Метод ультразвуковой цитолизометрии

Ультразвуковые методы нашли применение не только в клинической диагностике, но и в лабораторных исследованиях. В частности, в практике лабораторных исследований крови существует метод определения механической резистентности эритроцитов. Устойчивость этих клеток к механическим, разрушающим воздействиям обычно оценивают, встряхивая кровь с антикоагулянтом в течение определенного времени, а затем по окрашиванию плазмы измеряют количество вышедшего из травмированных эритроцитов гемоглобина, либо подсчитывая число эритроцитов в единице объема под микроскопом до и после встряхивания. Этот метод пригоден лишь для эритроцитов, так как внутренний объем этих клеток не разделен на отдельные компартаменты и их содержимое вытекает через любое повреждение клеточной мембраны. Кроме того, метод неточен и позволяет, как правило, лишь подтвердить установленный диагноз.

Некоторые клетки, суспендированные в водной среде и не имеющие прочной клеточной стенки, разрушаются под действием ультразвука уже при интенсивностях, используемых в терапии. К числу таких клеток относятся клетки крови и сперматозоиды. Пороги и скорость разрушения этих клеток зависят как от концентрации клеток в суспензии, температуры среды, частоты и интенсивности ультразвука, так и от прочности клеточных мембран, и, следовательно, от типа клеток и состояния организма — донора этих клеток.

Разрушение клеток в ультразвуковом поле происходит только в том случае, если интенсивность ультразвука превышает значения, совпадающие для разбавленных суспензий, с порогами кавитации в воде.

Зависимость средней скорости разрушения клеток от интенсивности ультразвука по характеру сходна с аналогичными зависимостями интенсивности ультразвукового свечения и скорости звукохимических реакций (см. §§ 1.8; 1.13). Совпадение в характере этих зависимостей, а также в порогах кавитации и разрушение клеток свидетельствует о кавитационной природе эффекта. Кроме того, скорость разрушения клеток обратно пропорциональна концентрации клеток в суспензии (рис. 2.10), что может служить подтверждением кавитационной природы разрушения, так как увеличение концентрации клеток равносильно увеличению вязкости, приводящему к возрастанию порога кавитации в жидких средах.

Рис. 2.10. Зависимость времени разрушения клеток в ультразвуковом поле от их концентрации (интенсивность ультразвука — 0,4 Вт/см²).

Отметим, однако, что ультразвуковое свечение и образование химически активных частиц характеризуют процессы, протекающие внутри кавитирующего пузырька, тогда как разрушение клеток происходит в результате процессов, протекающих вне его.

Замена растворенного в воде воздуха аргоном или присутствие в ней акцепторов свободных радикалов (цистеин, акриламид) не влияют на процесс ультразвукового разрушения клеток. Отсюда следует, что основную роль в процессах, ведущих к нарушению целостности клеточных мембран, играют не химические вещества, образующиеся под действием ультразвука, а механические силы, возникающие при кавитации. Такие силы, достаточные по величине для разрушения клеточных мембран, могут быть обусловлены микропотоками и ударными волнами вблизи пульсирующих или захлопывающихся пузырьков.

Акустические потоки в суспензии, возникающие в докавитационном режиме (0,05 Вт/см²), способны лишь «смывать» макромолекулы с поверхности клеточных мембран. Увеличение интенсивности ультразвука до значений, превышающих порог кавитации, приводит к появлению в среде пульсирующих газовых пузырьков, порождающих микропотоки с градиентами скоростей порядка 10⁴ с^-1. Клетки радиусом 5 10~⁶м, попавшие в поле этих микропотоков, могут испытывать сдвиговые усилия, значительно превышающие значения, при которых начинают разрушаться клеточные мембраны.

