Полипептидные антибиотики

Полипептидные антибиотики

1. Определение понятия полипептидные антибиотики

Имеется около 300 антибиотиков, которые можно считать результатом конденсации аминокислот с образованием пептидных связей. Они отличаются от нормальных белков тем, что 1) их молярная масса не превышает 3000; 2) в их состав входят необычные аминокислоты (30 аминокислоты и т. д.); 3) имеют тенденцию к циклизации и гиперциклизации.

При конденсации некоторых аминокислот образуются кольца (например, в случае цистеина — тиазольные кольца), и зачастую молекула представляет собой микроцикл.

Основной особенностью биогенеза полипептидных антибиотиков является то, что при их синтезе их используется специфический ферментный комплекс, хотя долгое время это положение подвергалось сомнению. Показано, что обычная белоксинтезирующая система, содержащая комплекс мРНК с рибосомами, не участвует в их синтезе. Первым аргументом в пользу этого положения послужило наличие в пептидных антибиотиках аминокислот, которые отличаются от обычных аминокислот, встречающихся в белках, а также не способность известных ингибиторов белкового синтеза подавлять биосинтез этих антибиотиков. Позже, когда некоторые из этих антибиотиков были синтезированы в бесклеточных системах, не содержащих ни рибосом, ни РНК, были получены более весомые доказательства. Системы синтеза in vitro позволили идентифицировать основные стадии процесса полимеризации.

1. Аминокислоты активизируются в реакции с АТР с образованием аминоациладенилатов.

2. Высокоэнергетическая связь между аминокислотой и фосфатом адениловой кислоты обеспечивает перенос аминокислоты на тиольные группы в сложной ферментной системе с образованием аминоацилтиоэфиров.

3. Ферментная система катализирует затем образование пептидной связи между карбоксильной группой аминокислоты и аминогруппой второй аминокислоты, используя энергию расщепления тиоэфирной связи. Цепь, образуемая таким путем, все время остается связанной сложной эфирной связью с тиольной группой, и к ней может присоединяться третья аминокислота, четвертая и т. д. до конца цепи.

Более детально этот процесс описан позже при рассмотрении синтеза грамицидина S.

Важно отметить, что данный механизм синтеза напоминает механизм полимеризации малонатных единиц при синтезе жирных кислот. Принципиальное различие состоит в том, что в системе синтеза полипептидов последовательность аминокислот контролируется, тогда как при синтезе жирных кислот все мономеры идентичны и такой контроль не нужен.

Описанные механизм синтеза объясняет, почему 1) пептидные антибиотики никогда не содержат больше 15 или 20 аминокислотных остатков, поскольку очень маловероятно, что ферментный комплекс может «узнать» большее число аминокислот, и 2) пептидные антибиотики часто образуются «семействами», компоненты которых различаются одним или несколькими аминокислотными остатками. Действительно, система узнавания различных аминокислот может ошибаться, а разные аминокислоты могут конкурировать за включение в одно и то же положение.

Очень часто после или во время образования цепи происходят и другие реакции. Это могут быть циклизация молекулы или ее части и модификация отдельных аминокислот. Например, D-аминокислоты, часто встречающиеся в полипептидах, обычно образуются из L-аминокислот, причем показано, что инверсия происходит после полимеризации. Одним из примеров значительной модификации трипептидной цепи служит биосинтез пенициллинов и цефалоспоринов, описанный ниже.

Вероятно, схожие механизма биосинтеза ответственны за биогенез пептолидов и депсипептидов — антибиотиков, отличающихся от полипептидов наличием вместо некоторых амидных связей сложноэфирных.

Среди изученных в химическом отношении антибиотиков этой группы наиболее распространены циклопептиды, состоящие из остатков Lи D-аминокислот. К ним относятся антибиотики, образуемые бактериями (тироцидины, грамицидины, бацитрацины, полимиксины, низины, бацилломицины и др.) и актиномицетами (этамицин, эхиномицины и др.).

Рисунок 1. Химическая формула полипептидных антибиотиков на примере Этамицина

2. Характеристика полипептидных антибиотиков

ТИРОТРИЦИН (TYROTHRICIN).

Тиротрицин впервые получен Дюбо в 1939 г. при развитии бактерии Bacillus brevis, выделенной из почвы. Продуцент тиротрицина — Bac. brevis — аэробная, спорообразующая палочка. Споры образуются по бациллярному типу и расположены обычно в центральной части бактериальной клетки. Бактерии благодаря перетрихиально расположенным жгутикам подвижны, окрашиваются по Грамму, разжижают желатин, гидролизируют крахмал. Оптимальная температура развития около 37⁰С.

Для получения антибиотика бактерии выращивались в течение 4−5 суток при 37⁰С на жидкой питательной среде (обычно мясопептонный бульон), разлитой тонким слоем в матрицы. В процессе развития культуры происходит образование антибиотика, который в небольшом количестве выделяется в окружающую среду, а основная масса тиротрицина находится в бактериальных клетках.

Затруднение выделения антибиотика из клетки связанно, по-видимому, с его химической природой.

Тиротрицин — полипептид с большим числом аминокислотных остатков, что затрудняет его диффузию через бактериальную оболочку, но, возможно, имеются и другие причины, удерживающие антибиотик внутри клетки.

При выделении антибиотика необходимо помнить, что большая часть его содержится в клетках бактерий, а следовательно, обрабатывать следует как культуральную жидкость, так и бактериальную массу.

