Принципы проектирования БТС для анализа морфологических параметров эритроцитов

Определение целевого назначения и класса проектируемой БТС. Цель проектирования — разработка автоматизированного анализатора морфологических параметров эритроцитов (АМПЭ) для диагностики различных заболеваний. При этом важными требованиями являются автоматизация сканирования мазков крови и анализа качества их приготовления, а также уменьшение времени сканирования.

Наиболее часто анализ морфологических параметров эритроцитов осуществляют по мазкам крови. Однако такой анализ информативен только при качественном приготовлении мазка, поэтому сначала следует оценить качество мазка, а затем проводить визуальное или автоматизированное определение параметров эритроцитов.

Необходимый показатель качества приготовления мазка крови — наличие области монослоя, в котором клетки крови не образуют монетных столбиков и не влияют на форму соседних эритроцитов, что позволяет проводить анализ морфологических параметров эритроцитов.

В настоящее время для автоматизированных методов анализа клеток крови перспективен метод пространственно-частотного анализа (ПЧА) гемоизображений. В этом методе используется комплекс гематологических характеристик (КГХ), соответствующий комплексу параметров клинического анализа крови. Комплекс гематологических характеристик определяется по пространственно-частотным спектрам (ПЧС) гемоизображений, которые формируются с помощью когерентно-оптического процессора, входящего в состав лазерного анализатора крови.

Как следует из изложенного выше, АМПЭ относят к классу БТС для лабораторной диагностики и оптической техники (см. рис. 12.1). В основе этого класса БТС лежит зондирование биообъекта путем взятия биопроб (тест-тканей) с последующим автоматизированным определением КГХ крови по гемоизображению мазка крови.

Создание базы данных о свойствах биообъекта. Объем крови в организме взрослого человека в среднем равен 5…6 л, что соответствует 6…8% массы тела. Повышение общего объема крови называют гиперволемией, уменьшение — гиповолемией. Кровь состоит из кровяной плазмы и взвешенных в ней форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов). Доля форменных элементов составляет 40…45 % объема крови, а доля плазмы — 55…60%. Это соотношение получило название гематокритного соотношения, или гематокритного числа.

Относительная плотность крови (1,050… 1,060) зависит в основном от числа эритроцитов, относительная плотность плазмы крови (1,025… 1,034) — от концентрации белков. Вязкость крови составляет 5 у.е.л. ед., плазмы — 1,7…2,2 у.е.л. ед. при условии, что вязкость воды равна 1. Вязкость обусловлена наличием в крови эритроцитов и в меньшей степени белков плазмы.

Осмотическое давление крови, в среднем соответствующее 7,6 атм, или 770 кПа, обусловлено растворенными в ней осмотически активными веществами — главным образом неорганическими электролитами. Онкотическое давление крови — составляющее осмотического давления, создаваемого белками плазмы. Это давление равно 0,03…0,04 атм, или 25…30 мм рт. ст., или 3…4 кПа.

Кислотно-основное состояние крови характеризуется соотношением водородных и гидроксильных ионов. В норме показатель кислотности крови составляет 7,36 (реакция слабоосновная), артериальной крови — 7,4, венозной — 7,35. При различных физиологических состояниях показатель кислотности крови равен 7,2 ± 0,2.

Эритроциты — наиболее многочисленные форменные элементы крови, основное содержимое которых составляет гемоглобин. Они участвуют в поддержании буферного ионно-водного равновесия, взаимодействуют с циркулирующими иммунными комплексами за счет Fc-рецепторов клеточной мембраны. Основная функция эритроцитов — снабжение тканей кислородом и участие в транспорте углекислого газа. Изменения размеров, формы или числа эритроцитов служат показателем структурно-функциональных нарушений в организме, в связи с чем важное значение имеет анализ крови.

По изменениям морфологии эритроцитов можно судить о наличии анемии и проводить раннюю диагностику этого заболевания. Распространение такой диагностики сдерживает трудоемкость визуального анализа морфологических параметров эритроцитов, а также недостаточная точность их определения.

