Современное промышленное получение антибиотиков

Современное промышленное получение антибиотиков — это сложная многоступенчатая биотехнологическая схема, состоящая из ряда последовательных стадий (рис. 6.14):

• 1) стадия биосинтеза (образования) антибиотика — основная биологическая стадия процесса получения антибиотика. Необходимо создание оптимальных условий для развития продуцента и максимально возможного биосинтеза антибиотика;
• 2) стадия предварительной обработки культуральной жидкости, клеток (мицелия) микроорганизма и фильтрации (отделение культуральной жидкости от биомассы продуцента). Определяется составом среды, характером роста продуцента, местом накопления биологически активного соединения (в культуральной жидкости или внутриклеточно);
• 3) стадия выделения и очистки антибиотика. В качестве основных методов применяют экстракцию, осаждение, сорбцию на ионообменных материалах, упаривание, сушку;
• 4) стадия получения готовой продукции, изготовления лекарственных форм, расфасовки.

Для максимального выхода антибиотика при культивировании продуцента необходим комплекс мер, включающий подбор питательных сред, высокопродуктивных штаммов микроорганизмов и режимов их культивирования.

Рис. 6.14. Схема производства антибиотиков в процессе микробного биосинтеза (по Н. С. Егорову, 1994).

Микроорганизмы, производящие различные метаболиты, в том числе и антибиотики, вначале проходят стадию быстрого роста (тропофазу), во время которой синтез этих веществ незначителен. По мере замедления роста из-за истощения одного или нескольких необходимых питательных веществ в культуральной среде микроорганизм переходит в идиофазу; именно в этот период синтезируются идиолиты.

Эти особенности культурального роста необходимо учитывать в производственном процессе. Например, в случае антибиотиков большинство микроорганизмов в стадии тропофазы чувствительны к собственным антибиотикам, а во время идиофазы становятся устойчивыми к ним. Чтобы уберечь микроорганизмы, продуцирующие антибиотики, от самоуничтожения, важно быстро достичь идиофазы и затем культивировать микроорганизмы в этой фазе. Это достигается путем варьирования режимов культивирования и состава питательной среды на стадиях быстрого и медленного роста.

Новые антибиотики с уникальными свойствами и специфичностью можно получить путем генно-инженерных манипуляций с генами, участвующими в биосинтезе уже известных антибиотиков. Большой эффект здесь может дать технология рекомбинантных ДНК: с ее помощью можно создавать новые антибиотики с уникальной структурой, оказывающие более мощное действие на определенные микроорганизмы и обладающие минимальными побочными эффектами. Генноинженерные подходы можно использовать для увеличения выхода антибиотиков и снижения стоимости их производства.

Большинство исследований было сосредоточено на пенициллинах и цефалоспоринах, структура которых включает четырехчленное (3-лактамное кольцо. Добавление к (3-лактамному кольцу метоксильной (СН₃0)-группы привело к появлению цефамицинов, близких к цефалоспоринам и эффективных как против грамотрицательных, так и против пенициллиноустойчивых микробов. Полусинтез состоит в замене химическим путем одной боковой цепи (3-лактамного кольца на другую в полученной ферментацией молекуле. Устойчивость к пенициллинам и цефалоспоринам связана с наличием ферментов, так называемых (3-лактамаз, которые широко распространены среди бактерий, актиномицетов, цианобактерий и дрожжей. Так как гены, кодирующие эти ферменты, находятся в составе плазмид, устойчивость может передаваться при переносе плазмид от одного бактериального штамма к другому.

Исследователи фирмы «Мерк, Шарп и Доум» открыли новый класс (3-лактамных антибиотиков — тиенамицины, — продуцируемые Streptomyces cattleya. Тиенамицины чрезвычайно эффективны против грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также способны ингибировать (3-лактамазы, что значительно повышает возможности этих антибиотиков. К ингибиторам (3-лактамаз относятся также клавулановая и оливановая кислоты, идентифицированные исследователями английской фармацевтической компании «Бичем». Компания выпустила новый антибиотик — аугментин, — который представляет собой комбинацию (3-лактамного антибиотика амоксициллина и клавулановой кислоты.

Синтез антибиотика является результатом действия 10—30 генов, поэтому практически невозможно обнаружить отдельные спонтанные мутации, которые могли бы повысить его выход. В промышленных штаммах Penicillium chrysogenum или Streptomyces auerofaclens выход пенициллина или тетрациклина удалось повысить с нескольких миллиграммов на литр (штамм дикого типа) до 20 г/л и более. Эти высокопродуктивные штаммы были получены в результате последовательных циклов мутагенеза и селекции.

В результате мутаций появились новые вторичные метаболиты, в том числе 6-диметилхлортетрациклин и 6-диметилтетрациклин. Определенные мутанты, так называемые идиотрофы, способны синтезировать только половину молекулы антибиотика, а среда должна быть обогащена другой ее половиной. Такая форма мутационного бйосинтеза привела к открытию новых производных антибиотиков, в том числе принадлежащих к аминоциклитольной группе.