Рисунок 2. Схема выделения тиротрицина

Культуральная жидкость вместе с бактериями подкисляется соляной кислотой до рН 4,5. При этом выпадает осадок, состоящий из бактериальных тел и антибиотика. Фильтрацией отделяют осадок от жидкости и подвергают обработке кислым спиртом в течение суток. За этот промежуток времени антибиотик извлекается из бактериальных клеток и переходит в спиртовой раствор. Спиртовой раствор отделяют от бактериальной массы. Спиртовой экстракт упаривают в вакууме и остаток переносят в раствор NaCl. Тиротрицин при этом выпадает в виде хлопьевидного осадка. «Свободный» антибиотик, т. е. антибиотик, выделенный бактериями в окружающую среду, может извлекаться нейтральным буфером непосредственно из осадка, получаемого при обработке HCl.

Тиротрицин обладает бактериостатическим и бактерицидным действием по отношению к грамположительным бактериям и главным образом в отношении гноеродных кокков. Преимущество тиротрицина в том, что он действует на некоторые патогенные микробы (например, фекальный стрептококк), на которые не оказывают влияние ни пенициллин, ни сульфамидные препараты. Грамотрицальные бактерии устойчивы к действию антибиотика. Тиротрицин в виде растворов и стойких эмульсий находит применение в медицинской практике преимущественно в качестве антисептического средства. Антибиотик плохо диффундируют, что позволяет использовать его в случае необходимости для длительного бактериостатического действия при местном использовании.

В 1941 г. было установлено, что тиротрицин состоит из двух различных полипептидов. Их разделили и дали самостоятельные названия — тироцидин и грамицидин. Молекулярная масса тироцидина равняется 1300.

При обработке тиротрицина смесью равных объемов ацетона и эфира или одним эфиром в раствор переходит только грамицидин (15−20% от массы тиротрицина). Тироцидин остается нерастворимым препаратом.

В 1950 г. было установлено, что фракция тироцидина не однородна и состоит из трех близких по аминокислотному составу полипептидов, получивших названия торицидинов А, В и С. Грамицидиновая фракция тиротрицина также оказалась неоднородной; были выделены четыре полипептида: грамицидины А, В, С_D и D. Аминокислотный состав этих антибиотиков приведен в таблице 1.

Таблица 1. Аминокислотный состав антибиотков-полипептидов, образуемых различными штаммами Bacillus brevis

В процессе разделения грамицидиновой фракции установлено, что грамицидин, А находится в преобладающем количестве. В отдельных препаратах грамицидиновой фракции содержится 85% грамицидина А, 9% грамицидина В, 6% грамицидина С_D и следы грамицидина D. Грамицидины А, В и С_D имеют линейное строение и состоят из двух цепей.

ГРАМИЦИДИНЫ (GRAMICIDINS).

Из грамицидиновой фракции тиротрицина, образуемого Bacillus brevis, выделены четыре полипептидных антибиотика: грамицидины А, В, С_D и D. Кроме того из штамма Bacillus brevis, выделенного из почв Подмосковья, получен новый полипептидный антибиотик — грамицидин С (советский грамицидин).

Таким образом, к настоящему времени известно пять грамицидинов: грамицидин А, грамицидин В, грамицидин С_D, грамицидин С и грамицидин D.

Грамицидин С (gramicidin S). В 1942 г. Г. Ф. Гаузе и М. Г Бражникова выделили из подмосковных почв штамм Bacillus brevis, образующий антибиотик, который они назвали грамицидином С. Бактерия-продуцент грамицидина С по культуральным и морфологическим свойствам напоминает бактерию Bacillus brevis, образующую тиротрицин. Однако выделенный советскими учеными штамм отличается от штамма Дюбо тем, что не разжижает желатину и не гидролизует крахмал. Организм, продуцирующий грамицидин С, назван Bac. brevis var G.B.

Продуцент грамицидина С Bac. brevis var G. B в процессе развития в жидкой питательной среде спонтанно диссоциирует на ряд форм, отличающихся морфологией колоний и другими свойствами при высеве их на твердые питательные с дрожжевым экстрактом.

Образующиеся варианты представлены следующими формами: складчатая ®, гладкая (S) и две плоские формы (Р+ и Р-).плоские формы впервые были выделены Жариковой с сотрудниками в 1963 г.

Процесс диссоциации Bac. brevis в большей степени зависит от условий культивирования: состава среды, источников углерода, азота, рН и других факторов. Однако любое изменение условий культивирования всегда приводит к возникновению четырех вариантов Bac. brevis: R, S, P+, P -.

Новые варианты Bac. brevis, появившиеся в процессе диссоциации, имеют признаки, отличные от признаков исходной культуры, и в том числе способность к образованию антибиотиков.

Образовывать грамицидин С могут лишь две формы: R и P+, формы S и P — не способны продуцировать этот антибиотик.

Биосинтез грамицидина С антибиотикообразующими вариантами (R и Р+) Bac. brevis происходит независимо от процесса спорообразования (по-видимому, на стадии проспоры), так и активно размножающимися клетками. В период, когда культура переходит к массовому спорообразованию, биосинтез грамицидина не происходит.

Отличие грамицидина С от тиротрицина обнаруживается уже при выделении антибиотика. Грамицидин С при упаривании спиртового экстракта, полученного из бактериальной массы, легко превращается в игольчатые кристаллы, тиротрицин в аналогичных условиях — аморфный препарат.

Грамицидин С существенно отличается от грамицидина С_D по аминокислотному составу. Так, в грамицидине С имеется 10 аминокислотных остатков пяти аминокислот, составляющих замкнутый цикл, а грамицидин С_D состоит из 15 аминокислотных остатков шести аминокислот, расположенных линейно (не циклически).

Условия образования. Грамицидин С длительное время получали при выращивании Bac. brevis var G.B. на средах, содержащих мясной гидролизат, или на 10%-ом дрожжевом гидролизате при поверхностном культивировании организма при температуре около 40⁰С. В этих условиях образуется около 2000 мкг/мл грамицидина.