Разрушение клеток начинается не сразу после включения ультразвука и заканчивается не мгновенно после его выключения. Чем выше интенсивность ультразвука, тем короче промежуток времени между моментом его включения и началом процесса разрушения клеток, и тем длительнее последействие, когда ультразвук уже выключен, а клетки продолжают разрушаться. В поисках причин такого последствия были исследованы изменения в морфологии эритроцитов, подвергнутых ультразвуковому воздействию в суспензии, и обнаружены «дыры» в цитоплазматических мембранах, через которые содержимое клеток вытекает в окружающую среду.

Скорость вытекания содержимого эритроцитов сквозь дефекты в мембранах после выключения ультразвука ограничена диффузией и вязким течением. Очевидно, эта скорость достаточно мала и может обеспечить наблюдаемое последействие. Аналогичное явление наблюдается не только для эритроцитов, но и для других клеток, разделенных внутриклеточными мембранами на компартаменты.

В обычных условиях внутриклеточные мембраны препятствуют вытеканию их содержимого через одиночные дефекты в цитоплазматической мембране. Однако под действием ультразвука внутри клеток возникают микротечения. Они разрушают компартментацию, перемешивают содержимое и обратимо снижают вязкость цитоплазмы. После этого ничто не препятствует вытеканию содержимого клеток крови через повреждения в цитоплазматических мембранах.

Исследование зависимости скорости ультразвукового разрушения клеток от температуры на примере эритроцитов показало, что скорость сонолизиса мало изменяется в диапазоне 20…36 °С. При более высоких температурах начинается тепловой гемолиз. Ультразвук ускоряет его и быстро разрушает клетки.

Суммируя приведенные данные и пренебрегая скоростью спонтанного разрушения клеток, можно показать, что средняя скорость ультразвукового разрушения клеток рассчитывается по формуле: где С — концентрация клеток в суспензии;

k — коэффициент, показывающий, какая часть акустической энергии преобразуется в энергию микропотоков и затрачивается на разрушение клеток;

/ - расстояние от излучателя до той точки в объеме, где интенсивность ультразвука уменьшается в результате акустических потерь (поглощения, рассеивания) до порога кавитации;

/ - интенсивность ультразвука;

/_п — интенсивность, соответствующая порогу кавитации;

А — коэффициент, характеризующий потери акустической энергии.

Температуру можно не учитывать, если в опыте она не превышает.

36 °C.

Из анализа приведенного выражения следует, что при / «/_п значение 1А (/ — /») «1, и средняя скорость разрушения клеток в суспензии — линейная функция интенсивности ультразвука (У * /), а при интенсивностях ультразвука, близких к пороговым, V = (/ -/_п)².

Рис. 2.11. Зависимость отношения скоростей разрушения лейкоцитов здоровых (V_H) и больных лейкозом (У_л) коров от интенсивности ультразвука.

Из общих соображений следовало бы, что измерять различия в скорости разрушения клеток разных типов удобнее при / «/_п, где V линейно зависит от интенсивности ультразвука. Однако наиболее существенные различия в параметрах, характеризующих процесс разрушения клеток крови здоровых и больных людей и животных, были обнаружены при интенсивностях ультразвука, близких к пороговым. Эти различия уменьшаются с увеличением интенсивности ультразвука и становятся пренебрежимо малыми при 0,6…0,8 Вт/см².

В качестве примера можно привести зависимость отношения скоростей разрушения лейкоцитов здоровых и больных лейкозом коров от интенсивности ультразвука (рис. 2.11). Аналогичные зависимости получены и для клеток других типов.

Следует отметить, что даже в идеальных условиях поле в ближней зоне излучателя существенно неоднородно; наряду с максимумом здесь имеются области, где амплитуда звукового давления обращается в нуль. Максимальные значения амплитуды звукового давления могут быть в 3−4 раза больше или меньше усредненных значений, что следует учитывать при определении порогов физико-химического и биологического действия ультразвука.

