Методы идентификации вирусов

Реакция нетрализации

Определение типа вируса (его идентификация) основано на нейтрализации биологической активности вируса с помощью типоспецифических сывороток. Конечный результат ее может быть установлен на основании следующих признаков:

нейтрализация цитопатического действия: в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на неё), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1−2 дня в неё вносят известный цитопатогенный вирус. При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим антителам примененной сыворотки;

нейтрализация реакции гемадсорбции;

изменение проявления цветной пробы;

задержка (торможение) реакции гемагглютинации: смешивают культуральную среду, содержащую возбудитель, с известной коммерческой антисывороткой и вносят в культуру клеток. После инкубации определяют способность культуры к гемагглютинации и при её отсутствии делают заключение о несоответствии вируса антисыворотке.

нейтрализация в опытах на животных.

Таким образом РН (реакция нейтрализации) основана на подавлении соответствующей реакции, феномена, развития инфекционного процесса после внесения в культуру или введения в организм животного смеси вируса со специфичными AT, содержащимися в диагностической сыворотке.

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) — позволяет определить наличия инфекционного агента в присланном материале, в кратчайшие сроки. Материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК возбудителя.

ПЦР — это метод ферментативного получения большого количества копий (амплификации) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити). При этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК, поскольку только этот участок соответствует заданным условиям. И только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Для протекания этой реакции необходимы три ключевых компонента:

• — служащая матрицей молекула ДНК, содержащая исследуемый фрагмент;
• — ДНК-полимераза (фермент для производства копий ДНК) и нуклеотиды, используемые ДНК-полимеразой для синтеза ДНК.
• — два праймера ПЦР — два коротких сегмента однонитевой нуклеиновой кислоты, комплементарных началу исследуемого фрагмента ДНК (обычно это последовательности из 15−20 оснований). Присоединяясь к этому фрагменту, праймеры позволяют запустить синтез ДНК, поскольку ДНК-полимераза способна только добавлять звенья. Праймеры можно заказать в биохимической компании или синтезировать с помощью автоматизированного аппарата, задав программу требуемой последовательности нуклеотидов.

Метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, повторяющуюся много раз и столько, сколько это необходимо для исследования.

Иммуноферментный метод (ИФА). В иммуноферметных методах антиген вируса взаимодействует с антителом диагностической сыворотки, при этом один из реагентов связан с энзимом. Для выявления этой энзимной метки необходимый соответствующий субстрат (хромоген), который реагирует с адсорбированным, например на молекуле антитела, ферментом, изменяя окраску реагирующей смеси.

Для такой метки широко используется фермент — пероксидаза хрена, которая в зависимости от субстрата дает разноцветные продукты реакции.

Иммуноблотинг [от англ. blot, пятно] - метод идентификации антигенов Аг (или антител AT — иммуноглобулины) с помощью соответствующих известных сывороток (или Аг). На практике применяют для идентификации антигенов ВИЧ. Первоначально электрофорезом в полиакриловом геле выделяют Аг вируса (на практике эту процедуру не проводят, а используют коммерческий реагент). Затем на полосы преципитата накладывают носитель (нитроцеллюлозную плёнку или активированную бумагу) и продолжают электрофорез. После чего на плёнку наносят сыворотку пациента и инкубируют (рисунок 19).

После отмывания несвязавшихся AT (при их наличии) проводят ИФА — на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам (Ig) человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов Аг-АТ-антисыворотка к Ig на носителе появляются окрашенные пятна (рисунок 20).

Рисунок 19 — Схема иммуноблотинга.

Рисунок 20 — Результат иммуноблотинга.

Вопросы для самоконтроля

• 1 Назовите основные принципы классификации вирусов.
• 2 Какие этапы включают в себя лабораторные исследования при идентификации вирусов и диагностике вирусных инфекций?
• 3 Какие биологические модели используются для выделения и культивирования вирусов человека и животных?
• 4 Как происходит заражение куриных эмбрионов в лабораторных условиях?
• 5 Какие методы получения культуры клеток вы знаете?
• 6 Как проводят идикацию вирусов в курином эмбрионе и на лабораторных животных?
• 7 Какие существуют методы индикации вирусов на культуре клеток?
• 8 Как внешне может проявиться патология клеток в результате инфицирования вирусом?
• 9 В чем заключается назначение и сущность реакций нейтрализации вирусов?
• 10 Назовите способы постановки реакций нейтрализации вирусов.
• 11 В чем заключается суть ИФА и иммуноблотинга?
• 12 В чем заключается принцип полимеразной цепной реакции?

