Расщепление ДНК (рестрикция)

Для того чтобы искусственным путем наделить какой-либо организм новыми свойствами, нужно ввести в него новый ген или группу генов, которые бы там работали — производили белки. Нужный ген «в чистом виде» получают несколькими способами. Чаще всего его выделяют из ДНК.

Выделить ген можно, используя рестрикцию ДНК, которая достигается с помощью специфических ферментов — рестриктаз. Рестриктазы представляют собой эндонуклеазы бактериального происхождения, предназначенные для защиты клеток бактерий от чужеродной (вирусной) ДНК.

Впервые рестриктазы были выявлены в клетках кишечной палочки (Е. coli), зараженных бактериофагом X. При этом оказалось, что «фаговое» потомство, выращенное на двух различных штаммах этой бактерии, с различной интенсивностью размножается в клетках противоположных штаммов.

Так, фаг, выращенный на штамме С, плохо размножается в клетках бактерии штамма Kl 2. Это ограничение развития бактериофага связано с эндонуклеазной деградацией его ДНК. Сама клеточная ДНК защищается от рестриктаз штаммоспецифической модификацией — метилированием части нуклеотидов, которое осуществляется особым ферментом — ДНК-метилазой. Чаще всего продуктами метилирования являются 6-метиладенин и 5-метилцитозин.

Таким образом, присутствие в клетках бактерии двух ферментов (рестриктазы и ДНК-метилазы) обеспечивает комплексную защиту ее ДНК. Эта система рестрикции-модификации (A-M-система) препятствует скрещиванию между разными видами и штаммами бактерий и тем самым обеспечивает сохранность их видов в эволюции.

В генетической инженерии рестриктазы используют для фрагментации молекул ДНК при создании рекомбинантных геномов. Начиная с первых работ Д. Натанса и Г. Смита (1962) число открытых рестриктаз быстро росло. В 1973 г. Г. Смит и Д. Натане предложили номенклатуру рестриктаз, которая включает следующие пункты:

• — название рестриктазы формируется из родового и видового названия микроорганизма-хозяина, содержащего Л-М-систему; при этом к первой заглавной букве родового названия добавляют две первые строчные буквы вида, например Escherichia coli — Eco, Haemophilus influenzae — Hin;
• — за родо-видовым названием в случае несовместимости приводят обозначение штамма (ЕсоВ) или серотипа (Hind);
• — различные R-M-системы, присущие одному виду бактерий, обозначают римскими цифрами: Hind I, Hind П, Hind Ш;
• — если Л-М-система локализована в геноме плазмиды, то после родо-видового названия указывают символ плазмиды: EcoRl

При изучении ДНК большое значение имеют две важные особенности рестриктаз. Первая связана со способностью фермента узнавать специфические короткие нуклеотидные последовательности в ДНК. Вторая состоит в том, что существует большое количество различных эндонуклеаз рестрикции, каждая из которых узнает специфическую последовательность.

Среди нескольких тысяч известных к настоящему времени рестриктаз выделяют 3 типа.

Рестриктазы типа I разрывают цепи ДНК случайным образом на значительном расстоянии от участка узнавания. Например, сайтом узнавания для фермента из Е. coli К12 является.

где N верхней цепи — любое основание, а N нижней цепи — комплементарное ему основание.

Рестриктаза разрезает цепь на значительном расстоянии от сайта узнавания, но при этом метилирование с образованием 6-метиладенина происходит в пределах этого сайта. В результате продукты расщепления оказываются гетерогенными, что затрудняет их использование в генетической инженерии.

Рестриктазы типа П являются основным инструментом при конструировании рекомбинантных молекул ДНК и при анализе структуры ДНК. Эти ферменты способны узнавать специфические короткие нуклеотидные последовательности, связываться с ними и делать двухцепочечные разрезы по специфическим фосфодиэфирным связям либо в пределах самого сайта узнавания, либо на вполне определенном небольшом расстоянии от него. Эти разрезы могут быть либо симметричными, либо несимметричными. В первом случае образуются так называемые «тупые концы». Так, рестриктаза Нра I разрезает ДНК в тех местах, где встречается последовательность 5'…ГТТААЦ…З'. Как и в случае других рестриктаз типа П эта последовательность является палиндромом, т. е. в обеих цепях точно напротив друг друга находятся одинаковые последовательности, читаемые в направлении 5'—>3'.

Во втором случае действие рестриктаз приводит к образованию в ДНК так называемых «липких концов»:

Из представленных схем видно, что рестриктаза Нра I гидролизует фосфодиэфирные связи между основаниями Т и А, а рестриктаза ЕсоЯ! между основаниями Г и, А в каждой цепи. Поскольку рестриктаза разрезает обе цепи в том месте, где встречаются палиндромные последовательности (5'…ГТТААЦ…З') для Нра I или (5'…ГААТТЦ…З') для EcoRl, молекула ДНК разрезается на характерный для нее набор фрагментов («фингер— принт» — «отпечатки пальцев»),.

Рестриктаза EcoR делает ступенчатые двухцепочечные разрезы, при этом у образующихся фрагментов ДНК на концах формируются короткие комплементарные одноцепочечные хвосты из четырех оснований — 5'-ААТТ-3'. При соответствующих условиях комплементарные хвосты воссоединяются. Одноцепочечные концы, образующиеся при расщеплении ДНК реегриктазой EcoRl, получили название «липких», поскольку они способны соединяться (как бы слипаться) друг с другом. Важным следствием образования ступенчатых разрывов является то, что фрагменты, получающиеся в результате обработки рестриктазой EcoRl двух разных ДНК (например, ДНК Е. coli и дрожжей), могут соединяться с помощью «липких концов». При этом различия, затрагивающие двухцепочечные спиральные сегменты указанных ДНК, на процесс соединения не влияют.