Корнушовым еще в 1962 г. была установлена принципиальная возможность хорошего роста организма с образованием антибиотика при глубинном культивировании бактерии в колбах на качалках или при продувании воздуха в опытных стеклянных ферментерах.

Интенсивность аэрации среды для развития Bac. brevis var G.B. играет существенную роль в образовании грамицидина С. При низкой степени аэрации среды (0,38 г./О₂/л/ч) культура бактерий плохо развивается и слабо синтезирует антибиотик. Это связанно, по-видимому, с недостатком кислорода в среде. Повышение интенсивности аэрации до 4,38 г./О₂/л/ч способствует увеличению скорости роста бактерий и активному потреблению основных компонентов субстрата, что в итоге также приводит к снижению образования грамицидина С.

Для максимального накопления биомассы бактерий и биосинтеза антибиотика необходимо подобрать сбалансированное сочетание интенсивности аэрации среды и концентрации, входящих в нее веществ. Источники азота и углерода при этом должны содержаться в среде в некотором избытке.

Было показано, что Bac. brevis на высоком уровне образует грамицидин (до 2500 мкг/мл) при культивировании его на относительно простой синтетической среде (янтарнокислый аммоний — 0,5%, глицерин — 1,5%, MgSO₄ — 0,02%, К₂НРО₄ — 0,2%, дистиллированная вода; РН среды перед посевом 7,0 — 7,3). Увеличение концентрации неорганического источника фосфора в среде существенно не влияет на биосинтез грамицидина.

Развитие Bac. brevis и образование грамицидина С может происходить как при температуре 28^0С, так и при 40⁰С. Однако в последнем случае максимальное образование антибиотика происходит в первые 24 часа развития культуры, а при температуре 28⁰С — в период между 24 и 48 часами.

Добавление к натуральной среде неопределенного состава, состоящей из дрожжевого экстракта, мясного экстракта, бактопептона и глюкозы, меченных по углероду ¹⁴С аминокислот, входящих в состав молекулы грамицидина С, показало, что каждая из пяти аминокислот довольно быстро включается в пептидный цикл молекулы антибиотика. Структурные аналоги этих аминокислот подавляли образование антибиотической активности, мало затрагивая при этом рост организма и синтез белка. На синтетической среде в присутствии фенилаланина происходит увеличение биомассы бактерий в 1,5 — 2 раза и повышение биосинтеза грамицидина С в 5,4 раза у R-формы по сравнению с контролем (среда без фенилаланина) и в 3,8 раза у Р+формы. Интересно, что аналог фенилаланина ?-фенил-?-аланин полностью подавляет антибиотикообразование у R-форм и значительно угнетает рост всех форм изученной бактерии.

С другой стороны, дериваты пиримидина (в особенности5-бром-уридин) и 5-флуоритриптофан разъединили синтез белка и грамицидина в другом направлении, т. е. в культурах, которые содержали эти компоненты, продолжалось накопление антибиотика, а рост и синтез белка почти приостанавливался. Следовательно, механизмы синтеза грамицидина и белка в организме различны.

Некоторые аминокислоты (лейцин и пролин), внесенные в козеиново-дрожжевую среду, содержащую 30 мг% N, несколько повышают выход антибиотика. Однако образование грамицидина в этом случае достигает уровня биосинтеза антибиотика на той же среде, но содержащей 120 мг% азота. Валин и орнитин способствуют в условиях объединенной по азоту среде более высокому уровню образования антибиотика по сравнению со средой, содержащей лейцин и пролин. На синтетической среде с глицерином (2%) внесение в субстрат сочетаний яблочной и фумаровой кислот с ?-фенил-?-аланином обеспечивает наибольший биосинтез грамицидина С.

Добавление к среде треонина приводило к некоторому снижению поста R-формы и одновременному повышению биосинтеза антибиотика этой формой Bac. brevis примерно на 20%, а у Р+форм в присутствии треонина происходит полное угнетение образования грамицидина.

Приведенные наблюдения показывают, что на биосинтез грамицидина С существенное слияние оказывают некоторые аминокислоты. Так, ?-фенил-?-аланин заметно стимулирует образование антибиотика, тогда как ее ближайший аналог ?-фенил-?-аланин выступает в роли мощного ингибитора биосинтеза молекулы грамицидина С. Одна и та же аминокислота в зависимости от штамма продуцента оказывает стимулирующее или ингибирующее действие.

Грамицидин С синтезируется клетками Bac. brevis при участии двух ферментов (грамицидин-синтетазы I и II) в присутствии ЛТФ и ионов Mg²⁺.

Компонент I осуществляет активацию четырех аминокислот, входящих в молекулу грамицидина С. Для каждой аминокислоты у этого фермента имеется свой активный центр. Процесс активации аминокислот происходит по следующей схеме: вначале идет образование аминоациладеилатов, связанных с компонентом I, затем происходит отщепление АМФ, и аминокислоты переносятся на сульфгидрильные группы фермента. Компонент II — рацемаза фенилаланина активирует фенилаланин также в присутствии АТФ и ионов магния, в результате чего образуется аминоациладенилат, который переносится на сульфгидрильную группу компонента II с образованием тиоэфира D-фенилаланина.

Образование пептидных связей между активированными аминокислотами происходит с участием фосфопантетеина, ковалентно связанного с компонентом I. Перенос D-фенилаланина с компонента II на иммунную группу L-пролина идет без участия фосфопантетеина. Биосинтез дипептида (фенилаланин-пролин) — это первая стадия образования полипептидного антибиотика. Образовавшийся дипептид переносится на фосфопантетеин, с помощью которого осуществляется перенос этого дипептида на аминную группу L-валина. Образуется трипептид: фен-про-вал. Трипептид переносится на аминную группу орнитина с образованием тетрапептида: фен-про-вал-орн, который тем же путем переносится на аминную группу лейцина с образованием пентапептида: фен-про-вал-орн-лей.

