Морфогенез в клеточных культурах растений

Как уже говорилось, характерной особенностью растительных клеток является их тотипотентность, т. е. способность отдельной соматической клетки полностью реализовывать свою программу развития и давать начало целому растительному организму.

Развитие многоклеточных организмов — одна из наиболее интересных, но сложных проблем в биологии. Большое распространение получило моделирование процессов онтогенеза на более простых системах: изолированных тканях, клетках и протопластах, культивируемых в стерильных условиях. Их преимущество состоит в том, что нет необходимости постоянно учитывать результаты взаимодействия органов в целостной системе растительного организма. Кроме того, экспериментатор сам имеет возможность выбирать, изменять и повторять условия опыта в соответствии с поставленной задачей.

После завершения дедифференцировки дальнейшее развитие каллусной клетки может идти разными путями.

Первый путь — это вторичная регенерация целого растения; возможна дифференцировка на уровне клеток, тканей, органов.

Второй путь — это утрата клеткой способности к вторичной дифференцировке и регенерации растения, стойкая дедифференцировка, приобретение способности расти на среде без гормонов, т. е. превращение в опухолевую. Такими свойствами часто характеризуются клетки старых пересадочных культур.

Третий путь — это нормальный цикл развития каллусной клетки, заканчивающийся ее старением и отмиранием. В этом случае клетка претерпевает вторичную дифференцировку и прекращает делиться (стационарная фаза роста). Однако такая дифференцировка не ведет к морфогенезу, а закрепляет за клеткой свойства старой каллусной клетки.

Наибольший интерес вызывает первый путь, фактически представляющий морфогенные процессы. В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток.

Вторичная дифференцировка каллусной клетки может завершиться образованием в каллусной ткани отдельных дифференцированных клеток. Они имеют определенное строение и выполняют специфические функции. Примером служит образование эпибластов — клеток, в которых запасаются вторичные метаболиты (рис. 3.12, см. цв. вклейку). Это наиболее простой тип дифференцировки каллусной клетки. Более сложная гистологическая дифференцировка завершается образованием в каллусе различных тканей: млечников, волокон, трихом, элементов ксилемы (трахеи и трахеиды) и флоэмы (ситовидные трубки и клетки-спутницы). К самым сложным видам вторичной дифференцировки относятся органогенез (образование органов) и соматический эмбриогенез (образование из соматических клеток эмбриоидов — биполярных зародышеподобных структур).

Все эти типы дифференцировки возможны только благодаря свойству тотипотентности, поскольку любая растительная клетка содержит полный набор генов, характерный для того организма, из которого она была выделена. Потенциальные возможности всех клеток растения одинаковы. Каждая из них в определенных условиях может дать начало целому организму. Однако выяснено, что реально детерминируется только одна из 400−1000 клеток, что, вероятно, связано с физиологическим состоянием клетки, с ее компетентностью. Так, у эксплантов стеблевого происхождения компетентность к действию экзогенных фитогормонов (и, следовательно, способность к морфогенезу) проявляют только клетки эпидермальных и субэпидермальных тканей. Клетки могут приобретать ее в процессе культивирования каллусной ткани, в условиях, индуцирующих морфогенез. Время, в течение которого в каллусных клетках возникает это свойство, изменяется в широких пределах. Кроме того, существенную роль в дифференциации играют генотип растения-донора, условия и физические факторы культивирования.

Все каллусные клетки, готовые к вторичной дифференцировке, т. е. детерминированные, характеризуются общими чертами. Эти клетки (клетки-инициалы) образуют утолщенную клеточную стенку, обособляясь от остальных каллусных клеток. Для них характерны более крупное ядро, высокое накопление запасных веществ, меньшие размеры вакуолей. В клетках-инициалях начинается синтез определенных белков, интенсифицируется пентозофосфатный путь расщепления гексоз. Очень важно, что между этими клетками, формирующими меристематические очаги, восстанавливаются плазмодесмы, которые практически отсутствуют в массе каллусных клеток.

Интересное предположение было высказано Л. Саксом и С. Тойвоненом (1963). Оно сводится к тому, что существует минимальная масса каллусных клеток, которая определяет способность уже детерминированных клеток к дальнейшему морфогенезу. Это подтвердилось в опытах с культурой семядолей ели, где детерминация адвентивных побегов происходила в клеточных комплексах из пяти-шести клеток. В случае развития соматических зародышей требовалось шесть — десять клеточных агрегатов.

