Метод электронного парамагнитного резонанса

Метод электронного парамагнитного резонанса является основным методом для изучения парамагнитных частиц. К парамагнитным частицам, имеющим важное биологическое значение, относятся два основных типа — это свободные радикалы и комплексы металлов переменной валентности (таких, как Fe, Cu, Co, Ni, Mn).

Метод электронного парамагнитного резонанса был открыт в 1944 г. Е. К. Завойским при исследовании взаимодействия электромагнитного излучения микроволнового диапазона с солями металлов.

В основе метода ЭПР лежит поглощение электромагнитного излучения радиодиапазона неспаренными электронами, находящимися в магнитном поле.

Метод ЭПР позволяет нам изучать свойства парамагнитных центров посредством регистрации спектров поглощения электромагнитного излучения этими частицами. Зная характеристики спектров, можно судить о свойствах парамагнитных частиц.

К основным характеристикам спектров относятся амплитуда, ширина линии, g-фактор и сверхтонкая структура спектров.

Применение спиновых меток Спиновые метки — химически стабильные парамагнитные молекулы, которые используются в качестве молекулярных зондов для изучения структуры и молекулярной подвижности различных физико-химических и биологических систем. Суть метода спиновых меток заключается в следующем. В исследуемую систему вводят в качестве спиновых зондов парамагнитные молекулы, которые дают характерные сигналы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Сигналы ЭПР спиновых меток зависят от их молекулярной подвижности и физико-химических свойств ближайшего окружения. Поэтому, наблюдая за сигналами ЭПР молекулярных зондов, можно изучать структурные характеристики исследуемой системы и динамику происходящих в ней молекулярных процессов. Термин «спиновые метки» происходит от английского слова «spin» (веретено, волчок), которым называют собственный механический момент электрона. Электрон, как известно из квантовой механики, обладает механическим моментом, равным величине «/2, и собственным магнитным моментом, где «- постоянная Планка, e и m — заряд и масса электрона, с — скорость света. Парамагнитные свойства молекулярных зондов определяются наличием в них неспаренного электрона, обладающего спином и являющегося источником сигнала ЭПР. В качестве спиновых меток обычно используют стабильные нитроксильные радикалы. Все молекулы спиновых меток, несмотря на разнообразие их химического строения, как правило, содержат одинаковый парамагнитный фрагмент — химически стабильный нитроксильный радикал (>N-OJ). На этом радикале локализован неспаренный электрон, служащий источником сигнала ЭПР. Конкретный выбор спиновых меток определяется задачей исследования. Так, например, для того чтобы с помощью спиновых меток следить за конформационными перестройками белков, молекулы метки обычно «пришивают» к определенным участкам белка. В этом случае спиновая метка должна содержать специальную реакционную группу, которая может образовать ковалентную химическую связь с аминокислотными остатками молекулы белка. Для изучения свойств искусственных и биологических мембран обычно используют жирорастворимые спиновые метки, способные встраиваться в липидный слой мембраны.

Явление электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) заключается в резонансном поглощении электромагнитного излучения в диапазоне радиочастот веществами, помещенными в постоянное магнитное поле, и обусловленное квантовыми переходами между энергетическими подуровнями, связанными с наличием магнитного момента у электронных систем. Также ЭПР называют электронный спиновый резонанс (ЭСР), магнитный спиновый резонанс (МСР) и, среди специалистов, работающих с магнитно-упорядоченными системами, ферромагнитный резонанс (ФМР).

Явление ЭПР можно наблюдать на:

• * атомах и молекулах, которые на своих орбиталях имеют нечетное количество электронов — H, N, NO2 и др.;
• * химических элементах в различных зарядовых состояниях, у которых не все электроны на внешних орбиталях участвуют в образовании химической связи — прежде всего, это dи f-элементы;
• * свободных радикалах — метильный радикал, нитроксильные радикалы и др.;
• * электронных и дырочных дефектах, стабилизирующихся в матрице веществ, — O-, O2-, CO2-, CO23-, CO3-, CO33- и многих других;
• * молекулах с четным числом электронов, парамагнетизм которых обусловлен квантовыми явлениями распределения электронов по молекулярным орбиталям — О2;
• * наночастицах-суперпарамагнетиках, образующихся при растворении или в сплавах, обладающих коллективным магнитным моментом, которые ведут себя подобно электронному газу.