В результате процесса происходит циклизация пентопептида с образованием грамицидина С.

Грамицидин-синтетазы образуются в период развития культуры, следующий за лаг-фазой, и активность их быстро уменьшается, когда клетки переходят к стационарной фазе развития. Грамицидин С начинает обнаруживаться через несколько часов после начала проявления активности ферментов. Образование антибиотика продолжается и после прекращения активности ферментов в культуральной жидкости.

Грамицидин-синтетазы могут находиться как в растворимой, так и в связанной с мембранами формах. Последняя форма более устойчива, и она, по-видимому, ответственна за образование антибиотика после инактивации растворимой синтетазы.

Выделение грамицидина С. Выделение грамицидина С производят следующим способом. Культуральную жидкость подкисляют соляной кислотой до рН 4,5−5. При этом в осадок выпадают дихлоргидрат грамицидина С и бактериальные клетки продуцента, затем антибиотик из Осадка экстрагируют спиртом. Полученный концентрат, содержащий до 4% грамицидина, используют в медицинской практике. Спиртовой концентрат содержит помимо грамицидина С еще несколько близких соединений.

Химическое строение и синтез. Химическая природа грамицидина С хорошо изучена. Это позволило Швайзеру и Зиберу в 1956 г. осуществить полный синтез антибиотика.

Группа сотрудников Массачусетского технологического института (США) разработала в 1973 г. метод ферментативного синтеза грамицидина С. Для синтеза этого антибиотика-полипептида потребовалась иммобилизация нескольких ферментов и разработка АТФ-системы, функционирующей в качестве легко возобновляемого энергетического источника.

Использование многоэтажных ферментных систем для получения некоторых биологически активных полипептидов — метод весьма перспективный.

Впервые в 1945 г. химическое строение грамицидина С было детально изучено Белозерским и Пасхиной, которые дали убедительное доказательство отличия его от полипептидов Дюбо. Грамицидин С — пептид, в состав которого входят пять аминокислот: L-валин, L-орнитин, L — лейцин, D-пролин и D — фенилаланин. В состав грамицидина Дюбо, как уже отмечалось, входят 15 аминокислотных остатков шести аминокислот. При дальнейшем изучении химии грамицидина С и, в частности, при определении его молекулярной массы (равна 1141) было установлено, что грамицидин С — декапепгид, содержащий в определенной последовательности десять аминокислотных остатков тех же пяти аминокислот:

Рисунок 3. Формула грамицидина С

Приведенная на рисунке структурная формула грамицидина С показывает, что в нем имеется свободная аминная группа, представленная 5-аминогруппой орнитина. Изучение взаимосвязи между химической структурой грамицидина С и его биологической активностью показало, что наличие свободной аминной группы весьма важно для проявления антибиотической активности. Блокирование аминогруппы путем ацилирования или ее снятие путем дезаминирования приводит к значительному снижению, а в некоторых случаях к полному уничтожению антибиотической активности.

Уровень антибактериальной активности производных грамицидина С зависит не только от присутствия аминной группы, но и от ее положения в молекуле. Если удалить эти основные, биологически активные группы по отношению к циклопептидной части молекулы грамицидина на 2, 5 и 9 атомов углерода от положения их в природном антибиотике, происходит снижение биологической активности в 7 раз. При ацилировании замещении кислотными остатками типа? — аминных групп орнитина антибиотическая активность грамицидина С уменьшается в 100−150 раз, и грамицидин в этом случае полностью теряет свойства антибиотика.

Замещение ?-аминной группы орнитина на карбоксильную группу R-C, приводит к полной потере биологической активности грамицидина С.

Все это указывает на то, что молекула грамицидина С, образующаяся в процессе биосинтеза, обладает оптимальной с точки зрения антибактериального действия структурой и определенной жесткостью конформации. С ослаблением жесткости конформации молекулы уменьшается или полностью исчезает антибиотическая активность.

Различные штаммы Вас. brevis кроме вышеназванных антибиотиков способны синтезировать и другие полипептидные антибиотические вещества. К их числу относятся эдеин, бреволин и бревин, выделенные из культуральной жидкости Вас. Brevis, а так же бревиген, гратизин, грацейлин, комисан, мемориалин, эсеин, брессин и др.

Штаммы Вас. brevis, полученные в результате естественной изменчивости и индуцированным путем, образуют 23 полипептидных антибиотика, отличающихся строением молекулы и аминокислотным составом (табл. 2).

Таблица 2. Образование антибиотиков различными штаммами Bacillus brevis

ПОЛИМИКСИНЫ (POLYMYXINS)

В группу полимиксинов входят родственные антибиотические вещества полипептидной природы, образуемые различными штаммами Bacillus polymyxa и Bacillus circulans. Об антибиотическом веществе, образуемом Вас. polymyxa, впервые было сообщено и 1947 г., Бенедиктом и Лангликком. Стенсли с сотрудниками описал некоторые свойства антибиотика, активного по отношению к грамотрицательным организмам. Эти же авторы предложили назван, выделенный антибиотик полиммксином и определили продуцирующий его организм.

Примерно в то же самое время английские исследователи опубликовали данные об антибиотике аэроспорине, образуемом Bacillus aerosporus. Позднее было установлено, что Вас. aerosporus близок Вас. polymyxa, и антибиотик, образуемый им, подобен полимиксину.

В дальнейшем методом бумажной хроматографии было показано, что различные штаммы Вас. polymyxa образуют различные варианты полимиксина, отличающиеся аминокислотным составом. Вначале было определено пять разных полимиксинов: полимиксин, А (ранее этот антибиотик назывался аэроспорином), полимиксин В, полимиксин С, полимиксин D и полимиксин Е (колистин). Россовская в 195 6 г. выделила из почв Москвы штамм Вас. polymyxa Ross., образующий полимиксин М.