Ультразвуковой метод, позволяющий оценить механическую резистентность цитоплазматических мембран как усредненную для всей исследуемой совокупности клеток, так и с учетом индивидуальных различий их отдельных популяций, в последнее время все шире применяют в экспериментальной биологии, медицине и ветеринарии. Использованный сначала для исследования эритроцитов этот метод был назван методом ультразвуковых эритрограмм. В дальнейшем ультразвуковой метод, пригодный для оценки механической резистентности не только эритроцитов, но и любых клеток в суспензии, стали называть методом ультразвуковых цитолизо грамм.

По сути метод ультразвуковых цитолизограмм представляет собой метод определения кинетических параметров ультразвуковой дезинтеграции клеток, находящихся в суспендированном состоянии. Необходимым условием для ультразвуковой дезинтеграции клеток с воспроизводимой кинетикой является стабильная кавитация. Очевидно, что разрушение клеток под действием ультразвука имеет вероятностный характер.

Регистрируя любым способом изменение концентрации клеток в суспензии в процессе воздействия ультразвуком, можно получить кривую, характеризующую распределение клеток по стойкости к ультразвуковому (механическому) воздействию — ультразвуковую цитол изограмму.

Наиболее удобный способ регистрации снижения концентрации клеток в суспензии — турбидиметрия, основанная на рассеянии света частицами среды, усредненный радиус которых более чем на порядок превышает длину волны рассеиваемого света. При этом длину волны обычно выбирают такой, чтобы поглощение света средой было минимальным.

Динамику турбидиметрического ослабления чаще всего регистрируют фотоэлектрическим способом с помощью установки, которая состоит из двулучевого колориметра, регистрирующего устройства, и генератора ультразвуковых колебаний с преобразователем небольших размеров.

В установке удобно использовать медицинские терапевтические ультразвуковые генераторы, обеспечивающие ультразвуковое излучение с частотой 880 кГц и интенсивностью в интервале 0,05… 1 Вт/см².

Принцип метода ультразвуковых цитолизограмм заключается в следующем.

При введении ультразвука в кювету колориметра с суспензией клеток (рис. 2.12) последние начинают разрушаться, и светорассеяние изменяется, отражая уменьшение числа целых клеток. В кювете с плоским стеклянным дном, параллельным излучающей поверхности пре;

Рис. 2.12. Принцип метода ультразвуковых цитол изограмм:

1 — излучатель ультразвука; 2 — фотоэлектрический колориметр; 3 — кювета с суспензией клеток; 4 — регистратор

образователя, возникает стоячая волна, и в этом случае ультразвуковое поле может быть охарактеризовано средней плотностью энергии.

На диаграммной ленте непрерывно регистрируется сигнал, пропорциональный (для достаточно малых концентраций клеток) мгновенным значениям турбидиметрического ослабления (рис. 2.13, а).

При турбидиметрических измерениях необходимо учитывать, что кавитация сопровождается увеличением мутности среды. Рассеяние света одиночной частицей, в том числе кавитационным пузырьком, возрастает пропорционально квадрату радиуса пузырька, и, следовательно, для цитолизиса удобно использовать высокочастотный ультразвук, так как размеры резонансных кавитационных пузырьков в первом приближении обратно пропорциональны частоте. Однако при частотах ультразвука более 1,5 МГц клетки, находящиеся в суспензии, быстро оседают на дно кюветы, не успевая разрушиться. Поэтому для метода ультразвуковых цитолизограмм чаще всего используют ультразвук с частотой 1 МГц.

Рис. 2.13. Экспериментальная кривая (а) и нормированная кривая (б) кинетики ультразвукового цитолизиса эритроцитов свиньи При этой частоте порог кавитации в суспензии клеток около 0,35 Вт/см², а резонансный радиус кавитационного пузырька примерно 3 мкм, что соизмеримо с усредненным радиусом форменных элементов крови. Кавитационных пузырьков при этих условиях намного меньше, чем клеток в суспензии, и кавитация не вносит значительных возмущений в светорассеяние.