Лабораторное занятие 2 Специальные методы выделения и изучения вирусов

Цель занятия: изучить принципы и методы выделения, культивирования и идентификации вирусов.

Материалы и оборудование: 1) световой микроскоп; 2) препараты для микроскопии (или фотографии препаратов) культур клеток неинфицированных вирусами и инфицированных вирусами а) с крупноклеточной дегенерацией клеток, б) с мелкоклеточной дегенерацией клеток, в) с образованием симпластов, г) с развитием очагов клеточной пролиферации, д) с внутриклеточными включениями; 4) демонстрационная планшетка с положительной реакцией гемагглютинации; 5) фотография препарата или препарат для микроскопии с положительной реакцией гемадсорбции; 6) демонстрационный препарат инфицированной вирусами культуры клеток с феноменом бляшкообразования; 7) штатив с пробирки, демонстрирующими цветную реакцию Солка; 8) демонстрационные варианты постановки реакции нейтрализации вирусов.

Задание 1: проведите индикацию вирусов в культурах клеток по цитопатическому действию.

Ход работы.

• 1) Рассмотрите фотографии или промикроскопируйте в световой микроскоп при большом увеличении препараты неинфицированных и инфицированных вирусами культур клеток с разными типами цитопатического действия: а) с крупноклеточной дегенерацией клеток, б) с мелкоклеточной дегенерацией клеток, в) с образованием симпластов; г) с развитием очагов клеточной пролиферации.
• 2) Определите какой тип цитопатического действия вы обнаружили на препаратах культур клеток инфицированных вирусами.
• 3) В протоколе занятия назовите и нарисуйте типы цитопатического действия вирусов.

Задание 2: проведите индикацию вирусов в культурах клеток по наличию внутриклеточных включений.

Ход работы.

• 1) Рассмотрите фотографии или промикроскопируйте в световой микроскоп при большом увеличении препараты инфицированных вирусами культур клеток с внутриклеточными включениями. Обратите внимание на расположение включений в клетке (в цитоплазме или в ядре) и их размеры и форму.
• 2) В протоколе занятий сделайте рисунки рассмотренных препаратов и укажите на них внутриклеточные включения.

Задание 3: проведите индикацию вирусов в культурах клеток с использованием реакции гемагглютинации и гемадсорбции.

Ход работы.

• 1) Изучите механизм реакции гемагглютинации и гемадсорбции. В протоколе занятия опишите сущность этих реакций.
• 2) Рассмотрите демонстрационный материал (планшетка с положительной реакцией агглютинации и препарат для микроскопии с реакцией гемадсорбции).
• 3) В протоколе занятия сделайте рисунки рассматриваемых реакций.

Задание 4: проведите индикацию вирусов в культурах клеток с использованием феномена бляшкообразования.

Ход работы.

• 1) Изучите метод бляшек. В протоколе занятия опишите сущность феномена бляшкообразования.
• 2) Рассмотрите демонстрационный материал с феноменом бляшкообразования. Обратите внимание на цвет питательной среды и наличие в ней бляшек (негативных колоний).
• 3) В протоколе занятия сделайте рисунок культуры клеток с феноменом бляшкообразования.

Задание 5: проведите индикацию вирусов в культуре клеток с использованием цветной реакции Солка.

Ход работы.

• 1) Изучите методику постановки цветной реакции Солка. В протоколе занятия кратко опишите сущность этой реакции.
• 2) Рассмотрите демонстрацию результатов цветной реакции Солка.
• 3) В протоколе занятия отразите результаты реакции на рисунке и сделайте вывод о наличии вируса в культуре клеток.

Задание 6: проведите идентификацию вируса с использование реакции нейтрализации.

Ход работы.

1) Изучите методику постановки реакций нейтрализации вирусов. В протоколе занятия кратко опишите сущность этой реакции.

2) Рассмотрите демонстрационный материал с постановкой одного из вариантов реакции нейтрализации.

3) В протоколе занятия укажите продемонстрированный вам вариант реакции нейтрализации и нарисуйте схему постановки этого варианта реакции.