Японские ученые Кимура, Мураи и другие в 1969 г. сообщили о новом полипептидном антибиотике полимиксине Р, который затем был разделен на два полипептида: полимиксин Pi и полимиксин Р₂. К этой группе антибиотиков относятся также циркулины (циркулин, А и циркулин В) и октапептины.

К настоящему времени описано 35 антибиотиков полимиксинового ряда, в том числе 22 антибиотика, относящиеся, собственно, к полимиксинам, и 13 — к октапептинам.

Все известные полимиксины различаются аминокислотным составом. Однако в структуре всех этих антибиотиков присутствуют треонин, ?, -? — диаминомасляная кислота ДМК) и одна из жирных кислот (табл. 3).

Особенностью группы полимиксинов является то, что в составе их молекул имеется 4−5 свободных у — аминных групп а, у — диаминомаслянои кислоты, что придает полимиксинам свойство катионньгх детергентов, способных образовывать комплексы с фосфолипидами клеточных мембран.

Таблица 3. Аминокислотный состав антибиотиков группы полимиксинов

Полимиксины отличаются характером побочных реакций. Так, полимиксины, А и D обладают высокой нефротоксичностыо, в то время как полимиксины В и Е (колистины) — препараты наименее токсичные.

Известно, что одни штаммы Вас. polymyxa в процессе развития образуют лишь полимиксины, А и С, другие штаммы синтезируют только полимиксины В и D.

Полимиксины по-разному относятся к действию ферментов. Например, полимиксины, А и D устойчивы к действию липазы, а полимиксины В (В₁ и В₂) быстро инактивируются под действием этого фермента.

В последнее время установлено, что полимиксины и циркулин, А — гептапептиды с молекулярной массой около 1200. Молекулярная масса полимиксина В и колистинов, А и В в среднем около 1150.

Полимиксин В-состоит из кольца, включающего три аминокислоты (D-фенилаланин, L-лейцин и L-треонин), четырех остатков L-диаминомасляной кислоты (ДМК) и цепи, состоящей из L-треонина и двух остатков ДМК и метилоктановои кислоты. Аналогичное строение имеют колистин, А и циркулин А.

Рисунок 4. Структурная формулы полимиксина В₁, колистина А, циркулина А

Химическая природа полимиксина М изучена Силаевым и его сотрудниками. Методом хроматографии на бумаге установлено, что в состав этого антибиотика входят а. у — диаминомасляная кислота, треонин, лейцин и одна жирная кислота. Определено, что в молекуле этого антибиотика содержится б остатков а, у — диаминомаслянои кислоты, 3 остатка треонина, 1 остаток D-лейцина и 1 остаток б-метилоктановой кислоты.

Установлено, что биологическая активность полимиксина М не связана ни с размером конца молекулы, ни с конфигурацией аминокислот, но зависит от присутствия в молекуле остатков жирных кислот.

Установлено, что полимиксин М, помещенный в 0,1 н. раствор аммиака (рН 10,3) при 37 °C, быстро теряет антибиотическую активность.

Рисунок 5. Предполагаемая структура полимиксина М

Условия образования и выделение. Обычно для получения полимиксинов используют среды, в состав которых входят кроме неорганических солей дрожжевой экстракт, глюкоза, а иногда и другие компоненты.

Продуцентам полимиксинов в процессе биосинтеза антибиотиком требуется присутствие в среде для развития сложных растительных компонентов (кукурузный или дрожжевой экстракты, соевая, арахисовая или овсяная мука и другие аналогичные компоненты) ил витаминов (биотин, тиамин, никотиновая кислота).

В качестве примера среды, пригодной для развития продуцента полимиксина и образования антибиотика, можно рекомендовать среду следующего состава (г/л): глюкоза — 2 0; поваренная соль — 0,1; мел-3; кукурузный экстракт-2 мл/л или биотин — 0,5 мкг/мл. Вода водопроводная, рН 7,0;

Культура Вас. polymyxa хорошо растет и образует антибиотик при глубинном ее выращивании на среде, содержащей кукурузный экстракт.

В качестве дополнительного источника азота можно использовать сернокислый аммоний. Из источников углерода организм хорошо использует глюкозу, сахарозу, крахмал. Основная масса углеводов потребляется Вас. polymyxa и условиях глубинного культивировании к 10−15 ч роста, аминного азота — к 20−30 ч. Антибиотик образуется до вольно быстро, достигая максимума к 24−30 ч с последующим сохранением этого уровня в течение 10−15 м (рис. 6). Вас. polymyxa может образовывать полимиксин D, содержащий D-лейцин, D-серин и другие аминокислоты (табл. 3), и на простой синтетической среде.

Добавление к среде D-лейиина вызывает прекращение образования антибиотика, но рост бактерии при этом не прекращается. D-серин, L-лейцин и L-треонин не оказывают влияния, a L-a, v-диаминомасляная кислота стимулирует биосинтез полимиксина D.

Биосинтез полимиксина В культурой Вас. polymyxa Pfeizer 2459 связан со спорообразованием бактерий. Образование антибиотика прекращается при нарушении процесса образования спор. Однако в оболочке спор Вас. polymyxa аддиаминомасляная кислота — основной структурный компонент полимиксина — не найдена.

Продуцент полимиксина В (Вас. polymyxa 153), развивающийся в условиях, способствующих спорообразованию, синтезирует значительно больше антибиотика, чем клетки без спорового типа развития. Вместе с тем у этой же культуры наблюдается явление подавления процесса образования спор глюкозой, но в этом случае не происходит нарушения процесса биосинтеза полимиксина.

Специфические ингибиторы биосинтеза полимиксина (D-лейцин, 0-треонин) при подавлении процесса образования антибиотика угнетают и процесс спорообразования у Вас. polymyxa.

