Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммуноферментный анализ, как видно из названия, состоит из двух разных компонентов — иммунохимической и ферментативной реакций. В процессе иммунохимической реакции происходит связывание антитела с обнаруживаемым антигеном, в то время как ферментная реакция (химическая реакция, при которой одно вещество под действием фермента превращается в другое) позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции. Вещество, на которое действует фермент, называется субстратом, а вещество, которое получается в результате воздействия фермента, называется продуктом ферментативной реакции. Наиболее широко используются антитела, химически связанные (конъюгированные) с молекулами ферментов пероксидазы хрена, бета-галактозидазы, щелочной фосфатазы. После образования комплекса антигена с мечеными ферментом антителами проводят разделение компонентов иммунохимической системы, затем добавляют субстрат. В ходе ферментативной реакции идет образование окрашенного продукта; интенсивность окрашивания прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител (см. метод PTA-ELISA).

Открытие возможности иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением их связывающей активности позволило создать самый популярный в наше время твердофазный ИФА (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) — вариант метода, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, например, в лунках планшета из полистирола. Такую схему проведения анализа, при которой на полистироле сорбируют антитела, называют сендвич-ИФА (Double Antibody Sandwich-VAASA, DAS-ELISA). Суть анализа заключается в следующем. Сначала на поверхности лунок полистиролового планшета сорбируют специфические антитела. Раствор антител оставляют в лунках на 15—30 мин, чтобы молекулы антител могли сорбционно связаться с поверхностью лунок. Далее несвязавшиеся антитела отмывают, после чего в эти лунки добавляют антигены (тестируемый образец). После инкубации, приводящей к образованию прочно связанных с полистиролом плашки комплексов «антиген — антитело», отмывают песвязавшийся материал и добавляют меченые ферментами антитела. Эти антитела также соединяются с тестируемыми антигенами. В результате образуется комплекс «антитело — антиген — меченое антитело». Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 мин до 4—5 ч), чтобы антитела смогли связаться со «своим» антигеном. После тщательной отмывки несвязавшихся меченых антител проводят ферментативную реакцию с субстратом. Чем больше в биологической пробе определяемых антигенов, тем больше антител свяжется с ними, поэтому интенсивность окраски пропорциональна содержанию в пробе тестируемого антигена (и его хозяина — вируса, бактерии, гриба). Интенсивность окраски может быть оценена визуально или с использованием специальной техники — колориметра, ELISA-ридера (рис. 5.2).

Рис. 5.2. Схема сендвич-ИФА.

Другой вариант твердофазного ИФА-анализа — PTA-ELISA (PlateTrapped Antigen ELISA) предполагает сорбирование на полистироле планшета не антител, а непосредственно исследуемых антигенов. В этом случае используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой — ферментом (рис. 5.3).

Рис. 5.3. Схема РТА-ELISA.

На первом этапе проведения анализа исследуемый материал помещается в лунки полистиролового планшета. Биологический материал оставляют в лунках на 15−30 мин, чтобы антигены могли сорбционно связаться с поверхностью лунок. Далее в эти лупки добавляют специфичные меченые ферментом антитела к выявляемому антигену. Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 мин до 4—5 ч), чтобы антитела могли найти «свой» антиген и связаться с ним. Чем больше в биологической пробе определяемых антигенов, тем больше антител свяжется с ними. После инкубации «лишние» антитела из лунок удаляют (выливают), лунки промывают. Остаются только те меченые антитела, которые связались с адсорбированными на поверхности лунок антигенами.

Далее начинается второй этап — ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с субстратом и оставляют на 30 60 мин. Фермент проводит реакцию, в результате которой субстрат превращается в окрашенное вещество (продукт ферментативной реакции). Затем визуально или методом колориметрии находят концентрацию этого окрашенного вещества. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию антигенов в тестируемом материале (рис. В.21).