В устойчивом режиме кавитации обусловленное ею светорассеяние не меняется во времени, и поправка сводится к сдвигу всех мгновенных значений ординат экспериментальной кривой на величину, обусловленную кавитационным светорассеянием (рис. 2.13, б).

Нормированная ультразвуковая цитолизограмма в интегральной форме соответствует распределению изучаемых клеток по механической резистентности.

Интегральную ультразвуковую цитолизограмму дифференцируют и анализируют на наличие локальных экстремумов. Если таких экстремумов нет, то цитол изограмму можно представить в аналитическом виде:

где Ui — показания регистратора в момент измерения;

U" - показания регистратора в конце измерений, когда светорассеяние перестает изменяться, характеризуя окончание процесса.

Параметры Ьо и Т находят методом наименьших квадратов, спрямляя экспериментальную кривую в полулогарифмических координатах:

Если предэкспоненциальный множитель bo= 1 (в пределах ошибки измерения), то ультразвуковая цитолизограмма имеет вид простой экспоненты, описывается приведенным выражением и может быть полностью охарактеризована постоянной времени Т.

Если же величина bo * 1, то цитолизограмма имеет более сложный характер и определяется выражением:

при условии, что сумма коэффициентов Ао + А + … А, = 1.

Ультразвуковые цитолизограммы в основном можно условно раз делить на четыре типа.

• 1. Если цитолизограмма имеет вид экспоненты, то, учитывая чисто вероятностный характер процесса ультразвукового лизиса, можно полагать, что все клетки исследуемого образца равнозначны по механической резистентности, которая пропорциональна постоянной времени (Г) экспоненты.
• 2. Если цитолизограмма апроксимируется суммой экспонент, то, вероятно, исследуемая популяция клеток неоднородна по механической резистентности и представляет собой совокупность нескольких групп, внутри которых клетки равнозначны. В этом случае каждый из предэкспоненциальных множителей А* равен относительной концентрации клеток в данной группе. Механическая резистентность клеток в каждой группе может быть охарактеризована постоянной времени для этой группы — 7*.

Время, за которое происходит полный лизис (TU), характеризует усредненную механическую резистентность клеток в обоих вышеприведенных случаях. В первом случае информативность параметров Ги Г равнозначна, во втором необходимо учитывать, что на параметре Т не отражается неоднородность исследуемой популяции клеток.

При сравнительном анализе удобно пользоваться тремя параметрами — Т, Т*. и Ьо. Степень отклонения Ьо от единицы характеризует неоднородность исследуемой популяции клеток, а увеличение Т или 7~ свидетельствует о возрастании усредненной механической резистентности клеточных мембран.

• 3. Явно не экспоненциальный характер цитолизограммы, как правило, связан со спонтанным лизисом клеток, либо с методическими ошибками (например, с неправильным определением начала процесса).
• 4. Неполный при данных условиях ультразвуковой лизис свидетельствует либо о присутствии в образце группы клеток с аномально высокой механической резистентностью, либо о незавершенности процесса лизиса.

Анализ результатов ультразвукового цитолизиса удобно проводить с использованием компьютера.

При подборе оптимальных значений: начальной концентрации клеток в суспензии, ее температуры, средней плотности энергии в ультразвуковом поле и пр. — можно подобрать условия, варьирование которых в определенных пределах мало влияет на воспроизводимость, точность и информативность конечного результата.

Для определения оптимальных условий ультразвукового цитолизиса была исследована динамика ультразвукового разрушения тромбоцитов, эритроцитов, лейкоцитов ряда животных при изменении начальных концентраций клеток (турбодиметрическое ослабление в пределах 0,1−1,2) и при плотности энергии ультразвука 0,04…0,13 Вт/см³.

