И.И., Машины и аппараты микробиологических производств: Учебное пособие для вузов./ И. И. Бортников., А. М Босенко. — Минск: Высш. Школа., 1982. — 288 с. Волова Т. Г. Биотехнология.
Новосибирск. — Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. — 252 с. Горбатюк, В. И. Процессы и аппараты пищевых производств. / В. И. Горбатюк — М.: Колос, 1999. -.
333 с. Гореликова Г. А. Основы современной пищевой биотехнологии. У чебное пособие. Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. — Кемерово, 2004.
— 100 с. Егорова, Т. А. Основы биотехнологии. / Т. А. Егорова [и др.] - М.: ACADEMA, 2003. -.
208 с. Касаткин А. Г. — Основные процессы и аппараты химической технологии Учебник для вузов — 10-е изд., стереотипное, доработанное. Перепечатано с изд.
1973 г. — М.: ООО ТИД «Альянс», 2004. — 753 с. Макаров С. В., Никифорова Т. Е., Козлов Н. А. Основы биотехнологии Учебное пособие, ГОУ ВПО Ивановский государственный химико-технологический университет. — Иваново, 2005. — 48 с. Морозкина Т. С. Витамины: Краткое руководство для враче и студентов мед.
фармацевтических и биологическихспециальностей/ Т. С. Морозкина, А. Г. Мойсеёнок. — Мн.:ООО «Асар», 2002. — 112 с.; ил. Перри Дж. Справочник инженера-химика в 2-х томах. Т.
2. — Л.:Издательство «Химия», 1969 — 504 с. Сартакова О. Ю. Основы микробиологии и биотехнологии В 2-х частях Учебное пособие в 2-х частях. — Барнаул, 2001 (ч.1), 2005 (ч.2).Федосеев К. Г. Процессы и аппараты биотехнологии в химико-фармацевтической промышленности. — М.: Медицина, 1969. ;
200 с. Шлейкин А. Г., Жилинская Н. Т.
Введение
в биотехнологию: Учеб. пособие. — СПб.: НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2013. — 95с. Электронные ресурсы.
Компания BIORUS®. Официальный сайт. — [Электронный ресурс]. — Режим доступа:
http://www.bio-rus.ru/stati (дата обращения: 31.
05.2016).Патент №RU1190992, Шионоги энд Копод авторством Масахиро Танимото, Бундзи Кагеями, Сигео Яги, Такаясу Сонояма. «Способ получения 2,5-дикето- @ -глюконовой кислоты». — [Электронный ресурс]. — Режим доступа:
http://www.findpatent.ru/patent/119/1 190 992.html (дата обращения 12.
06.2016).Стивен Андерсон, Дэвид Р. Свет, Cara Маркс, Уильям Х. Rastetterпромежуточные продукты аскорбиновая кислота и ферменты процесса US 5 008 193 ;
https://www.google.kz/patents/US5008193.Chotani, G. et al. (2000) The commercial production of chemicals using pathway engineering. Biochim. Biophys. Acta 1543, 434−455.
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S016748380000234X .Fowler, T. and Causey, S. (1998) Improved Enterobacteriaceaefermentation strains. W orld Intellectual Property Organisation (WIPO) Patent 98/59 054.Shinjoh, M. et al.
(1990) L-Sorbose dissimilation in2-keto-L-gulonic acid-producing mutant UV10derived from Gluconobacter oxydans IFO 3293.Agric. B iol. C.
hem. 54, 2257−2263.Anderson Stephen; Marks Cara Berman; Lazarus Robert; Miller Jeffrey; Stafford Kevin; Seymour Jana; Light David; Rastetter William; Estell David «Production of 2-Keto-L-Gulonate, an Intermediate in L-Ascorbate Synthesis, by a Genetically Modffied Erwinia herbicola"/ Science 1985;10−11. — [ Электронный ресурс]. — Режим доступа:
http://arch.neicon.ru/xmlui/handle/123 456 789/2616852(дата обращения 03.
06.2016).J.F. Grindley, M. A. P ayton, Conversion of Glucose to 2-Keto-L-Gulonate, an Intermediate in L-Ascorbate Synthesis, by a Recombinant Strain of Erwinia citreus/ Appl. E nviron. M icrobiol. July 1988 vol. 54 no.
7 1770−1775. — [ Электронный ресурс]. — Режим доступа:
http://aem.asm.org/content/54/7/1770.short (дата обращения 02.
06.2016).Qi Chen, Michael Graham Espey, Andrew Y. Sun, Chaya Pooput, Kenneth L. Kirk, Murali C. Krishna, Deena Beneda Khosh, Jeanne Drisko, Mark Levine «Pharmacologic doses of ascorbate act as a prooxidant and decrease growth of aggressive tumor xenografts in mice». — [Электронный ресурс]. — Режим доступа:
http://www.pnas.org/content/105/32/11 105.short (дата обращения: 01.
06.2016).Robert D Hancock, Roberto Viola Biotechnological approaches for L-ascorbic acid production/Trends in Biotechnology 20(7):299−305, August 2002. — [Электронный ресурс]. — Режим доступа:
http://tibtech.trends.com (дата обращения 02.
06.2016).ПРИЛОЖЕНИЕ АТехнологическая схема стерилизации непрерывной подачи питательной среды в ферментер [17]1 — аппарат для растворения и суспензирования компонентов; 2 — смеситель; 3 — насос; 4 — нагреватель; 5 — выдерживатель; 6 — испаритель; 7 — теплообменник; 8 — ферментер
ПРИЛОЖЕНИЕ БТехнологическая схема получения стерильного сжатого воздуха [17]1 — масляный фильтр; 2 — компрессор; 3 — теплообменник; 4 — ресивер; 5 — брызгоуловитель; 6 — общий фильтр; 7 — индивидуальный фильтр
ПРИЛОЖЕНИЕ ВТехнологическая схема ферментера для производства аскорбиновой кислоты со вспомогательными устройствами[12]1 — корпус ферментера, 2 — вал смесителя с турбинами, 3 — электродвигатель с коробкой передач, 4 — сальник вала смесителя, 5 — спираль теплообменника, 6 — перфорированный барботер, 7 — устройство для определения расходов воздуха, 8 — фильтр для стерилизации воздуха, 9 — воздушный клапан с регулировочным вентилем, 10 — уловитель, наполненный фенолом, 11 и 12 — резервуары для стерилизации пеногасителя и дополнительной подачи питательной среды во время ферментации, 13 — трубопровод для питательной среды, 14 — выводной вентиль, 15 — вентиль для отбора проб. ПРИЛОЖЕНИЕ ГТехнологическая схема фильтрации культурных жидкостей под давлением[12]Рамный фильтр-пресс: 1 — лобовина, 2 — рама, 3 — плита, 4 — брус, 5 — подвижная лобовина, 6 — гидравлическое устройство, 7 — прилив, 8 — кран.
ПРИЛОЖЕНИЕ ДСхему аппарата для выпаривания конечногопродукта из отфильтрованной культуральной жидкости c центральной циркуляционной трубой (а) и с выносной нагревательной камерой (б)[12]1 — корпус, 2 — нагревательные трубки, 3 — циркуляционная труба, 4 — сепаратор, 5 — отбойник.