Гистогенез. Главную роль в преобразовании каллусных клеток в сосудистые элементы играют фитогормоны, в основном ауксины. Опыты по изучению влияния апикальной меристемы побега (место синтеза ауксинов) на гистогенез в каллусной ткани показали, что ниже места прививки апекса в каллусной ткани начинали образовываться сосудистые элементы. Тот же эффект наблюдался при нанесении на каллус ауксина с сахарозой. Интересно, что повышение концентрации сахарозы способствовало образованию элементов флоэмы, а понижение — образованию ксилемных элементов. Причем такое воздействие оказывала совместно с ауксином только сахароза, что позволяет говорить о ее возможной регуляторной роли. Добавление к гормону других сахаров гистогенеза не вызывало. В некоторых случаях стимуляторами гистогенеза, помимо ауксинов, могут быть и другие фитогормоны. Так, было отмечено, что в каллусных тканях сои этот процесс начинается под воздействием гибберелловой кислоты и этилена.

Как уже отмечалось выше, в культурах in vitro существует два основных типа морфогенеза. Это органогенез, т. е. образование монополярной структуры (отдельных органов) — корневой, стеблевой, реже флоральной (цветочной) или листовой (рис. 3.13, см. цв. вклейку), и соматический эмбриогенез. При органогенезе сначала регенерируют отдельные органы, а затем уже из них — целые растения (исключение составляет корневой органогенез). При соматическом эмбриогенезе происходит образование биполярных зародышеподобных структур из соматических клеток (рис. 3.14, см. цв. вклейку). В этом случае, в отличие от органогенеза, сразу образуется зародыш, имеющий как меристему корня, так и меристему верхушечной почки, из которой в дальнейшем развивается целое растение.

Любая растительная клетка обладает одинаковыми потенциальными возможностями, так как содержит весь набор генов; следовательно, клетки сохраняют свойственную зиготе программу развития. Поэтому если получен каллус из клеток лепестка цветка, или из клеток сердцевинной паренхимы стебля, или из клеток любой ткани, то в принципе каждая такая клетка может регенерировать целое растение. Однако свойство тотипотентности не всегда реализуется, так как потенциальные возможности клеток разных типов проявляются неодинаково. В некоторых из них гены в большей степени репрессированы, в связи с чем проявление тотипотентности становится ограниченным.

Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференцировка. При этом дедифференцированные клетки вновь приобретают структуру и специализированные функции. Регенерация растения начинается с вторичной дифференцирован клеток.

Первые работы Ф. Скуга и С. Миллера показали прямую зависимость органогенеза в каллусах от соотношения фитогормонов — ауксина и открытого этими исследователями кинетина. Преобладание концентрации ауксина над цитокинином вызывает дифференцировку клеток, приводящую к образованию корневой системы. В этом случае регенерации целого растения не происходит. При увеличении концентрации цитокинина и уменьшении концентрации ауксина начинаются стеблевой органогенез и образование побега. Если его пересадить на свежую питательную среду с преобладанием ауксина, то наблюдаются образование корней и регенерация целого растения.

В настоящее время доказано, что для прохождения органогенеза очень большое значение имеют принадлежность растения-донора к классу двудольных или однодольных, его генотип, а также тип экспланта. Кроме того, морфогенез можно получить только при условии подбора оптимальной питательной среды, определенных физических факторов, при балансе фитогормонов, присутствии сигнальных белков и наличии белков-акцепторов в клетках.

Среди компонентов, входящих в состав питательных сред, существенную роль играют ионы NH₄⁺ и N0₃~. Присутствие аммонийного азота важно для начета морфогенеза, а добавление нитратного азота способствует росту и развитию образовавшихся структур. Фитогормоны, используемые для стимуляции органогенеза, не ограничиваются теперь только ауксинами и цитокининами. С этой целью в питательную среду вводят другие классы фитогормонов: абсцизины, гиббереллины, этилен.

Установлено также влияние типа экспланта на морфогенез. Например, экспланты, выделенные из верхних междоузлий растений, могут образовывать каллус, способный к флоральному морфогенезу, тогда как экспланты из нижних междоузлий давали начало только вегетативным органам.

Вопрос о механизме запуска вторичной дифференцировки у каллусных клеток остается открытым. В настоящее время самое раннее событие, связанное с морфогенезом, — это появление тканеспецифичных белков. Установлено, что все морфогенетические изменения активируются и/или контролируются специальными генами.

Соматический эмбриогенез. При соматическом эмбриогенезе клетка-инициаль дает начало зиготе. Регенерант, образующийся из соматического зародыша, полностью сформирован, что делает лишними затраты на укоренение полученных при органогенезе побегов. Кроме того, соматические эмбриоиды точнее воспроизводят генотип исходного растения, по сравнению с растениями-регенерантами, полученными в результате органогенеза. Соматические зародыши представляют и чисто практический интерес, так как их можно использовать для получения искусственных семян.