Добавление полимиксина к среде, благоприятной для образования спор культурой Вас. polymyxa, приводит к тому, что процесс споруляции клеток бактерий ускоряется и количество образующихся спор возрастает.

Приведенные примеры говорят о довольно сложном и до конца не раскрытом механизме взаимоотношения процессов спорообразования и биосинтеза полимиксина. Вместе с тем они позволяют прийти к выводу, что биосинтез полимиксинов не зависит от процесса спорообразования клеток продуцента. Однако образование спор в определенной степени связано с биосинтезом антибиотика.

Выделение полимиксинов осуществляется разными способами. В одних случаях антибиотики адсорбируют углем и элюируют подкисленным водным ацетоном, метиловым и этиловым спиртами. Выделять антибиотики можно также путем экстракции их из нефильтрованной культуральной среды изопропиловым спиртом (0,25 объема спирта на объем культуральной жидкости) в присутствии сульфата аммония. Для выделения полимиксинов используют и ионообменные смолы. По химической природе полимиксины — основания, поэтому для их выделения используют катиониты.

Принцип выделения веществ с помощью ионообменных смол может быть в общих чертах выражен следующей схемой:

RM₁ + xM — RM₂ + xM₁

Где RM₁ — смола, у которой ион М₁ способен обмениваться, — М₂ ион выделяемого вещества хМ₂.

БАЦИТРАЦИНЫ (BACITRACINS)

Бацитрацины — полипептидные антибиотики, выделенные Джонсоном с соавт. в 1945 г. из культуры Bacillus licheniformis, принадлежащей к группе Вас. subtilis.

Немного позже (1949) из культуры Вас. subtilis выделена смесь антибиотиков, которая получила название эйфайвин. Позднее были выяснено, что полипептиды, входящие в зйфайвин, идентичны полипептидам бацитрацина, поэтому было принято решение упразднить название эйфайвин и сохранить лишь название бацитрацин.

Условия образования. Бацитрацины получают при поверхностном или глубинном росте бактерий на соответствующих средах, содержащих глюкозу, лактат аммония и неорганические соли или соевую муку и глюкозу.

Весьма важно при развитии Вас. licheniformis и образовании бацитрацина наличие в среде определенного соотношения углерода и азота. При высоком показателе отношения углерод / азот в среде происходит образование бацитрацинов, при снижении этого соотношения наблюдается преимущественное образование новой группы антибиотиков — лихениформинов.

Процесс образования бацитрацина Вас. licheniformis связан со спорообразованием культуры. Антибиотик образуется только при таких условиях развития бактерий, которые способствуют их споруляции. Ингибирование процесса спорообразования тормозит биосинтез бацитрацина.

Применение радиоактивного антибиотика позволило показать, что бацитрацин в процессе спорообразования включается в споры. Концентрация его в спорах достигает 15% от общего количества образовавшегося антибиотика.

В связи с этим высказывается мысль, что биосинтез бацитрацина 1 происходит в конце цикла развития бактерий, антибиотик входит в состав спор как их необходимая составная часть.

Строение бацитрацина А. С помощью метода хроматографии на бумаге изучен кислотный гидролизат бацитрацина, А и установлено, что он состоит из 10 аминокислот: трех остатков L-изолейцина и по одному остатку L-лейцина, L-цистеина, Ь-гистидина, L-лизина, L-аспарагиновой кислоты, D-фенилаланина, D-орнитина, D-аспарагиновой кислоты и D-глютаминовой кислоты. В добавление к этому выделяется также одна молекула аммиака. Молекулярная масса бацитрацина, А равна примерно 1410.

Строение бацитрацина, А можно представить следующим образом.

Рисунок 6. Строение бацитрацина A

Химическое строение других бацитрацинов изучено менее подробно. Молекулы всех бацитрацинов имеют в своем составе тиазолиновое кольцо.

ЛИХЕНИФОРМИНЫ (LICHENIFORMINS)

Лихениформины — группа сходных полипептидных антибиотика, образуемых культурой споровой аэробной палочки Bacillus lidicniformis при развитии ее на среде с лактатом аммония. Если греча содержит глюкозу и небольшое количество аммония, то происходит образование бацитрацинов.

Методом противоточного распределения (в системе вода — фенол), а также методом хроматографии на бумаге лихениформины разделяются на три антибиотика: лихениформин А, В и С. Они могут быть выделены в индивидуальном виде. По физическим свойствам лихениформины близки между собой, но отличаются по характеру биологического действия.

Смесь всех лихениформинов обладает высокой антибиотической активностью. Так, эта смесь подавляет in vitro Corynebacterium renale в концентрации 0,025 мкг/мл, Corynebact. diphteriaa — в концентрации 0,1−0,8 мкг/мл, Staph. aureus — б концентрации 1,3 — б мкг/мл¹.

Лихениформины, А и В по сравнению с лихениформином С более активны и, вместе с тем, менее токсичны.

НИЗИНЫ (NISINS)

Из культуры молочнокислого стрептококка Streptococcus lactis в 1944 г. выделено антибиотическое вещество, названное низином.

Из культур стрептококка, выделенных из естественных мест обитания (молоко), можно получить более активные штаммы путем высева суспензии клеток продуцента на среды, содержащие в своем составе определенные концентрации низина, а также в результате получения мутантов, образующихся в процессе облучения клеток стрептококка ультрафиолетовым, рентгеновским излучением, у — излучением.

В группу ниэинов входят пять форм антибиотиков — низины А, В, С, D и Е. Низины А, В и С кроме общих для всех вариантов аминокислот имеют по два остатка валика и метионина, а в низине D эти аминокислоты отсутствуют.