Исследование проводили при температуре 24 °C, так как в интервале 22…28 °С характер ультразвуковых цитолизограмм практически не зависит от температуры. Было установлено, что при 100%-ном ультразвуковом лизисе относительное турбидиметрическое ослабление для эритроцитов принимает значение 14−15, для лейкоцитов — 12−14, для кровяных пластинок — 10−12. Порог кавитации при повышении концентрации эритроцитов и лейкоцитов в суспензии до значений, соответствующих турбидиметрическому ослаблению, — 1,2 (для тромбоцитов 0,9) оставался в пределах 0,04…0,05 Вт/см³.

Турбидиметрическое ослабление, обусловленное кавитацией, через 1…2 с после ее возникновения устанавливается на постоянном уровне, практически не зависит от концентрации клеток в суспензии и составляет 0,01−0,05 (в зависимости от интенсивности ультразвука) при 540…750 нм. Для форменных элементов крови различного происхождения динамика ультразвукового лизиса максимально различается при плотности энергии 0,04 Вт/см³. При 0,08…0,09 Вт/см³различия существенно уменьшаются вплоть до полной нивелировки. Однако ошибка воспроизводимости метода в соответствии с оценкой по двум параметрам (время 50%-ного и 100%-ного лизиса) при плотности энергии 0,04 Вт/см³ в некоторых случаях достигает 40%. При увеличении плотности энергии до 0,05…0,06 Вт/см³ ошибка воспроизводимости снижается до 5%.

Для каждого типа клеток при всех исследованных плотностях энергии в поле ультразвука существует область достаточно малых концентраций клеток, в которой динамика ультразвукового цитолизиса практически не зависит от концентрации (табл. 2.1).

Таблица 2.1

Концентрация клеток (по турбидиметрическому ослаблению), при которой динамика ультразвукового цитолизиса не зависит от плотности ультразвуковой энергии

Во всех случаях для ультразвуковой цитолизометрии оптимальной является средняя плотность ультразвуковой энергии, равная 0,05 Вт/см³, которую можно обеспечить, излучая в кювету объемом 8 см³ звук с интенсивностью 0,4 Вт/см². Оптимальная концентрация клеток в исследуемой суспензии соответствует величине начального турбидиметрического ослабления 0,2−0,35. При более высокой концентрации клеток усложняется интерпретация экспериментальных кривых, так как приходится учитывать поправки на нелинейность фотоэлектрической регистрации турбидиметрического ослабления. При более низких начальных концентрациях клеток снижается чувствительность метода и возникает необходимость введения поправок на светорассеяние кавитационными пузырьками. Началом процесса следует считать момент возникновения кавитации в жидкости, а цитолизис проводить при температуре 24 °C.

При выполнении указанных условий ультразвуковая цитолизометрия может быть успешно применена при диагностике ряда заболеваний, а также для оценки изменений свойств клеточных мембран при консервировании, гемосорбции, гемодиализе и других манипуляциях с клетками в суспензии.

До последнего времени систематических исследований механической прочности эритроцитов не проводилось, и лишь недавно были получены данные об ультразвуковой резистентности мембран эритроцитов человека, а также лошади, быка, коровы, пони, овцы, козы, свиньи, собаки, лисы, песца, кролика, курицы, морской свинки, белой крысы, белой мыши и др. (рис. 2.14).

Ультразвуковая резистентность эритроцитов заметно различается у животных разных видов в зависит от массы их тела, возрастая с увеличением последней в виде показательной функции.

где R — резистентность эритроцитов;

М — масса тела животных.

Рис. 2.14. Зависимость ультразвуковой резистентности эритроцитов от массы тела животных и человека:

1 — белая мышь; 2 — белая крыса; 3 — морская свинка; 4 — курица; 5 — кролик; 6 — песец; 7 — лиса, 8 — собака; 9 — коза; 10 — овца; 11 — свинья; 12 — человек; 13 — пони; 14 — корова; 15 — лошадь; 16 — бык Показатель степени отражает характер изменения ультразвуковой резистентности с изменением массы тела. Этот показатель меньше единицы. Отсюда следует, что в ряду близких видов или в процессе роста ультразвуковая резистентность эритроцитов увеличивается медленнее, чем масса тела животных.

