Основные методы изучения реакций свободных радикалов

Как всегда в биохимии, для изучения реакций образования и удаления веществ прежде всего нужно располагать прямыми методами количественного анализа этих веществ. К сожалению, свободные радикалы обладают столь высокой реакционной способностью, что их невозможно изолировать, исследовать и количественно определять обычными биохимическими методами. Пожалуй, методы оценки свободных радикалов можно разделить на косвенные, к которым относятся методы анализа продуктов реакций, протекавших с участием свободных радикалов и ингибиторный анализ, и прямые, к которым можно отнести метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и, с некоторыми оговорками, метод хемилюминесценции. (см. таблицу 2).

Таблица 2. Методы изучения свободных радикалов и их реакций.

Непрямые биохимические методы

Большинство исследователей реакций свободных радикалов довольствуются косвенными методами, определяя первичные или вторичные продукты свободнорадикальных реакций, такие как коньюгированные диены или соединения, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой (см. например обзоры в книге [21]). Вторым широко-распространенным методом исследования свободнорадикальных реакций, а точнее — роли свободных радикалов в том или ином процессе, служит использование «перехватчиков» радикалов (в англоязычной литературе принят термин «scavanger»). Принцип такого ингибиторного анализа довольно прост: если какой-то процесс подавляется «перехватчиком», значит перехвтываемые радикалы участвовали в процессе. Наиболее плодотворным оказалось использование фермента супероксиддисмутазы (обычно в сочетании с каталазой), поскольку считается очевидным, что этот фермент удаляет супероксидные радикалы и только их. Менее очевидны выводы, сделанные на основе опытов с использованием «ловушек» липидных радикалов, таких как токоферол, поскольку не столь очевидно, что перехват радикалов является единственным результатов действия этих веществ.

Метод электронного парамагнитного резонанса

Хотя польза исследований, основанных на изучении молекулярных продуктов свободнорадикальных реакций и ингибиторного анализа, сомнений не вызывает, не следует пренебрегать возможностью прямого обнаружения свободнорадикальных реакций и непосредственного изучения изменения их концентрации в ходе исследуемого процесса. На сегодняшний день существует два прямых метода обнаружения радикалов: электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) и хемилюминесценция (ХЛ). Интересно, что судьбы этих методов в некотором смысле очень похожи. В химических системах дело обстояло еще сносно. Так, например, используя метод быстрого смешивания двух растворов при их непрерывном протоке, А. Н. Осипову и сотрудниками удалось наблюдать сигналы ЭПР липидных радикалов, образующихся при разложении гидроперекисей линолевой кислоты ионами Ce⁴⁺ и Fe²⁺, правда, довольно слабые, несмотря на огромные расходы реактивов [7]. Попытки непосредственно обнаружить методом ЭПР радикалы кислорода или липидов в биологических системах оказались неудачными, поскольку стационарные концентрации большинства радикалов, таких как радикалы кислорода или липидов, в биологических системах слишком малы. Успех пришел, однако, после разработки метода спиновых ловушек. Спиновые ловушки — это молекулы, которые при взаимодействии с нестабильными радикалами образуют стабильные нитроксильные радикалы так называемые спиновые аддукты, сигналы ЭПР которых затем измеряются с целью качественного и количественного анализа соответствующих радикалов (см. в частности работы, проведенные в нашей лаборатории [6,8−11,14,58]).

Метод хемилюминесценции

Довольно похожая ситуация сложилась и с применением хемилюминесценции. Реакции рекомбинации радикалов супероксида, гидроксила и липидных радикалов сопровождаются очень слабым свечением, которое первоначально было названо «сверхслабым свечением» [23] («ultra-weak luminescence») и которое следует называть вероятно собственной («intrinsic») или не активированной («non-enhanced») хемилюминесценцией (см. обзор [42]). Изучение этой хемилюминесценции внесло большой вклад в изучение процессов цепного (или перекисного) окисления липидов в биологических мембранах (см. обзоры [22,40,41,48]), но и тут низкая интенсивность сигнала стала одним из существенных препятствий в применении этого метода. В связи с этим получили широкое применение так называемые активаторы хемилюминесценции [49] (по-английски — enhancers, т. е. «усилители»). Наиболее известны химические активаторы, вступающие с определенными радикалами в реакции, сопровождающиеся свечением: это люцигенин, дающий свечение с радикалами супероксида, и люминол, дающий мощное свечение в присутствии радикалов гидроксила. Для изучения свободнорадикальных реакций при цепном окислении липидов нами был предложен целый ряд физических активаторов хемилюминесценции, таких как краситель родамин Ж [15,45], комплекс европия с тетрациклином [38,52,53] и некоторые лазерные красители, производные кумарина [17,28]. Физические активаторы (по-английски sensitizers — «сенсибилизаторы») не вступают в реакцию с радикалами, но увеличивают квантовый выход хемилюминесценции за счет переноса энергии электронного возбуждения от молекул-продуктов реакции на активатор [20].

В таблице 3 приведены некоторые активаторы хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов.

Таблица 3. Активаторы хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов.

* - отношение интенсивности хемилюминесценции в присутствии активатора к интенсивности в его отсутствие.

Изучение кинетики реакций

Реакции с участием свободных радикалов, в особенности реакции цепного окисления, отличаются большой сложностью и протекают через ряд последовательных стадий. В изучении механизма цепных реакций основную роль сыграло исследование кинетики процессов; при этом измерение кинетики хемилюминесценции позволяет непосредственно видеть изменение во времени концентрации радикалов, ведущих цепи окисления [1,22,40,48]. Параллельное измерение хемилюминесценции, окисления ионов двухвалентного железа и накопления продуктов реакции в суспензиях митохондрий [31,40,48,57] и фосфолипидных везикул (липосом) [17,37] позволило экспериментально определить константы скоростей основных реакций цепного окисления: инициирования, продолжения, разветвления и обрыва цепей [40,44]. Проверка правильности определения констант, а также и схемы самих реакций заключается в математическом моделировании кинетики реакций. Оно включает в себя три стадии [44]:

Составление упрощенной системы химических уравнений, описывающих процесс.

Составление системы дифференциальных уравнений, описывающих изменение во времени концентраций всех промежуточных и конечных продуктов реакции.

Решение системы дифференциальных уравнений методами численного интегрирования (с использованием компьютера) Построение кривых изменения во времени концентраций участников реакции и хемилюминесценции и сравнение этих кривых с экспериментальными.

Полученные результаты подтвердили схему реакций цепного окисления липидов [40,44], которую мы рассмотрим несколько позже.