Люминесцентная микроскопия. 
Фотохимические превращения ДНК. 
Люминесцентные метки и зонды и их применение в медицине

Люминесцентная микроскопия — оптическое исследование микрообъектов, окрашенных специальными красителями (флюорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами. Для люминесцентной микроскопии применяются специальные оптические устройства и микроскопы, основной частью которых является источник ультрафиолетовых лучей и система фильтров к нему.

Флюорохромы, как правило, флюоресцируют по-разному в зависимости от химического состава структур, с которыми они взаимодействуют. Некоторые из них обладают сродством к определенным клеточным структурам. Например, акридиновый оранжевый краситель окрашивает нуклеопротеиды клетки, аурамин — воскоподобное вещество, содержащееся в микобактериях. Некоторые микрообъекты не требуют предварительной окраски флюорохромами и изучаются с помощью люминесцентной микроскопии без окраски. См. также Люминесцентный анализ, Люминесценция.

Люминесцентная микроскопия (флюоресцентная микроскопия) — специальный вид микроскопирования, основанный на использовании собственной (первичной) или наведенной (вторичной) фотолюминесценции микроскопических объектов. Видимая люминесценция (см.) препарата возбуждается либо сине-фиолетовым светом, либо ультрафиолетовыми лучами.

Люминесцентный микроскоп в принципе — обычный биологический микроскоп, снабженный двумя светофильтрами: один пропускает только возбуждающие синеили ультрафиолетовые лучи (его помещают перед источником света), другой поглощает эти лучи и пропускает только более длинноволновый свет люминесценции препарата (его устанавливают в тубусе или на окуляре микроскопа). Источниками света служат ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого давления (типа ДРП1) или лампы накаливания точечного типа. Яркое цветное свечение объектов на темном фоне обеспечивает высокий контраст. Оптико-механическая промышленность выпускает специальные люминесцентные микроскопы и отдельные осветители.

Лишь немногие биологически значимые вещества имеют выраженную собственную люминесценцию в видимой области спектра. К ним относятся некоторые пигменты (хлорофилл, порфирины, липохромы), витамины, А и В2, алкалоиды (берберин, хинин и др.), антибиотики (тетрациклины и др.), химиотерапевтические и токсические вещества. Проникновение этих веществ в органы и клетки, их распределение и превращения могут быть прослежены при помощи прижизненной люминесцентной микроскопии. Чаще в люминесцентной микроскопии используют люминесцентную «окраску» специальными веществами (флюорохромами), избирательно придающими тонким структурам клетки и тканей способность люминесцировать (люминесцентная цитохимия). Так, например, флюорохром акридиновый оранжевый применяют для контрастирования ядерных структур, выявления нуклеиновых кислот, мукополисахаридов, для обнаружения микробов и крупных вирусов, для цитодиагностики, в том числе распознавания в мазках раковых клеток; аурамин 00 служит для выявления кислотоустойчивых бактерий (туберкулеза, проказы), риккетсий и некоторых вирусов; примулин — для флюорохромирования элементарных телец вирусов и различения живых и мертвых клеток; фосфин ЗК, нильский голубой и бензпирен — для локализации липидов в клетках.

Особое значение в люминесцентной микроскопии придается люминесцентно-иммунологическим методам [Куне (A. Coons) с сотр., 1942, 1950], основанным на применении люминесцентно меченных специфических сывороток (антител). Метчиком чаще служит флюорохром изотиоцианат флюоресцеина. Получаемый комплекс «антитело-флюорохром» позволяет быстро обнаруживать, идентифицировать и локализовать даже ничтожные количества соответствующих антигенов, в том числе вирусов, риккетсий, бактерий на фоне посторонней микрофлоры, а также выявлять специфические белки, ферменты, полисахариды в клетках и тканях. Наряду с визуальными наблюдениями и фотографированием в Л.м. все шире применяется объективная регистрация интенсивности, спектров и выхода люминесценции.

В СССР развивается новый вид Л. м.— так называемая ультрафиолетовая Л.м., при помощи которой исследуется собственная ультрафиолетовая невидимая в обычных условиях люминесценция объектов (Е. М. Брумберг), тонко отражающая особенности их физиологического состояния.

Люминесцентная микроскопия клеток и тканей При люминесцентной микроскопии можно изучать первичную (ткани и органы человека и животных имеют нерезкую белесую, голубую или синюю люминесценцию) и вторичную люминесценцию клеток и тканей. Изучение вторичной люминесценции живых и фиксированных клеток и тканей (после их «окраски» флюорохромами) получило широкое распространение. При изучении живых клеток флюоресцирующие вещества применяют в очень малых количествах, не вызывающих токсического действия. В цитологических исследованиях Л. м. применяют при диагностике злокачественных новообразований в соскобах, пунктатах, мокроте, промывных водах. Этот метод позволяет быстро получить ярко окрашенный препарат, в котором атипичные клетки выделяются ярким свечением, оттенками цвета и структурой. Л. м. применяется и в гистохимии. Использование акридинового оранжевого позволяет выявить нуклеиновые кислоты, при этом ДНК дает зеленую, а РНК — красную флюоресценцию. Тот же флюорохром в нефиксированных срезах помогает выявить мукополисахариды, а при модификации этого метода — муцины. Фосфин 3R, родамин В, бензпирен и др. выявляют в срезах липиды.

Люминесцентные зонды и метки. В медицине используется применение специальных флуоресцирующих молекул, добавляемых к исследуемым биологическим системам извне, в которых они распределяются в соответствии со своими свойствами. Примером использования флуоресцентных зондов является метод флюоресцентной ангиографии — контрастирование сосудов флуоресцеином и их последующее фотографирование. Этот краситель вводится внутривенно пациентам. Этот краситель не токсичен, обладает очень высоким квантовым выходом флуоресценции. Он разносится с током крови по всему организму и диффундирует в дерму и эпидермис. Флуоресцеин возбуждается невидимым длинноволновым ультрафиолетовым излучением. Люминесценция его наблюдается в видимом свете. Диагностическая значимость этого метода заключается в том, что по скорости появления флуоресценции (люминесценции) в поверхностных тканях судят об участках тела с пониженным кровообращением, в них флуоресцеин появляется позже, чем в участках тела с нормальным кровообращением. [3].

Применение люминесценции для аналитических целей включает широкую область использования ее для идентификации веществ, для обнаружения малых концентраций веществ; для контроля изменений, претерпеваемых веществом; для определения степени чистоты веществ. Широко применяются измерения люминесценции при изучении кинетики обычных химических реакций. Высокая чувствительность метода позволяет фиксировать малую степень превращения, а иногда по люминесценции промежуточных соединений становится возможным установить механизм химической реакции. Люминесцентные методы используются в биологии, в частности, для исследования структуры белков методом флуоресцентных зондов и меток.