Криосохранение и его применение к клеточным культурам растений

Термин «криосохранение» (cryopreservation), т. е. хранение объектов при очень низкой температуре (обычно при температуре жидкого азота -196°С), употребляется для обозначения сложного многоэтапного процесса. Его целью является неограниченно долгое хранение живых клеток, тканей и органов в состоянии анабиоза. Основным признаком криосохранения является обратимое ингибирование процессов жизнедеятельности. Только в состоянии глубокого анабиоза, когда полностью останавливаются обменные, биохимические реакции и отсутствует жидкая фаза, создаются условия для длительного хранения биологической системы с последующим полным возвратом ее к исходному состоянию в условиях нормотермии.

Единственно надежным средством для решения этой задачи является глубокий холод (-140°С и ниже), обеспечиваемый с помощью жидкого азота (-196°С).

В настоящее время известны два метода криосохранения: программное (медленное) и сверхбыстрое замораживание. Программное замораживание изучалось уже давно, поэтому оно довольно широко применяется при сохранении животных и растительных клеток. Сверхбыстрое замораживание вошло в практику сравнительно недавно, однако, считается, что за этим методом будущее.

Важнейший этап процесса криосохранения — замораживание. На этом этапе возникают трудности, так как существуют две группы объектов, подвергаемых криосохранению.

Первая группа — это ткани, содержание воды в которых минимально (пыльца, ортодоксальные семена). Для таких объектов этот процесс достаточно прост. Их можно прямо погружать в жидкий азот и оттаивать впоследствии на воздухе в обычных условиях.

Вторая группа — это большинство растительных тканей. Для них характерны большие размеры клеток, прочная целлюлозная стенка и наличие центральной вакуоли. Причем именно степень вакуолизации клетки (оводненность) играет основную роль в устойчивости к действию низких температур. У таких объектов прием простого замораживания мало эффективен, так как не происходит сохранение всех исходных свойств и жизнеспособности.

При проведении работ по криосохранению клеток растений, особенно культивируемых в условиях in vitro, необходимо отбирать мелкие клетки с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды. Для этого необходимо разрабатывать в каждом отдельном случае условия замораживания и последующего их оттаивания. Это связано с тем, что одним из повреждающих факторов при замораживании является лед. Он возникает сначала в растворе вокруг клеток. Другим повреждающим фактором является дегидратация клеток, вызываемая формированием кристаллов этого внеклеточного льда. Поэтому необходимо с наименьшей потерей жизнеспособности миновать при замораживании-оттаивании зону между температурой защитного раствора и -40°С (в редких случаях до -70°С). Именно в этой температурной зоне проявляется действие обоих повреждающих факторов замораживания, каждый из которых опасен потому, что способен вызвать деструкцию внешней клеточной мембраны — плазмалеммы, и, следовательно, гибель клеток.

При проведении криосохранения живых организмов стоит несколько задач.

Первая задача криосохранения — предотвратить образование кристаллов льда внутри клеток. В случае клеток растений она решается труднее, чем для других объектов, вследствие обилия в них свободной воды. Эту трудность можно преодолеть за счет снижения скорости охлаждения или предварительным обезвоживанием клеток. Известно, что чем больше воды в клетке, тем меньше должна быть скорость замораживания. С другой стороны, предварительное обезвоживание клеток может вызвать их повреждения, связанные с дегидратацией.

Вторая задача криосохранения — ослабить стрессовые воздействия, вызванные неизбежной дегидратацией. Для этого необходим оптимальный состав смеси протекторов и оптимальная скорость замораживания. Желательна также оптимизация всей программы процесса криосохранения.

Правильный подбор условий, обеспечивающих высокую выживаемость клеток при оттаивании и рекультивации, был осуществлен при проведении планомерных фундаментальных и прикладных исследований по выяснению механизмов криоповреждений и криозащиты биологических систем разных уровней организации.

Рассмотрим эти основные механизмы.

1. Предотвращение образования внутриклеточного льда. В большинстве случаев клетка погибает при образовании льда в протопласте, поскольку для ее структур безопасны лишь кристаллы льда размером не более 0,1 мкм.