В норме у мужчин содержится (4,0___5,0)-10¹² эритроцитов на.

1 л крови ((4___5)-10⁶ эритроцитов в 1 мкл), а у женщин — 4,5'10¹²

эритроцитов на 1 л крови (4,5−10⁶ на 1 мкл). Повышение числа эритроцитов в крови называется эритроцитозом, уменьшение — эритропенией, что часто сопутствует анемии. При анемии может быть снижено или число эритроцитов, или содержание в них гемоглобина, или и то и другое. Эритроцитозы и эритропении бывают истинными и ложными в случаях сгущения или разжижения крови.

Эритроциты человека лишены ядра и состоят из стромы, заполненной гемоглобином, и белково-липидной оболочки. Преимущественно нормальные эритроциты имеют форму двояковогнутого диска диаметром 7,5 мкм, толщиной на периферии 2,5 мкм, в центре 1,5 мкм (рис. 12.6). Эритроциты такой формы называют нормоцитами. Особая форма эритроцитов приводит к увеличению диффузионной поверхности, что способствует лучшему выполнению их основной функции — дыхательной. Специфическая форма также обеспечивает прохождение эритроцитов через узкие капилляры. Если диаметр эритроцита будет меньше 7,5 мкм, то ухудшится перенос кислорода, если более — то произойдет их быстрое разрушение. Крупные эритроциты существенную часть своей жизни проведут в костном мозгу. Кроме того, они быстрее разрушаться в селезенке.

Рис. 12.6. Эритроциты в форме двояковогнутого диска (о) и сморщенные эритроциты в гипертоническом солевом растворе (б).

Уменьшение диаметра эритроцитов (микроцитоз) наблюдается при железодефицитных и гемолитических анемиях, увеличение (макроцитоз) — при В^- и фолиеводефицитных анемиях (витаминодефицитные анемии). При гипопластических анемиях также может наблюдаться макроцитоз.

Форма эритроцитов может изменяться при железодефицитной анемии (пойкилоцитоз) и некоторых гемоглобинопатиях (серповидно-клеточной анемии, талассемии).

Эритроциты выполняют в организме следующие функции: дыхательную — перенос кислорода от альвеол легких к тканям и углекислого газа от тканей к легким; регуляцию показателя кислородности крови благодаря одной из мощнейших буферных систем крови — гемоглобиновой; питательную — перенос на своей поверхности аминокислот от органов пищеварения к клеткам организма; защитную — адсорбция на своей поверхности токсических веществ; участие в свертывании крови за счет содержания факторов свертывающей и противосвертывающей систем крови; носители разнообразных ферментов (холинэстераза, угольная ангидраза, фосфатаза) и витаминов (В_ь В₂, Вб, аскорбиновая кислота); носители групповых признаков крови.

Кровь отображает состояние организма в целом. Состояние популяции эритроцитов характеризует состояние крови. В свою очередь, состояние популяции отображается пробой крови — биопробой. Таким образом имеет место последовательность вложенных состояний: организм —* кровь —> проба крови —" эритроциты —> мазки крови —? параметры эритроцитов.

По вектору состояния (параметрам) эритроцитов может быть определено состояние организма в общем, т. е. поставлен диагноз. Согласно математике, это есть решение обратной задачи на основе экспериментальных данных о биопробах — мазках крови. Следовательно, качество диагноза определяется не только качеством биопроб, но и качеством измерений их свойств. Эту взаимосвязь учитывют при проектировании БТС.

Анализ биообъекта, выбор вектора состояния и метода количественного описания биообъекта. Взятая проба крови (биопроба) должна быть помещена в специальную одноразовую пробирку с антикоагулянтом (этилендиаминтетрацетатом, ЭДТА) и одним из красителей Романовского. Такую кровь необходимо хранить в холодильнике при температуре 5 °C не более 3…4 ч, перед нанесением мазка перемешать. Также возможно применение мазков крови, взятой непосредственно из пальца. В этом случае вследствие скоплений тромбоцитов, сходных по размерам с лейкоцитами, при автоматическом просмотре мазка может возрастать процент ложных обнаружений.