Поиск причин зависимости ультразвуковой резистентности от массы тела показал, что, по крайней мере, у исследованных видов эритроциты за время своего существования делают примерно одинаковое число оборотов в кровяном русле, а время одного полного оборота уменьшается с уменьшением размера и массы животного (табл. 2.2). Соответственно уменьшается и длина пути, проходимого эритроцитами за время одного оборота. Средние числа оборотов за время существования эритроцитов и время одного полного оборота были рассчитаны, исходя из данных о полном объеме крови, минутном объеме сердца и времени жизни эритроцитов соответствующих животных.

Таблица 2.2

Масса тела и некоторые параметры кровообращения теплокровных

Поскольку число оборотов эритроцитов за время их существования у всех видов животных примерно одинаково, то у мелких животных эритроциты за время их существования проходят значительно меньший путь, чем у животных крупных размеров.

По-видимому, это одна из причин, обусловливающих необходимость в более высокой механической прочности мембран эритроцитов крупных животных, так как в кровяном русле, в особенности в узких капиллярах, эритроциты подвергаются значительным механическим воздействиям. Прямая пропорциональность между ультразвуковой резистентностью эритроцитов и средним временем их полного обращения свидетельствует в пользу данного предположения. Возможно, прочность мембраны зависит от содержания в ней холестерина и сфингомиелина, увеличивающегося с увеличением массы животного мри соотвегствующем уменьшении количества фосфатидилэтаноламина и фосфатидилхолина в мембранах.

Сравнивая зависимость, отображенную на рис. 2.14, с известной кривой «от мыши до слона», иллюстрирующей связь интенсивности обмена веществ с массой тела животного, можно предположить, что резистентность эритроцитов также связана с интенсивностью обменных процессов в организме.

Подтверждение этому было получено при сравнении скорости ультразвукового гемолиза эритроцитов животных одного вида, но находящихся в разных условиях. Так, эритроциты стриженой овцы менее устойчивы к ультразвуковому воздействию, чем эритроциты овцы, покрытой шерстью. У коз, обитающих в горах, стойкость эритроцитов выше, чем у коз, живущих в равнинной местности.

Сравнение прочности эритроцитов овцы и барана, быка и коровы, мужчины и женщины показало, что у особей женского пола ультразвуковая резистентность эритроцитов в 1,2 раза ниже, чем у особей мужского пола (рис. 2.15). Интересно отметить, что прочность эритроцитов барана после кастрации постепенно уменьшается и через 80 дней лишь незначительно превосходит прочность эритроцитов овец.

Рис. 2.15. Зависимость ультразвуковой резистентности эритроцитов теплокровных от их пола и условий существования:

1 — горная коза;2 — равнинная коза;.? — овца, покрытая шерстью; 4 — стриженая овца; 5 — мужчина; 6 — женщина Характерные изменения в ультразвуковых эритрограммах человека и животных можно наблюдать при различных физиологических состояниях и патологиях. При циррозе печени циркулирующие в крови эритроциты частично повреждаются токсическими продуктами, которые насыщают кровь вследствие функциональной несостоятельности печени. На эритрограмме коров с циррозом печени наблюдается снижение стойкости всей массы клеток. Такая картина наиболее характерна при циррозе с выраженной недостаточностью клеток паренхимы.

Аналогичные по характеру изменения наблюдаются при фасциолезе — паразитарном заболевании печени домашних и диких животных. Выделяемые паразитом продукты жизнедеятельности оказывают влияние на ткани печени, вызывающие гепатиты и циррозы.

При лейкозах обнаружено повышение ультразвуковой резистентности лейкоцитов и эритроцитов, что объясняегся пополнением крови формами клеток, обладающих повышенной прочностью клеточных мембран.