Структура и свойства спектров ЭПР Поведение магнитных моментов в магнитном поле зависит от различных взаимодействий неспаренных электронов, как между собой, так и с ближайшим окружением. Важнейшими из них считаются спин-спиновые и спин-орбитальные взаимодействия, взаимодействия между неспаренными электронами и ядрами, на которых они локализуются (сверхтонкие взаимодействия), взаимодействия с электростатическим потенциалом, создаваемым ионами ближайшего окружения в месте локализации неспаренных электронов и другие. Большинство перечисленных взаимодействий приводит к закономерному расщеплению линий. В общем случае спектр ЭПР парамагнитного центра является многокомпонентным. Представление об иерархии основных расщеплений можно получить из следующей схемы (определения используемых обозначений даны ниже):

Основными характеристиками ЭПР-спектра парамагнитного центра (ПЦ) являются:

• * количество линий в спектре ЭПР конкретного ПЦ и их относительные интенсивности.
• * Тонкая структура (ТС). Число линий ТС определяется величиной спина S ПЦ и локальной симметрией электростатического поля ближайшего окружения, а относительные интегральные интенсивности определяются квантовым числом mS (величина проекции спина на направление магнитного поля). В кристаллах расстояние между линиями ТС зависит от величины потенциала кристаллического поля и его симметрии.
• * Сверхтонкая структура (СТС). Линии СТС от конкретного изотопа имеют приблизительно одинаковую интегральную интенсивность и практически эквидистантны. Если ядро ПЦ имеет несколько изотопов, то каждый изотоп дает свой набор линий СТС. Их количество определяется спином I ядра изотопа, около которого локализован неспаренный электрон. Относительные интенсивности линий СТС от различных изотопов ПЦ пропорциональны естественной распространенности этих изотопов в образце, а расстояние между линиями СТС зависит от величины магнитного момента ядра конкретного изотопа, константы сверхтонкого взаимодействия и степени делокализации неспаренных электронов на этом ядре.
• * Суперсверхтонкая структура (ССТС). Число линий ССТС зависит от числа nл эквивалентных лигандов, с которыми взаимодействует неспаренная спиновая плотность и величины ядерного спина Iл их изотопов. Характерным признаком таких линий также является распределение их интегральных интенсивностей, которое в случае Iл = ½ подчиняется закону биномиального распределения с показателем степени nл. Расстояние между линиями ССТС зависит от величины магнитного момента ядер, константы сверхтонкого взаимодействия и степени локализации неспаренных электронов на этих ядрах.
• * спектроскопические характеристики линии.

Особенностью спектров ЭПР является форма их записи. По многим причинам спектр ЭПР записывается не в виде линий поглощения, а как производная от этих линий. Поэтому, в ЭПР-спектроскопии принята несколько иная, отличная от общепринятой, терминология для обозначения параметров линий.

Линия ЭПР поглощения и ее первая производная: 1- гауссова форма; 2- лоренцева форма.

• * Истинная линия — д-функция, но с учетом релаксационных процессов имеет форму Лоренца;
• * Линия — отражает вероятность процесса резонансного поглощения электромагнитного излучения ПЦ и определяется процессами, в которых участвуют спины;
• * Форма линии — отражает закон распределения вероятности резонансных переходов. Поскольку, в первом приближении, отклонения от резонансных условий носят случайный характер, форма линий в магниторазбавленных матрицах имеет гауссову форму. Наличие дополнительно обменных спин-спиновых взаимодействий приводит к лоренцевой форме линии. В общем случае форма линии описывается смешанным законом;
• * Ширина линии — ДВmax — cоответствует расстоянию по полю между экстремумами на кривой линии;
• * Амплитуда линии — Imax — соответствует по шкале амплитуды сигнала расстоянию между экстремумами на кривой линии;
• * Интенсивность — I0 — значение вероятности в точке МАХ на кривой поглощения, вычисляется при интегрировании по контуру линии записи;
• * Интегральная интенсивность — площадь под кривой поглощения, пропорциональна количеству парамагнитных центров в образце и вычисляется путем двойного интегрирования линии записи, сначала по контуру, затем по полю;
• * Положение линии — В0 — соответствует пересечению контура производной dI/dB с нулевой линией (линией тренда);
• * положение линий ЭПР в спектре.

Согласно выражению hн = gвB, определяющему условия резонансного поглощения для ПЦ со спином S = ½, положение линии электронного парамагнитного резонанса можно охарактеризовать значением g-фактора (аналог фактора спектроскопического расщепления Ланде). Величина g-фактора определяется как отношение частоты н, на которой проводилось измерение спектра к величине магнитной индукции В0, при которой наблюдался максимум эффекта. Следует отметить, что для парамагнитных центров g-фактор характеризует ПЦ как целое, т. е. не отдельную линию в спектре ЭПР, а всю совокупность линий, обусловленных исследуемым ПЦ.

В ЭПР экспериментах фиксируется энергия электромагнитного кванта, то есть частота н, а магнитное поле В может изменяться в широких пределах. Выделяются некоторые, довольно узкие, диапазоны СВЧ-частот, в которых работают спектрометры.