Для приготовления мазка используют объем крови 5 мкл, отобранный микропипеткой. Мазок на предметное стекло наносят специальным шпателем, например пластмассовым. На распределение клеток вдоль мазка существенно влияет скорость движения шпателя: она должна оставаться приблизительно постоянной.

При приготовлении мазка крови на стекле в нем происходит образование пяти зон (рис. 12.7). В результате размазывания по стеклу получают неравномерное распределение эритроцитов в разных зонах мазка.

Зона 1 мазка крови представляет собой обрывочные формы образований групп эритроцитов. В этой зоне не выполняется условие стационарности распределения клеток по пространству.

Зона 2 характеризуется образованием ячейкообразной структуры. В этой зоне также не соблюдается условие стационарности распределения клеток.

Рис. 12.7. Зоны 1−5 мазка крови на стекле (а) и под микроскопом (6).

Зона 3 мазка соответствует области монослоя, в которой справедлив закон Пуассона для распределения эритроцитов в поле зрения по диаметрам. Именно в этой области можно проводить исследования, связанные с различными параметрами эритроцитов, и делать достаточно достоверные выводы. В третьей зоне можно подсчитывать число клеток в единице объема и анализировать форму эритроцитов. Наличие данной зоны в мазке крови говорит о качестве его приготовления.

В зоне 4 распределение эритроцитов остается относительно равномерным и видны отдельные клетки эритроцитов. В этой зоне не все эритроциты находятся на достаточном расстоянии друг от друга, чтобы можно было пренебречь взаимным влиянием соседних клеток при анализе формы.

В зоне 5 происходит наложение нескольких слоев клеток друг на друга и формирование столбиков из эритроцитов. В этой области отсутствует ординарность распределения эритроцитов и невозможно точно описать их число и морфологию.

Таким образом, по зонам / и 5 мазка нельзя сделать достоверного анализа крови и содержащихся в ней клеток.

Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и клиновидную толщину по всей поверхности стекла. После окраски клетки крови в мазке должны иметь различные цвета: эритроциты — розовато-бурые, ядра лейкоцитов — черно-фиолетовые или пурпурно-фиолетовые, цитоплазма лимфоцитов — голубая, цитоплазма моноцитов — голубая или сиренево-голубая, цитоплазма нейтрофилов должна содержать ясно видимую нейтрофил ьную зернистость розоватого цвета, эозинофилы — гранулы оранжевого цвета (рис. 12.8).

Рис. 12.8. Форменные элементы в мазке крови человека:

/ - эритроцит; 2−6 — сегментоядерный нейтрофильный. палочкоядерный нейтрофильный, юный нейтрофильный, эозинофильный, базофильный гранулоциты; 7−9 большой, средний, малый лимфоциты: 10- моноцит; 11 — тромбоциты (кровяные пластинки) Для количественного описания качественно приготовленного мазка крови используют следующие характеристики: число эритроцитов; морфология эритроцитов; содержание гемоглобина; цветовой показатель.

Измерение диаметра эритроцитов и графическую регистрацию распределения эритроцитов по величине (эритроцитометрическая кривая, или кривая Прайса — Джонса) можно проводить с помощью прямых микроскопических и электронно-автоматических методов.

В прямом микроскопическом методе измерение осуществляют в мазке крови, фиксированном и окрашенном каким-либо методом, с использованием окуляр-микрометра и объективмикрометра.

В электронно-автоматическом методе подсчет числа частиц в зависимости от их диаметра может проводиться такими счетчиками, как, например, «Культер» и «Целлоскоп», которые оснащены амплитудным дискриминаторным устройством, позволяющим пропускать через капилляр и улавливать (подсчитывать) частицы определенного размера.