При быстром понижении температуры (20°С/мин) в протопласте образуются очень мелкие кристаллы льда, которые являются центрами кристаллизации. Они быстро растут, присоединяя молекулы воды из протопласта. Образующиеся большие кристаллы льда способны механически повредить клетки, в основном мембраны и клеточные структуры.

При медленном замораживании (в парах жидкого азота или в специальных программных замораживателях) лед образуется, в первую очередь, в межклетниках. Известно, что менее концентрированные растворы, находящиеся в них, замерзают быстрее. По мере охлаждения, возникшие в апопласте, кристаллы льда растут за счет воды. Лед формирует градиент водного потенциала, направленный из клеток в межклетники. Эго постепенно приводит к дегидратации клеток и, как следствие, к денатурации белков, нарушению функционирования мембран, увеличению концентрации ионов до токсических величин, нарушению синтеза нормальных клеточных белков.

Образование внеклеточного льда и связанный с этим отток воды из клеток стимулируются специальными веществами, которые клетки выделяют в апопласт. Такие соединения называются нуклеаторами, а сам процесс — нуклеацией. Эти вещества исполняют роль центров кристаллизации воды (затравок), тем самым повышая порог зародышеобразования льда. Благодаря нуклеаторам, лед в межклетниках образуется при более высокой температуре, чем те температуры, которые требуются для замерзания внутриклеточной среды.

Таким образом, постепенная дегидратация протопласта является одним из необходимых условий выживания клеток при замораживании.

2. Биологические антифризы. В клетках некоторых растений синтезируются высокомолекулярные соединения, тормозящие процессы нуклеации и роста кристаллов льда. Эти соединения получили название биологических антифризов. Антифризы препятствуют внеклеточному образованию льда, особенно в тех органах и тканях, чьи клетки должны сохранить максимальное количество воды и находиться в переохлажденном состоянии (почки и меристемы). Известны антифризы белковой, гликопротеиновой и полисахаридной природы.

Таким образом, возможно с помощью антифризов осуществляется блокада роста кристаллов льда.

3. Накопление сахаров и других совместимых осмолитов. Снижение содержания воды в клетках при образовании внеклеточного льда и сопутствующее дегидратации увеличение концентрации ионов в цитоплазме вызывают различного рода нарушения в структуре и функциях биополимеров, в частности происходит денатурация белков и подавляется их ферментативная активность, изменяется структура липидного бислоя мембран и нарушается их целостность. Деструктивные изменения в мембранах в свою очередь приводят к нарушению внутриклеточной компартментации веществ.

Регуляция осмотического давления в клетках при холодовой дегидратации осуществляется преимущественно за счет биосинтеза низкомолекулярных органических соединений, которые получили название осмолитов. Они хорошо растворимы в воде, нетоксичны, не вызывают изменений в метаболизме, отчего и получили второе название совместимых веществ. Это могут быть монои олигосахариды, многоатомные спирты, аминокислоты, бетаины, амины и белки.

Наряду с осморегуляцией, эти вещества выполняют еще одну очень важную при дегидратации функцию. Она может быть определена как защитная (протекторная) по отношению к биополимерам цитоплазмы. Подчеркивая двойную роль осмолитов, их часто называют криопротекторам и (греч. kryos — холод, лат. protector — покровитель, защитник).

Наиболее известны такие криопротекторы, как диметилсульфоксид (ДМСО), различные сахара, глицерин, этиленгликоль, пролин. Все они делятся на две группы — проникающие и непроникающие в клетки, хотя это разделение достаточно условно.

Так, глицерин может проникать в клетку при комнатной температуре, или выступать как непроникающее соединение, если его добавлять при 0 °C.