При заболеваниях воспалительного характера, таких, как пневмонии, эндометриты, маститы, обнаружено увеличение содержания в крови клеток с пониженной ультразвуковой резистентностью.

Характерные изменения на эритрограммах животных наблюдаются и при диспепсиях, кетозах и других заболеваниях. Изменяются эритрограммы в зависимости от условий содержания и кормления животных, в том числе домашней птицы.

Ультразвуковая резистентность эритроцитов 15-дневных эмбрионов кур коррелирует с инкубационным качеством яйца, причем повышение выводимости благодаря доинкубационной обработке яиц стимуляторами — парааминобензойной кислотой, хлорнокислым аммонием или ультразвуком низких интенсивностей соответственно изменяет и ультразвуковую резистентность эритроцитов эмбрионов.

В условиях загрязнения окружающей среды промышленными отходами представляет интерес возможность оценки состояния рыб при ртутном отравлении по скорости разрушения их эритроцитов в ультразвуковом поле. Предварительно было показано, что некоторые отличия в строении эритроцитов рыб не являются препятствием для использования метода ультразвукового гемолиза.

Исследования показали, что скорость гемолиза эритроцитов рыбы, обитающей в среде, содержащей препараты ртути, со временем увеличивается, причем скорость ультразвукового гемолиза прямо пропорциональна концентрации ртути, накапливающейся в печени рыбы.

Разработанный вначале для ветеринарных целей метод ультразвукового цитолизиса оказался весьма полезным и в медицинской практике. Так, в результате исследования крови клинически здоровых людей обоего пола в возрасте 15−60 лет было установлено, что параметры, характеризующие ультразвуковую резистентность эритроцитов в норме, стабильны. Эта стабильность, очевидно, обусловлена действием физиологических механизмов, поддерживающих динамическое равновесие в качественном составе красной крови. Ультразвуковая резистентность эритроцитов в пределах 15−60 лет мало зависит от возраста доноров, тогда как химическая стойкость эритроцитов подвержена существенным возрастным изменениям.

Исследование эритроцитов больных выявило существенные различия в параметрах, характеризующих ультразвуковой гемолиз в норме и при опухолях. Так, полное время гемолиза эритроцитов здоровых доноров составило (485 ± 10) с, при раке молочной железы — (617 ± 30) с, при раке желудка — (603 ± 40) с, при раке легких — (555 ± 40) с и при лимфогрануломатозе — (735 ± 67) с.

При опухолях ультразвуковая резистентность эритроцитов и, следовательно, их механическая стойкость заметно увеличиваются по сравнению с нормой. Аналогичные данные были получены при лейкозах крупного рогатого скота, при спонтанных опухолях у собак, при привитой под колено взрослым крысам карциноме РС-1.

Благоприятно протекающий процесс лечения опухолевого заболевания сопровождается снижением прочности мембран эритроцитов, вплоть до значений, характеризующих норму, и чем эффективнее лечение, тем быстрее стремится к норме ультразвуковая резистентность эритроцитов. Очевидно, что быстрое снижение резистентности эритроцитов до нормы можно ожидать также при удачной хирургической операции и незначительные изменения этого параметра при неполном иссечении опухоли или ее метастазов.

Различия в количестве разрушенных эритроцитов наблюдались ранее при ультразвуковой обработке (830 кГц; 0,2…0,8 Вт/см²; 5 мин) разбавленной в 10 раз крови здоровых животных и животных с гипотиреозом и экспериментальным диабетом. Резистентность эритроцитов человека к низкочастотному ультразвуковому воздействию (24 кГц, 60 Вт) при некоторых заболеваниях крови также существенно отличается от нормы. Так, при серповидной анемии и сфероцитозе устойчивость эритроцитов к ультразвуку оказалась заметно повышенной, тогда как дефицит железа в организме приводит к уменьшению стойкости клеток красной крови.