Кривая Прайса — Джонса в норме имеет правильную форму с вершиной (пиком) на 7,2 мкм и довольно узким основанием в пределах 6… 9 мкм (рис. 12.9).

Рис. 12.9. Кривые Прайса — Джонса:

1 — в норме; 2,3 — при микроцитарной и макроцитарной анемиях; 4 — нормального закона разрушения Кривая Прайса — Джонса для распределения эритроцитов по диаметрам d₃ описывается нормальным законом распределения при достаточно большом числе исследованных эритроцитов:

где Л/(с/_э) — средний диаметр эритроцитов.

Для построенной кривой величина о принимает значение, равное 0,6 мкм. В результате исследований было установлено, что значения о не должны превышать 0,8 мкм, иначе полученный результат будет трактоваться как болезнь. На кривой Прайса — Джонса выделяют три области:

• • центральную — нормальные размеры эритроцитов (отсутствие болезни);
• • слева (при микроцитарной анемии);
• • справа (при макроцитарной анемии).

Следовательно, распределение эритроцитов в зависимости от их размера позволяет судить о наличии болезни и ее характере.

Традиционный метод определения числа эритроцитов в 1 мкл крови — подсчет в счетной камере (сетка Горяйнова). В сетке Горяйнова большие квадраты, расчерченные вертикально и горизонтально на 16 малых квадратов, чередуются с квадратами, которые разделены только вертикальными или горизонтальными линиями, и с квадратами без линий. Глубина камеры равна 1/10 мм, сторона малого квадрата — 1/20 мм; таким образом, объем малого квадрата составляет 1/4000 мм³.

В строго определенном объеме счетной камеры под микроскопом подсчитывают число клеточных элементов, затем проводят пересчет полученного результата на 1 мкл крови. Предварительно кровь разводят в целях уменьшения числа клеток, подлежащих подсчету.

Число эритроцитов в 1 мкл крови определяют по формуле.

где N₃ — число эритроцитов в 1 мкл крови; а — число эритроцитов, сосчитанных в определенном количестве малых квадратов; d — количество малых квадратов, в которых считались эритроциты; Ь — степень разведения крови; 1/4000 — объем малого квадрата (умножая его на 4000, приводим к объему 1 мкл крови).

В фотометрическом методе измеряют степень погашения света определенных длин волн взвесью эритроцитов. Процент задержанного света прямо пропорционален числу (концентрации) эритроцитов.

Из электронно-автоматических методов наибольшее распространение получил импульсный метод, основанный на разнице электрической проводимости частиц крови и жидкости, которая используется для разбавления. Кровяные тельца, взвешенные в изотоническом растворе хлорида натрия, всасываются через микроотверстие диаметром 100 мкм, с обеих сторон которой имеется по одному платиновому электроду. Скачкообразные повышения сопротивления, возникающие при прохождении частиц крови через капилляр, вызывают электрические импульсы, амплитуда которых прямо пропорциональна объему частиц. Импульсы усиливаются, подсчитываются в электронном устройстве и могут быть измерены.

На основе данных по числу эритроцитов в мазке крови ставится диагноз.

Относительное снижение числа эритроцитов может наблюдаться при разжижении крови у людей с патологией почек (затруднено выведение жидкости из организма) и при введении большого объема кровезаменителей.

Абсолютное снижение числа эритроцитов в единице объема крови — это основной критерий анемий. Анемии подразделяют:

• • на дефицитные — анемии, при которых не хватает тех или иных биогенных веществ для построения эритроцитов (белководефицитные, витаминодефицитные, железодефицитные);
• • постгеморрагические (вследствие острых и хронических кровопотерь);
• • гипои апластические (врожденные и приобретенные), возникающие при гибели или нарушении функционирования стволовых клеток (родоначальниц эритроцитов) в костном мозгу;
• • гемолитические (наследственные и приобретенные).