Соматический эмбриогенез очень важен для развития фундаментальных наук. Он позволяет изучать механизмы эмбриогенеза, так как почти все его фазы, за исключением первой, в растении и в культуре тканей совпадают. Наиболее ранняя из изученных фаз детерминации клетки по эмбриональному пути развития состоит в приобретении ею свойств полярности. Так, при определении плотности биоэлектрического потенциала для четырех морфогенных клеток оказалось, что максимальная плотность электрического тока была на полярных полюсах этой группы клеток. Переход клеток в следующую фазу эмбриогенеза сопровождался значительным повышением плотности тока. Предполагается, что морфогенные клетки могут поддерживать полярность за счет активного базипетального транспорта эндогенного ауксина, градиента биоэлектрических потенциалов и ионов кальция. Было также установлено, что слабый постоянный электрический ток (2 мкА) может быть индуктором эмбриогенеза.

Если органогенез можно индуцировать с помощью ауксинов или цитокининов, то соматический эмбриогенез фактически независим от экзогенных фитогормонов. Обычно эмбриогенные зоны возникают в каллусной ткани на той же питательной среде, которая использовалась для каллусообразования. Развитие соматических зародышей в каллусной ткани начинается тогда, когда устраняется дедифференцирующий фактор из питательной среды (2,4-Д или другие ауксины). Развивающийся зародыш не нуждается в экзогенных гормонах, так как сам обеспечивает себя ими.

Независимость соматического эмбриогенеза от экзогенных гормонов является аргументом в пользу точки зрения, высказанной еще Г. Хаберландтом, а позднее Ф. Стэвардом: сам процесс изолирования клетки стимулирует реализацию ее тотипотентности, т. е. переход к морфогенезу.

Таким образом, основными стимулами морфогенеза в культуре каллусных тканей являются изменения соотношения гормонов в питательной среде и сам процесс изоляции растительной клетки от организма, а дополнительным стимулом — присутствие в питательной среде нитрата серебра, нитрата аммония, некоторых аминокислот (пролин, тирозин, иногда серин), полиаминов (путресцин и спермидин). В ряде случаев маннит и сорбит стимулируют процесс морфогенеза. Ионы N0₃" оказывают влияние на развитие возникших в каллусной ткани организованных структур, а их индукцию стимулируют ионы NH₄⁺. Гибберелловая кислота способствует росту зачатков стебля, а абсцизовая — ускоряет дифференцировку органов соматических зародышей.

На регуляцию морфогенеза оказывает существенное влияние качество света. Показано, что морфогенный каллус чаще образуется на синем свету, чем на белом или красном.

Изменения на уровне индивидуальных белков во время реализации морфогенетической программы в культуре тканей позволили говорить о существовании белков развития. Однако отсутствие специфических тестов на эти белки делает их определение проблематичным. Вместе с тем при использовании гибридов, продуцирующих моноклональные антитела на мембранные белки соматических зародышей, удалось выявить полипептид с молекулярной массой 45 кДа, который встречается в ядре нескольких видов растений и, возможно, участвует в регуляции клеточного деления.

В настоящее время большое внимание уделяется генетическому аспекту морфогенеза — изучению соматического эмбриогенеза как генетически наследуемого признака. Роль основного двигателя процесса развития отводится дифференциальной активности генов. Предполагается, что гены, контролирующие соматический эмбриогенез, начинают экспрессироваться в критические периоды развития эмбриоидов.

Для перестройки и подготовки инициальных клеток к последующим быстрым делениям, которые происходят при морфогенезе, требуется лаг-фаза, после которой клетки делятся по типу дробления, образуя сферическую массу мелких изодиаметрических клеток.

В случае органогенеза эту массу клеток называют меристематическими очагами, а в случае соматического эмбриогенеза — глобулярным проэмбрио.

В дальнейшем в меристематическом очаге дифференцируются зачатки стебля, корня, листа или цветочной почки и происходит соответственно стеблевой, корневой, листовой или флоральный органогенез.

В глобулярном проэмбрио развивается биполярная эмбриоидная структура.

Можно выделить несколько последовательных стадий формирования соматических эмбриоидов из каллусной клетки: глобулярную, сердечка, торпедовидную, соматического зародыша (рис. 3.15, см. цв. вклейку). Меристематические очаги или проэмбрио могут возникать на периферии каллусной ткани или быть погруженными в нее. Определенной закономерности в их локализации обычно не наблюдается.