Метод ультразвуковых цитолизограграмм успешно использован и для оценки качества эритроцитов, консервированных при пониженных (+4 °С) и низких (-196 °С) температурах. Ультразвуковая резистентность эритроцитов, хранящихся при +4 'С, скачкообразно уменьшается на 4-й и 17-й день хранения, после чего остается практически неизменной, вплоть до 22 суток хранения. Этот результат хорошо согласуется с известными данными об увеличении скорости спонтанного гемолиза в эти сроки. На ультразвуковых эритрограммах, полученных на 4-й и 17-й день хранения, ясно видны различия в распределении эритроцитов по группам стойкости, выражающиеся в увеличении количества менее стойких к ультразвуковому воздействию клеток.

Консервирование эритроцитов при -196°С под комплексной защитой полиэтиленоксида с молекулярным весом 1500 и диметилацетамида, обладающих, соответственно, и экстраи интрацеллюлярным действием, приводит к изменению распределения клеток по прочности, к увеличению числа более прочных эритроцитов. По-видимому, криофилактики оказывают стабилизирующее действие на клеточные мембраны. Судя по ультразвуковым эритрограммам, эритроциты, хранившиеся в течение 5 лет при температуре -196 «С под защитой глицерина 35%-ной концентрации, лучше переносят хранение, чем эритроциты, хранившиеся в среде, где концентрация глицерина не превышала 30%. Это хорошо согласуется с известным фактом, что криозащитное действие глицерина в определенных пределах пропорционально его концентрации в среде.

Ультразвуковая резистентность эритроцитов, хранившихся при -196'С, непосредственно после размораживания значительно выше, чем их резистентность после 24 ч последующего хранения при +4 °С. В связи с этим можно рекомендовать использовать их в кратчайшие после размораживания сроки.

Нет принципиальных сложностей для измерения ультразвуковой резистентности лимфоцитов, тромбоцитов, сперматозоидов и других клеток. Так, при изучении лизиса форменных элементов крови свиньи в ультразвуковом поле было обнаружено, что в присутствии лейкоцитов и эритроцитов тромбоцитопения наступает при более низких интенсивностях ультразвука, чем при воздействии ультразвуком на чистую тромбоцитарную плазму.

Применение ультразвуковой цитолизометрии для оценки качества спермы позволило обнаружить различия в механической резистентности сперматозоидов животных разных видов, выявить закономерность, в соответствий с которой устойчивость сперматозоидов к механическим воздействиям тем выше, чем больше масса животного. Поэтому неудивительно, что сперма быка обладает большей криорезистентностью, чем сперма кролика, поскольку при замораживании так же, как и при ультразвуковом воздействии, механический фактор является одним из приводящих к разрушению и гибели клетки.

Неизвестно, обусловлена ли повышенная прочность сперматозоидов крупных животных биологической потребностью, или это обусловлено повышенным содержанием холестерина и сфингомиелина во всех клетках крупных животных. Отметим, однако, весьма высокую резистентность сперматозоидов рыб, что, по-видимому, объясняется условиями внешнего оплодотворения.

Ультразвуковая резистентность сперматозоидов коррелирует с их подвижностью и, следовательно, с их оплодотворяющей способностью. Это позволяет быстро и объективно оценивать пригодность спермы для искусственного оплодотворения, отрабатывать щадящие режимы ее хранения при низких температурах, подбирать подходящие криопротекторы.

Этими примерами применение ультразвуковой цитолизометрии не ограничивается. Широкое применение метода позволяет решать самые разные задачи. Метод ультразвукового разрушения эритроцитов и других клеток значительно информативнее метода определения механической прочности эритроцитов, используемого в настоящее время в клинической практике, и способен его заменить, по крайней мере, в тех случаях, когда небольшое удорожание анализов оказывается несущественным по сравнению с ценностью получаемой информации.