Среднюю концентрацию с_Нв гемоглобина в одном эритроците определяют делением концентрации гемоглобина с_Нв, г/л, на число эритроцитов в одинаковом объеме крови (1 мкл). На практике среднюю концентрацию гемоглобина в одном эритроците, г/эритроцит, вычисляют по формуле.

Отношение величины с_Нв к значению 33 пг, составляющему норму концентрации гемоглобина в одном эритроците, называют цветовым показателем и обозначают d_t.

По цветовому показателю судят о том, является ли концентрация гемоглобина в эритроцитах исследуемого лица нормальной, пониженной или повышенной по отношению к норме, что имеет важное диагностическое значение. У здоровых людей цветовой показатель находится в пределах 0,86… 1,05.

Точное представление об абсолютном насыщении эритроцита гемоглобином можно получить путем вычисления средней концентрации гемоглобина в одном эритроците: 0,1 с_Нв / g, где g — гематокритное число. В норме значение этой величины равно 32. .36%.

Определение средней концентрации гемоглобина в одном эритроците, в сущности, показывает, что абсолютная гиперхромия (> 36%) не встречается при гематологических заболеваниях и, напротив, абсолютная гипохромия (< 32%) нередко наблюдается при различных анемиях, особенно железодефицитных.

Выбор вектора состояния биообъекта. Качество приготовления мазка анализируют с помощью эффективной площади корреляции (/1), наличия области монослоя (f₂), длины области монослоя вдоль средней линии (/₃) (рис. 12.10). Эти характеристики составляют компоненты вектора/качества мазка:

По значениям отклонений компонент вектора / от нормальных говорят о наличии или отсутствии области монослоя в данном мазке крови.

После анализа качества приготовления мазка проводят анализ морфологических параметров эритроцитов, в ходе которого определяют форму di, размер d, и число d₂ эритроцитов, цветовой показатель dt, гематокритное число t/₅. Эти параметры составляют компоненты вектора d состояния популяции эритроцитов:

Рис. 12.10. Определение вектора/качества мазка и вектора d состояния популяции эритроцитов По значениям отклонений компонент вектора d от нормальных ставят диагноз пациенту.

Рис. 12.11. Зависимость плотности вероятности от морфологического параметра эритроцита.

Конструирование целевой функции АМПЭ. Точность оценки морфологических параметров эритроцитов (рис. 12.11, табл. 12.1) можно определить по формуле.

где z_aj₂, Zp — значения морфологического параметра эритроцита; А — допустимая точность определения морфологического параметра эритроцитов; А_д — диагностически значимое отклонение морфологического параметра эритроцитов от среднего; а, Р — ошибки первого и второго рода, а = (3 = 5%.

Если параметром является диаметр d₃ эритроцитов, то СКО, а имеет следующие значения: в норме, а = 0,6, при макроцитарной анемии ст > 0,6, при микроцитарной анемии а < 0,6. Значение в норме: d= 7,5 ± 1,5 мкм.

Таблица 12.1. Точность оценки морфологических параметров эритроцитов.

Требуемый размер выборки эритроцитов определяют в соответствии с табл. 12.2.

Таблица 12.2. Размер выборки эритроцитов.

Примечание. р_{0 тн} = 0,1- оцениваемая относительная концентрация пойкилоцитов (критический случай).

Конструирование целевой функции диагностического АМПЭ проводят на основе совокупности критериев эффективности, определяющих свойства этого анализатора:

• • q — относительная частотная погрешность формирования ПЧС;
• • - неравномерность контраста гемоизображения;
• • #з — минимальная пространственная частота;
• • #₄ — максимальная пространственная частота;
• • qs — площадь участка области монослоя.

Критерии q — q3 требуют минимизации, а критерии q_5i q4 — максимизации своих значений.

Обобщенный критерий эффективности строят на основе оценки расстояния между идеальной моделью и альтернативами:

где <�у_;° - совокупность критериев идеальной модели, которые требуется реализовать в БТС; <7,^тах — наименьшие значения для максимизируемых и наибольшие значения для минимизируемых критериев.