Такое специфическое действие, приводящее к образованию определенных участков (сайтов) рестрикции, определило повышенный интерес к рестриктазам типа II, которые стали важнейшим инструментом генетической инженерии.

Рестриктазы типа II, разрезающие палиндромные последовательности с образованием «липких концов»:

Рестриктазы типа II, разрезающие палиндромные последовательности с образованием «тупых концов»:

В последние годы среди рестриктаз типа II открыты ферменты, распознающие непалиндромные структуры и расщепляющие ДНК на строго фиксированном расстоянии от участка узнавания с образованием как «тупых», так и «липких концов». Их относят к подклассу II S (от англ, shift — перестановка, сдвиг).

Рестриктазы типа II S, разрезающие цепи ДНК на определенном расстоянии от узнаваемой последовательности:

К 1995 г. было известно 2 400 рестриктаз типа II, имеющих 188 специфических сайтов рестрикции. Выделенные из разных источников, но имеющие одинаковую специфичность рестриктазы стали называть изошимеразами. Однако изошимеры не обязательно делают разрез в одном и том же месте, например Хта и Smal.

Механизм отсчета таков, что места гидролиза разных цепей смещены одно относительно другого на один нуклеотид. В результате образуются фрагменты ДНК с одноцепочечными выступами длиной только в один нуклеотидный остаток.

Рестриктазы типа III сходны с ферментами типа I. Они узнают непалиндромные последовательности длиной 5−6 нуклеотидных пар и расщепляют ДНК в стороне от сайтов узнавания на расстоянии 24−25 пар нуклеотидов.

В генетической инженерии помимо рестриктаз используют и другие ферменты.

Получение рекомбинантных молекул ДНК включает объединение in vitro сегментов ДНК из различных источников. Для этого в генетической инженерии наиболее часто используются ДНК-лигазы, способные сшивать фрагменты ДНК как с «липкими», так и с «тупыми концами».

В 1958 г. А. Корнбергом и его сотрудниками была открыта ДНКполимераза Е. coli. Этот фермент, называемый сейчас ДНК-полимеразой I, состоит из одной полипептидной цепи и имеет трехдоменную структуру. Каждый домен обладает определенной ферментативной активностью: //-концевой домен 5'—>3' - экзонукпеазной; С-концевой домен 5'—>3' - полимеразной (нуклеотидилтрансферазной), а средний домен 3'—>5' - экзонуклеазной. //-концевой домен может быть отщеплен с использованием протеаз (трипсина и др.); остающаяся часть молекулы — фрагмент Кленова — сохраняет присущую ей каталитическую активность.

Реакции, катализируемые ДНК-полимеразой I, нашли широкое применение. Например, часто используется способность ДНК-полимеразы I катализировать одновременно как полимеризацию, так и 5'—"З'-экзонуклеазное расщепление. Фермент, выступая в роли экзонуклеазы, осуществляет деградацию цепи в 5'—"З'-направлении, начиная с 5-конца одноцепочечной бреши (ника-разрыва) в двухцепочечной ДНК, а выступая в роли полимеразы, восстанавливает цепь путем последовательного присоединения мононуклеотидных остатков к свободной З'-гидроксильной группе на другом конце бреши. Собственно синтеза ДНК не происходит: брешь лишь перемещается вдоль цепи, чем и объясняется название этого процесса — никтрансляция.

Проводя ник-трансляцию в присутствии ³²Р-меченых нуклеотидов, в качестве субстратов получают меченые фрагменты ДНК с высокой удельной активностью. Эта реакция in vivo играет важную роль в репарации поврежденной ДНК.

В 1964 г. Г. Темин выдвинул гипотезу о существовании специфических для РНК-содержащих ретровирусов ферментов, способных синтезировать ДНК на матрице РНК. В 1970 г. Г. Темин и С. Мизутани и независимо от них Д. Балтимор открыли этот фермент у вируса саркомы Рауса. Эта РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратной транскриптазы, или ревертазы. Наиболее изучена ревертаза вирусов птицы, которая состоит из 2 субъединиц — а и р — и обладает по крайней мере тремя активностями: ДНК-полимеразной (может использовать в качестве матрицы как РНК, так и ДНК); активностью РНКазы Н (гидролизует РНК в составе гибрида РНК: ДНК, но не атакует свободную РНК); ДНК-эндонуклеазной. Первые две активности используются для синтеза ДНК, комплементарной вирусной РНК, которая затем интегрируется в геном клетки-хозяина. Эндонуклеазная активность, очевидно, используется для внесения разрывов в цепи ДНК-хозяина. Установлено, что Р-субъединицы данной ревертазы обладают всеми тремя активностями, а-субъединица — только активностями ДНК-полимеразы и РНКазы Н. Затравкой (праймером) для полимеразной реакции могут служить небольшие участки одноцепочечных молекул ДНК или РНК (а также тРНК).

В генетической инженерии ревертаза широко используется для целенаправленного синтеза на матричных РНК комплементарных молекул ДНК (кДНК). Для повышения эффективности этой процедуры дополнительно применяют и другие ферменты (рис. 15.1).

Рис. 15.1. Схема получения кДНК с использованием ревертазы вируса птичьего миелобластоза и трех дополнительных ферментов: поли (А)-полимеразы, фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и нуклсазы Я (разрушает характерную шпильку в молекуле кДНК, которую образует ревертаза).

Важное значение в экспериментах с рекомбинантными ДНК имеет поли (А)-полимераза, которая присоединяет нуклеотидные остатки к З'-концу цепи без участия матрицы. Поли (А)-полимераза выполняет высокоспециализированную функцию в экспериментах с рекомбинантными ДНК: ее используют для присоединения поли (А)-концов к молекулам РНК при синтезе кДНК.