Низины А, В, С и Е чувствительны к ферменту низиназе, образуемому культурой Bacillus cereus, а низин D устойчив к этому ферменту.

Наиболее биологически активный вариант — низин А.

Низин подавляет развитие ряда грамположительных и некоторых кислотоустойчивых бактерий, не оказывает влияния на грамотрицательные бактерии, дрожжи и плесневые грибы.

Антибиотик подавляет развитие многих микроорганизмов: группу стрептококков, пневмококки, Micrococcus pyogenes, различные виды Bacillus, Clostridium, Mycobacterium tuberculosis, Lactobacillus, Corynebacterium, некоторые виды Streptomyces. Низин не оказывает антимикробного действия на Escherichia coli, Salmonella typhi, Shiigella, некоторые виды Neisseria.

Низин впервые был получен в Англии под торговой маркой «Низаплин»; препарат содержит лишь 2,5% низина. Указанный антибиотик нашел применение в пищевой промышленности в качестве консерванта некоторых скоропортящихся продуктов (томаты, зеленый горошек и др.), а также для предупреждения порчи сыров.

Сыр, не содержащий низин, полностью портится в течение 25 — 50 дней хранения. При добавлении к сыру 50 ед/г низина за 200 дней хранения было испорчено всего лишь 27% банок с сыром, взятых в опыт.

Низин не используется в медицинской практике, но с успехом применяется в ветеринарии для лечения маститов у коров.

Есть сообщения об активности низина в отношении малярийного плазмодия.

Свойства низина, а также особенности его химического строения привлекли к этому антибиотику внимание ученых ряда лабораторий как у нас в стране, так и за рубежом.

Условия образования. Изучению условий образования низина культурой Streptococcus lactis штамм МГУ посвящен ряд работ, выполненный на биологическом факультете Московского университета. Наши исследования показали, что интенсивная аэрация культуры молочнокислого стрептококка не оказывает благоприятного влияния ни на рост бактерий, ни на образование низина.

Более существенное влияние на развитие продуцента низина и биосинтез антибиотика оказывает рН среды для культивирования. Активная кислотность среды существенно влияет на выделение низина из клеток бактерий в культуральную жидкость. С понижением рН среды увеличивается выделение низина из клеток в культуральную жидкость. Так, при рН 4,3 более 90% низина выделяется в среду, а при рН 6,8 в субстрат выделяется лишь 40% антибиотика. При этом необходимо иметь в виду, что оптимальным для роста стрептококка и образования им низина будет рН, равный 6,5−6,8.

Быстрый синтез низина культурой молочнокислого стрептококка начинается в период ранней стационарной фазы развития продуцента.

Изучение влияния источников азота на рост Strept. lactis и образование низина показало, что лучшими азотсодержащими компонентами в средах следует признать дрожжевой автолизат, пептон или казеиновый гидролизат.

Относительно высокий выход антибиотика наблюдается при развитии молочнокислого стрептококка на средах, содержащих аммонийные соли органических кислот.

Хорошим источником углерода для роста стрептококка и биосинтеза низина служит глюкоза. Добавление к среде с глюкозой двух-, трех-, четырехи пятиуглеродных органических кислот способствует повышению роста продуцента антибиотика и некоторому увеличению образования им низина.

В процессе развития Strept. lactis нередко наблюдается значительная инактивация низина, находящегося как в культуральнои жидкости, так и связанного с клетками стрептококка. Фермента низиназы, разрушающего антибиотик и образуемого клетками Strept. lactis, не обнаружено. Инактивация низина, по-видимому, увязана с изменением структуры молекулы антибиотика, со степенью его полимеризации или с образованием биологически неактивных компонентов низина с солями кальция, входящими в состав клеточных стенок стрептококка.

Таблица 4. Определение концентрации низина (МЕ/мл)

Есть данные о том, что белок и, в частности, казеин уменьшают инактивацию низина, обладают защитными свойствами. Эти указания подтверждаются результатами исследований, проведенными в нашей лаборатории. Было показано, что в процессе культивирования Strepl. lactis штамм МГУ с рН-статированием и при внесении в. среду казеина наблюдается не только стабилизация антибиотической активности, но и его большее образование (табл. 4).

Строение низина. В конце 60-х годов началось активное изучение химии низина. Было установлено, что низин имеет молекулярную массу, равную 3500. Причем антибиотик может полимеризоваться и образовывать из мономера димер (молекулярная масса 7000) и тетрамер с молекулярной массой 14 000. Полимеризацию низина связывают с наличием в его молекуле дегидроаланина.

В состав молекулы низина входит 30 аминокислотных остатков следующих аминокислот: лизин, гистидин, аспарагиновая кислота, серин, пролин, глицин, аланин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, а также остатки редко встречающихся серосодержащих аминокислот: лантионин и ?-метиллантионин; ненасыщенные аминокислоты — дегидроаланин и ?-метилдегидроаланин.

Рисунок 7. Структурные формулы редко встречающихся аминокислот

Гросс с сотрудниками в 1970 г. установили структуру молекулы низина.

Рисунок 8. Структура молекулы низина по Гроссу

Определено положение двух сульфидных мостиков, образованных остатками ?-метиллантионина. Этот фрагмент молекулы низина имеет бициклическую структуру следующего строения (Рис.):

Рисунок. 9. Бициклическая структура. остатками ?-метиллантионина

Биологическая активность низина обусловлена наличием в его молекуле ?,? — ненасыщенных аминокислот (дегидроаланин,? — метилдегидроаланин). Это подтверждается тем, что аналоги низина, не содержащие дегидраланиллизина, а также пирувиллизин не активны по отношению к Staphilococcus aureus.

Димеры и тетрамеры низина с молекулярной массой соответственно 7000 и 14 000, подобно мономеру, обладают биологической активностью.