Криопротекторы, синтезируясь в клетках при пониженных температурах, могут предотвратить или резко замедлить рост кристаллов льда. Чем выше концентрация раствора, тем ниже точка его замерзания. При накоплении, например, растворимых сахаров в клетке, во-первых, понижается водный потенциал цитоплазмы, снижается точка ее замерзания, что препятствует образованию внутриклеточного льда. Во-вторых, сахара повышают осмотическую концентрацию клеточного сока, способствуя увеличению водоудерживающей силы клеток и, тем самым, защищая их от обезвоживания при образовании внеклеточного льда. В-третьих, сахара защищают белки от денатурации, наступающей вследствие сближения макромолекул при дегидратации, а также повышения концентрации токсичных веществ.

Таким образом, гидрофильные белки, монои олигосахариды, обладающие криопротекторным эффектом, способны связывать значительные количества воды. Связанная таким образом вода уже не замерзает и не транспортируется. Считается, что белки и углеводы, обладающие криопротекторным эффектом, способны стабилизировать другие белки и клеточные мембраны при дегидратации клеток.

4. Изменение состава мембранных липидов и текучести мембран. Дегидратация клеток оказывает непосредственное действие на структурное состояние липидов мембран. Мембраны в норме связывают до 30—50% воды клетки. Взаимодействуя с заряженными и полярными группами белков и фосфолипидов, вода стабилизирует структуру мембран.

Основной причиной повреждающего действия низких температур на клетки является нарушение функционирования клеточных мембран из-за их затвердевания, связанного с фазовыми переходами, поскольку при достаточно низких температурах липидные бислои ведут себя, как твердые тела. При температуре выше фазового перехода структура бислоя сохраняется, при этом жирные кислоты «плавятся», в результате чего вращение и скручивание молекул происходит легче, чем при низких температурах.

Различная реакция на низкие температуры определяется в первую очередь различиями в составе жирных кислот, входящих в состав мем;

юз бранных фосфолипидов. Когда в фосфолипидах велико содержание насыщенных жирных кислот (таких как пальмитиновая и стеариновая), для таких мембран характерны более высокие температуры фазового перехода. При этом они становятся менее текучими, что нарушает функционирование многих белков — каналов, переносчиков, рецепторов, ферментов и т. п. Выявлено, что увеличение количества ненасыщенных жирных кислот (таких как линоленовая и линолевая) в составе мембран приводит к снижению температуры фазового перехода мембранных липидов и, как результат, увеличивается текучесть таких мембран.

Сильная дегидратация может стать причиной нарушения связи между липидами и белками мембран. При внеклеточном образовании льда в мембранах появляются участки, не содержащие белков.

Таким образом, главной мишенью криоповреждений клеток растений является плазмалемма. Рост толерантности к замораживанию связан с изменениями ее характеристик, в том числе состава липидов и их ненасыщенное™.

5. Абсцизовая кислота. Важная роль в адаптации клеток растений к низким температурам принадлежит фитогормону АБК (абсцизовая кислота). Было обнаружено, что АБК накапливается в растениях при различных неблагоприятных воздействиях (водном дефиците, повышенной концентрации солей, пониженной температуре и т. д.). Поскольку АБК играет важную роль в адаптации растений к стрессам, это соединение получило название гормона стресса.

На многих растениях из разных систематических групп показано увеличение внутриклеточной концентрации АБК при пониженных температурах, причем у разных видов степень увеличения была различна.

Дегидратация сопровождается значительным повышением концентрации гормона в растительных тканях и синтезом в них новых белков. Активность многих генов и белков, которые экспрессируются при низкой температуре или водном дефиците, может быть индуцирована обработкой АБК.

Таким образом, накопление АБК в ткани при пониженной температуре приводит к экспрессии ряда генов и появлению криопротекторных белков.

6. Окислительный стресс. При низких температурах наблюдается интенсивное образование АФК (активных форм кислорода) в хлоропластах, митохондриях, пероксисомах и апопласте. При продолжительном холодовом воздействии на клетки уровень АФК повышается во многих компартментах, в клетке накапливается перекись и развивается окислительный стресс.

Важный фактор устойчивости клеток к низкотемпературному воздействию — функционирование мощной антиоксидантной системы. В эту противоокислительную систему входят высокомолекулярные антиоксиданты — ферменты, такие как супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, пероксидаза, глутатион-редуктаза, а также низкомолекулярные — аскорбат, токоферол, глутатион, фенольные соединения.

