Способы отбора устойчивых клеток

Наряду с правильным выбором селективного фактора на эффективность клеточной селекции существенно влияет определение способа отбора устойчивых клеток. Идеальным объектом для селекции мутантов являются суспензионные культуры с преобладанием одиночных клеток или протопласты. В них легко проникает селективный фактор. Клоны, которые образуются при размножении одиночных клеток или протопластов в селективных условиях, однородны, что значительно увеличивает стабильность признака и исключает возможность регенерации химерных растений.

Для выделения устойчивых клеток из суспензии применяют «пассивный» отбор или клонирование. В первом случае суспензионную культуру длительно выращивают в среде с селективным агентом. В этих условиях размножаться могут только устойчивые формы, на фоне гибели чувствительных клеток их доля постепенно увеличивается, пока вся суспензия не будет состоять только из резистентных клеток. При клонировании клетки или протопласты высевают на агаризованные селективные среды, и отбирают растущие колонии. Второй способ позволяет быстрее и надежнее выделить мутантные клетки из общей массы. Для получения форм с более высокой резистентностью выросшие колонии ресуспендирутот и повторно клонируют на среду с более высокой концентрацией селективного фактора.

Селекцию в суспензионных культурах или в культурах протопластов успешно используют для выделения мутантных клеточных линий, но растения в этом случае получить удается далеко не всегда. Это связано, прежде всего, с тем, что не для всех видов разработаны воспроизводимые методы регенерации растений из одиночных клеток и протопластов. Кроме того, в процессе длительного культивирования, необходимого для получения хорошей суспензионной культуры, клонирования и проверки устойчивых клонов, способность к морфогенезу нередко утрачивается. Поэтому чаще селекцию проводят на уровне каллусных культур. Маленькие кусочки каллуса высаживают на селективные среды. Поскольку доступ фактора отбора внутрь каллусных инокулюмов затруднен, для полной элиминации чувствительных клеток при использовании каллуса требуется более продолжительная селекция, чем в случае суспензионных культур.

Существует несколько способов отбора резистентных каллусов. В первом случае используют среды с высокой концентрацией селективного фактора и субкультивируют каллусы до тех пор, пока не останутся только стабильно устойчивые клетки. Такой вариант клеточной селекции обеспечивает гарантированный отсев всех чувствительных клеток. Однако длительная инкубация клеток в жестких селективных условиях негативно влияет на их способность к регенерации растений.

Другие схемы клеточной селекции предусматривают использование умеренных концентраций селективного фактора. При таком способе отбора происходит обогащение культуры устойчивыми клетками, степень обогащения зависит от продолжительности культивирования в селективных условиях. При менее жестком отборе клетки сохраняют способность к морфогенезу, но существует риск выживания не мутантных, а просто адаптированных клеток. Из-за этого полученные из выживших каллусов растения не всегда являются устойчивыми. Такой «мягкий» способ клеточной селекции требует обязательного продолжения отбора на уровне растений.

В тех случаях, когда частота мутантных клеток в культуре очень низка, рекомендуют проводить «ступенчатую» селекцию, т. е. отбор на средах с постепенно повышающейся концентрацией селективного фактора. Популяция клеток, обогащенная устойчивыми формами на первых этапах селекции, лучше переносит жесткие условия отбора на последующих этапах.

Описанные схемы клеточной селекции могут быть проиллюстрированы конкретным примером. Для отбора растений кукурузы, толерантных к ионам кадмия, каллусы культивировали на селективных средах, содержащих 50 или 100 мг/л хлорида кадмия (рис. 1.23).

Рис. 1.23. Схемы различных способов отбора толерантных к ионам кадмия растений.

На среде со 100 мг/л CdCl₂ все каллусы погибли. На среде с более низким содержанием кадмия выжило около 50% клеток. После трех месяцев селекции были отобраны растущие клоны. Однако регенерированные из них растения были так же чувствительны к тяжелому металлу, как и до селекции. Тогда был использован ступенчатый отбор: каллусы сначала инкубировали на среде с 50 мг/л кадмия, выжившие клоны пересаживали на среду с 70 мг/л кадмия, а выжившие на второй среде пересаживали на среду, содержащую 100 мг/л CdCl₂. После трех циклов селекции осталось только 10% от начального числа каллусов, но полученные из них растения были значительно более устойчивы к кадмию, чем исходные.

Длительное культивирование в селективных условиях способствует более полной элиминации чувствительных клеток, и, следовательно, повышает надежность клеточной селекции. Однако следует учитывать, что длительное культивирование in vitro отрицательно сказывается на морфогенетическом потенциале тканей, а также увеличивает риск появления нежелательных сомаклональных вариантов. Кроме того, частота сомаклональной изменчивости повышается при искусственной дестабилизации генома в результате использования селективных условий. Например, селекция на среде, содержащей фузариевую кислоту, привела к существенному увеличению доли аномальных форм среди регенерированных растений томатов. Аналогичные результаты получены и при сравнении сомаклонов гороха, полученных после культивирования на стандартной среде и на среде с гербицидами. Одной из причин ускорения изменчивости в селективных условиях считается окислительный стресс, сопровождающий любые неблагоприятные воздействия.

Для культур с высоким уровнем сомаклональной изменчивости можно рекомендовать кратковременное (1—3 месяца) выращивание в селективных условиях с последующей регенерацией растений. За это время происходит обогащение популяции устойчивыми клетками. Во многих случаях кратковременная селекция оказывается эффективнее продолжительной инкубации клеток в культуре. Например, выживаемость и рост при засолении регенерантов, полученных после трехмесячной инкубации каллусов риса на среде с NaCl, были лучше контроля, а растения, регенерированные из каллуса после восьми месяцев отбора, уступали исходным по солеустойчивости. Однако следует учитывать, что кратковременная селекция in vitro требует обязательного продолжения отбора на уровне растений. Очень эффективным является проведение этапа регенерации растений также в селективных условиях. Морфогенез значительно чувствительнее к стрессовым факторам по сравнению с ростом клеток, поэтому растения получаются, главным образом, из устойчивых клеток.