Предположим, что заданные (идеальные) критерии эффективности имеют следующие значения: <�у, = 0,1; q₂ = 0,1; q% = 100 мм'¹;

= 700 мм 2. Наименьшие значения для максимизируемых и наибольшие значения для минимизируемых критериев составляют: ^,^тах = 0,2; </™^ах = 0,2; </™^ах = 120 мм^-1; </™^т = = 670 мм'¹; qfⁿ =0,1 мм².

В результате подстановки наибольших и наименьших значений в (12.1) целевая функция примет следующий вид:

После подстановки значений критериев </1 — q$ получают значение целевой функции проецируемого АМПЭ, которое равно Е_кз = 4,95.

Создание математической модели биообъекта. Такую модель строят, исходя из гемоизображений зоны мазка и соответствующего ему ПЧС (рис. 12.12).

Рис. 12.12. Гемоизображснис зоны мазка (а) и соответствующий ему ПЧС (б).

Функция пропускания i (r" (р) изображения зоны мазка описывается формулой.

где г_э — радиус эритроцита; t — функция пропускания одного эритроцита; N-, — число эритроцитов на участке мазка площадью 5_М (рис. 12.13).

Рис. 12.13. Функции пропускания гемоизображения зоны мазка (а) и одного эритроцита(б).

Функция пропускания одного эритроцита имеет вид где т — порядок оси симметрии эритроцита;

(е — размер выроста эритроцита при других случаях).

Морфологические параметры эритроцитов определяют по ПЧС гемоизображения в соответствии со следующей операцией отображения: гемоизображение t (x, у) => ПЧС /(v, у) (v — пространственная частота); затем радиальный (РПЧС) преобразуют во взвешенный РПЧС (ВРПЧС) (рис. 12.14):

для ВРПЧС.

Из (12.2) и (12.3) получают расчетное соотношение математической модели.

где /(г_э) — функция распределения эритроцитов по радиусам; J|, J_т — интенсивности; Ка — эффективный диаметр эритроцитов; ст^ - CKO распределения эритроцитов по диаметрам; г_т — размер выростов эритроцита с осью симметрии порядка т р (т) — плотность вероятности распределения эритроцитов по форме; Г_Кю — ВРПЧС по Ка.

Рис. 12.14. Преобразование РПЧС (о) в ВРПЧС (б).

На основе математической модели разработаны программы, с помощью которых можно проводить непосредственный автоматизированный анализ мазка крови и делать диагностические заключения.

Проектирование АМПЭ осуществляют в соответствии со схемой, приведенной на рис. 12.15.

Рис. 12.15. Схема АМПЭ:

СФР ПЧС — система формирования и регистрации ПЧС; СО ГТЧС — система обработки ПЧС; СОИ — система отображения информации; связи:—вещественная; ———энергетическая;—————информационная Верификация модели. Для верификации созданной математической модели рассматривали различные зоны мазка крови и для каждой из них оценивали значение эффективной площади корреляции. Эффективная площадь корреляции области монослоя должна быть не более 62 мкм², у других областей мазка эта площадь значительно больше. Данная величина определяется значениями максимальной площади эритроцита.

В результате проведенного анализа с использованием разработанной программы были получены значения эффективной площади корреляции зон 1−5 мазка, которые отличались от эффективной площади корреляции области монослоя. Значения эффективной площади корреляции области монослоя равны.

40…60 мкм².

По итогам работы программы можно сделать вывод, что анализ области монослоя по заданному критерию с использованием математической модели формирования ПЧС гемоизображения дает достоверные результаты.

В дальнейшем с использованием этой программы можно проводить автоматизированный непосредственный анализ мазка крови и делать диагностические заключения.

Использование программы значительно упрощает анализ гемоизображения, особенно при необходимости подсчета числа эритроцитов или анализа их морфологических параметров.