При низкотемпературном стрессе активность антиоксидантных ферментов значительно возрастает, увеличивается и содержание низкомолекулярных антиоксидантов. Все это способствует снижению повреждения клеток при действии низких температур.

Важным моментом при криосохранении являются способы подготовки к глубокому замораживанию. Известно, что устойчивость клеток к замораживанию зависит от их исходного морфофункционального состояния, которое определяется особенностями культивирования, фазой роста и т. д. Так клетки в стационарной фазе обладают наиболее высокой устойчивостью. Можно подвергать замораживанию клетки и в логарифмической фазе роста, тогда для них необходимо подобрать оптимальную скорость охлаждения, иногда возникает необходимость в применении криопротекторов. При проведении работ по криосохранению необходимо, прежде всего, учитывать специфику растительных клеток; отбирать мелкие клетки, с маленькой вакуолью и пониженным содержанием воды.

Технологически процесс криоконсервации многоэтапен. Первый этап — стадия культивирования перед криоконсервированием. От состава среды культивирования в ряде случаев зависит криоустойчивость организмов. Изменение соотношения углерода и азота в среде, введение в среду культивирования жирных кислот, солей кальция либо других компонентов меняет криочувствительность организмов, выращенных в этих условиях. В связи с этим было предложено предварительное культивирование клеток растений в определенных условиях.

Отмечено, положительное влияние на криоустойчивость как краткой инкубации клеток при пониженной температуре, так и закаливания — естественной подготовки морозоустойчивых клеток. Закаливание суспензий клеток проводят, постепенно снижая температуру культивирования и одновременно увеличивая концентрацию сахарозы в среде, затем добавляют и разные криопротекторы. Однако способность к закаливанию генетически детерминирована.

Другой физиологический подход подготовки к криосохранению основан на снижении водного потенциала среды за счет добавления в нее осмотически активных веществ — криопротекторов. Среди всех известных криопротекторов выделяются такие легко проникающие в клетки вещества, как диметилсульфоксид (ДМСО, 5—10%), глицерин (10—20%), а также непроникающие высокомолекулярные — поливинил пиролидон (ПВП), декстран, полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000.

Криопротекторами могут также служить сахароза, трегалоза и смеси этих растворов. Кроме того, предварительное культивирование с маннитом и сорбитом (в концентрации 2—6%) способствовало уменьшению растяжения клеток. Положительный эффект данной подготовки к криосохранению связан со снижением оводненности клеток.

Следующий способ подготовки связан с физиологической ролью некоторых эндогенных аминокислот при различных стрессах, обусловленных водным дефицитом. В первую очередь, это пролин, чье значение для связывания воды в клетках растений широко известно. Для этих целей применяют также аланин, аспарагин, серин, глицин, а также у-аминомасляную кислоту.

Как известно, образование стрессовых белков, обуславливающих устойчивость к низким температурам, регулируется фитогормоном АБК. В результате воздействия экзогенной АБК возможно увеличение морозоустойчивости и формирование защитных механизмов у растительных объектов, что является существенным для целей криоконсервирования.

При наблюдении за клетками под криомикроскопом четко видно образование внутриклеточного льда, находящееся в прямой зависимости от степени переохлаждения, от скорости замораживания, от наличия или отсутствия центров инициации кристаллизации раствора, окружающего клетки.

Большое значение при криосохранении имеет правильно подобранный режим замораживания. Так при криосохранении клеток, тканей растений и микроорганизмов целесообразно применять программное замораживание с инициацией кристаллизации и скоростью охлаждения на первом этапе замораживания 0,25—1,0°С/мин (до -40°С). На втором этапе увеличивать скорость до 9—10°С/мин и около -60°С быстро погружать в жидкий азот.

Эту работу проводят на специальном оборудовании, обеспечивающем программное замораживание. Такие приборы выпускает специальное конструкторское технологическое бюро с опытным производством при Институте проблем криобиологии и криомедицины (г. Харьков).