Создание новых и совершенствование существующих технологий получения антибиотиков, разработка экологически чистых безотходных технологий получения высококачественных препаратов — важнейшая задача современной биотехнологии. В основном антибиотики применяют для борьбы с болезнями человека, животных и растений, как стимуляторы роста животных, при консервировании продуктов, в научных исследованиях (в биохимии, молекулярной биологии, генетике, онкологии).

Традиционно антибактериальные препараты подразделяют на:

• — природные (собственно антибиотики, например пенициллин);
• — полусинтетические (продукты модификации природных молекул, например амоксициллин, цефазолин);
• — синтетические (например, сульфаниламиды, нитрофураны).

Антибиотики используют для предотвращения и лечения воспалительных процессов, вызванных бактериальной микрофлорой. Они избирательно угнетают жизнедеятельность микроорганизмов. Под избирательным действием понимают активность только в отношении определенных родов и видов микроорганизмов при сохранении жизнеспособности клеток хозяина.

Антибиотики представляют собой самую многочисленную группу лекарственных средств. Так, в России в настоящее время используется 30 различных групп антибиотиков, а число препаратов приближается к 200. Ежегодно во всем мире производится 100 тыс. т антибиотиков на сумму примерно 5 млрд долларов, причем более 100 млрд долларов приходится на долю антибиотиков, добавляемых в корм скоту в качестве добавок или ускорителей роста.

Все антибиотики, несмотря на различия химической структуры и механизма действия, объединяет ряд уникальных качеств.

Во-первых, уникальность антибиотиков заключается в том, что, в отличие от большинства других лекарственных средств, их мишеньрецептор находится не в тканях человека, а в клетке микроорганизма.

Во-вторых, активность антибиотиков не является постоянной, а снижается со временем, что обусловлено формированием лекарственной устойчивости (резистентности). Антибиотикорезистентность — неизбежное биологическое явление, и предотвратить ее практически невозможно.

В-третьих, антибиотикорезистентные микроорганизмы представляют опасность не только для пациента, у которого они были выделены, но и для многих других людей, даже разделенных временем и пространством. Поэтому борьба с антибиотикорезистентностью в настоящее время приобрела глобальные масштабы.

В течение многих лет антибиотики используют как стимуляторы роста сельскохозяйственных животных и птиц, как средство борьбы с заболеваниями растений и посторонней микрофлорой в ряде бродильных производств, как консерванты пищевых продуктов. Механизм стимулирующего действия антибиотиков также не до конца выяснен. Предполагают, что стимулирующий эффект низких концентраций антибиотиков на организм животного связан с двумя факторами:

• — воздействием на микрофлору кишечника;
• — непосредственным влиянием на организм животного.

В первом случае антибиотики снижают число вредных и увеличивают количество полезных для организма микроорганизмов, во втором — снижают pH содержимого кишечника, уменьшают поверхностное натяжение клеток организма, что способствует ускорению их деления. Кроме того, антибиотики увеличивают количество ростовых гормонов, улучшают приспособляемость организма к неблагоприятным условиям и т. д.

Кормовые антибиотики применяют в виде неочищенных препаратов, представляющих собой высушенную массу продуцента, содержащую, помимо антибиотика, аминокислоты, ферменты, витамины группы В и другие биологически активные вещества. Все производимые кормовые антибиотики:

• — не используются в терапевтических целях и не вызывают перекрестной резистентности бактерий к антибиотикам, применяемым в медицине;
• — практически не всасываются в кровь из пищеварительного тракта;
• — не меняют своей структуры в организме;
• — не обладают антигенной природой, способствующей возникновению аллергии.

В настоящее время производится несколько видов кормовых антибиотиков: препараты на основе хлортетрациклина (биовит, кормовой биомицин), бацитрацин, гризин, гигромицин Б и др. Из этих препаратов только бацитрацин представляет собой высушенную культуральную жидкость, полученную в результате глубинного выращивания Bacillus licheniformis. Остальные антибиотики являются продуктами жизнедеятельности разных видов Actinomyces.

Антибиотики используют и как средство борьбы с различными фитопатогенами. Действие антибиотика сводится к замедлению роста и гибели фитопатогенных микроорганизмов, содержащихся в семенах и вегетативных органах растений. К таким антибиотикам относятся фитобактериомицин, трихотецин, полимицин.

Применение антибиотиков в пищевой промышленности позволяет снизить длительность термообработки продуктов питания при их консервировании. Используемые антибиотики воздействуют на клостридиальные и термофильные бактерии, устойчивые к нагреванию. Наиболее эффективным признан низин, который практически не токсичен для человека и позволяет вдвое снизить время термообработки.