Этап удаления криопротекторов и рекультивирование требует особых предосторожностей, так как выжившие клетки перенесли сильнейший стресс и частично повреждены. Для сохранения таких клеток необходимо свести к минимуму все воздействия, которые могут дополнительно повредить клетки и плазмалемму. Однако криопротекторы должны быть удалены. Был предложен физиологичный, щадящий способ для интенсификации процесса рекультивирования. Этот способ основан на диффузии криопротекторов из клеток в жидкую среду после высева суспензии клеток на фильтры, расположенные на поверхности раствора. Такая система позволяет менять раствор, не тревожа клетки, чтобы избежать дополнительного стресса, и интенсифицировать рекультивирование.

Для определения жизнеспособности клеток после оттаивания применяют наиболее простой, быстрый и вполне удовлетворительный способ — окраска витальным красителем (0,1% феносафранином или 0,25% раствором синьки Эванса), в результате которой мертвые клетки окрашиваются, а живые нет. Окончательным критерием жизнеспособности клеток, безусловно, служит четкое возобновление роста и деления клеток при рекультивации на искусственных питательных средах после оттаивания.

Таким образом, если к моменту глубокого замораживания клеточные штаммы сохраняли способность к регенерации, то и после криосохранения также имеется возможность регенерировать эти растения независимо от сроков хранения в жидком азоте, т.к. восстанавливать рост клеточных культур можно спустя годы, а эмбриогенные и морфогенетические потенции в результате криосохранения не изменяются. Конечно, если режим хранения не был нарушен, т. е. температура никогда не превышала -140°С, а все этапы криоконсервирования были достаточно оптимизированы. Следовательно, криосохранение является фактически консервацией в состоянии анабиоза (криобиоза), когда все процессы жизнедеятельности прекращены, но при правильном оттаивании и рекультивировании их можно возобновить и «оживить» биологические объекты.

Однако криосохранение требует дальнейшей работы по подбору условий к обеспечению выживания клеток. При этом следует учитывать морфофизиологические и генетические особенности клеток, способность их к закаливанию, степень проницаемости клеточных мембран; правильно подобрать смесь криопротекторов, скорость снижения температуры при замораживании и, соответственно, условия оттаивания.

Таким образом, технология, связанная с криосохранением растительных объектов, развивается и постоянно совершенствуется. Несомненно, что она имеет свое будущее, поскольку уже сегодня криобанки, основанные на методе крисохранения, могут значительно облегчить работу селекционеров, предоставив им возможность широко использовать пул генов сортов, в том числе старой селекции и диких видов, а также исчезающих видов растений.

Контрольные вопросы и задания

• 1. Какие способы сохранения живых объектов известны? Расскажите о них.
• 2. Какие технологические подходы используют для снижения экономических затрат при сохранении генофонда растений?
• 3. Дайте определение термина «криосохранение».
• 4. В чем сущность понятия «криоконсервация»? Каково его биологическое значение?
• 5. Перечислите методы, используемые при криосохранении объектов.
• 6. Почему замораживание является важнейшим этапом процесса криосохранения? Расскажите о нем.
• 7. Какие задачи стоят при проведении криосохранения живых организмов?
• 8. В чем сложность замораживания растительных клеток?
• 9. Сравните влияние на клетки внеклеточного и внутриклеточного льда, образующегося при замораживании объектов?
• 10. Как предотвратить образование внутриклеточного льда?
• 11. Расскажите о биологических антифризах.
• 12. Какие изменения в метаболизме живых организмов происходят при криосохранении?
• 13. Что такое криопротекторы?
• 14. Какова функциональная роль криопротекторов при подготовке живых объектов к криосохранению? В чем заключаются особенности их применения?
• 15. Сравните технологии быстрого и медленного замораживания и перспективы их применения.
• 16. Какие изменения происходят в мембранах клеток при низких температурах?
• 17. Какой фитогормон играет важную роль при адаптации клеток к низким температурам и в чем его значение?
• 18. Перечислите этапы технологического процесса криоконсервации и расскажите о них.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