Фермент низиназа, образуемый культурой Bacillus polymyxa, инактивирующии низин, по-видимому, специфически действует на пептиды, содержащие дегидроаланин.

Показано, что низин влияет на споры чувствительных к нему бактерий, которые более богаты катионами по сравнению с вегетативными клетками, и выступает как катионитный детергент. Антибиотик не уменьшает терморезистентность спор, как об этом предполагали ранее, а, адсорбируясь на их поверхности, в момент прорастания спор нарушает проницаемость цитоплазматическои мембраны и таким образом, подавляет рост развивающихся клеток бактерий.

Низин способен также реагировать с сульфгидрильными группами биологически важных соединений, выводя их из реакций метаболизма.

Механизм биосинтеза низина. Изучение механизма биосинтеза таких полипептидных антибиотиков, как актиномицины, грамицидины, полимиксины, бацитрацины и др., показало. что их образование принципиально отличается от синтеза белка. Ингибирование синтеза белка у микроорганизмов — продуцентов названных антибиотиков — не приостанавливает образования антибиотиков-полипептидов.

Однако в отношении низина получены другие результаты. Изучая влияние ингибиторов белкового синтеза (хлорамфеникола и пуромицина), а также ингибитора синтеза РНК актиномицина П в культуре Strept. lactis обнаружено, что ингибиторы синтеза белка независимо от времени их введения подавляют и синтез низина. Причем биосинтез низина более чувствителен к действию этих ингибиторов, чем белковый синтез. Актиномицин D также подавляет образование антибиотика.

Эти факты дают основание высказать предположение, что у низина в отличие от других полипептидных антибиотиков путь синтеза сходен с путем образования белков, т. е. связан с рибосомным механизмом. Синтез низина идет через образование низиноподобных белков-предшественников биосинтеза антибиотика, причем превращение пренизина в низин происходит под действием фермента на внешней поверхности клетки стрептококка.

Процесс включения меченой серы (³⁵S) цистеина в лантионин и ?-метиллантионин ингибируется хлорамфениколом в большей степени, чем включение цистеина в белок. Возможно, низин может частично синтезироваться с участием рибосомного механизма.

Есть предположение и о том, что ответственность за биосинтез низина несут определенные плазмиды, в которых локализованы соответствующие гены (ген) образования молекулы антибиотика.

Механизм биосинтеза низина и его молекулярная масса позволяют рассматривать этот антибиотик не как полипептид, а как низкомолекулярный основной белок.

Strept_f lactis кроме низина синтезирует шесть других основных белков, не обладающих антибиотическими свойствами. Низин составляет лишь 201 от основных белков, образуемых стрептококком.

БАКТЕРИОЦИНЫ (BACTERIOCINS)

Бактерии, относящиеся к группе протеев, способны образовывать антибиотические вещества, которые получили название бактериоцинов, или протесцинов. Протесцины относятся к типу антибиотиков колицинов (колицины — антибиотические вещества, продуцируемые различными штаммами Escherichia colli).

Бактериоцины (протесцины) — экстрацеллюлярные биологически активные продукты метаболизма белковой природы. Они инактивируются протеазами (пепсином и трипсином).

Бактериоцины способны подавлять рост кишечной палочки, стафилококков, стрептококков и оказывают бактерицидное действие внутри своего вида и рода.

3. Образование D-аминокислот, входящих в состав полипептидных антибиотиков

Известно, что в состав многих антибиотиков-полипептидов бактериального происхождения (грамицидины, полимиксины, бацитрацины, лихениформины и др.), а также антибиотических веществ, образуемых актиномицетами (актиномицины, эхиномицин, этамицин, валиномицин и др.). наряду с аминокислотами, имеющими I, — конфигурацию, входят D-аминокислоты. К числу последних относится глютаминовая и аспарагиновая кислоты, фенилаланин, орнитин, лейцин. D-Аминокислоты включаются также в состав гликопептидов и тейхоевых кислот, входящих в клеточные стенки бактерий и актиномицетов.

Образование D-аминокислот происходит при развитии организмов на средах, не содержащих указанных D-аминокислот. Более того, продуцент грамицидина С, например, образует антибиотик при развитии бактерий на простой синтетической среде, где в качестве источника азота присутствует только янтарнокислый аммоний, а полимиксин М синтезируется бактериями при развитии их на среде, содержащей в качестве единственного источника азота лишь (МИ-,) SO, — Аналогичное положение наблюдается и в случае образования полипептидных антибиотиков актиномицетами. Внесение в субстрат D-аминокислот, входящих в состав образуемого микроорганизмом антибиотика, в ряде случаев тормозит развитие продуцента и биосинтез антибиотика.

Какие же существуют механизмы, обеспечивающие образование организмами D-аминокислот? В настоящее время известны два механизма (и оба у микроорганизмов) образования D-аминокислот:

непосредственная рацемизация L-аминокислоты в D-амино-кислоту;

трансаминация между D-аминокислотой и соответствующей а-кетокислотой с образованием других D-аминокислот.

Эти два процесса могут идти последовательно: второй за первым по следующей схеме:

L-аммнокислота — D-аминокислота

D-аминокислота₁+?-кетокислота₂-?-кетокислота₁+D-аминокислота₂

Безбородов A.M. Биосинтез биологически активных веществ микроорганизмами. — Л.: Медицина, 1969. — 245 с.

Безбородов A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза. — Легкая и пищеваяпром., 1984. — 304 с.

Биотехнология. — М.: Наука, 1984. — 311 с.

Воробьева Л. И. Техническая микробиология. — М.: МГУ, 1987. — 168 с.

Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. — П.: Мир, 1984 — 312 с.

Егоров Н. С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высшая школа, 1989 — 456 с.

Елинов Н. П. Химическая микробиология. — М.: Высшая школа, 1989. — 322 с.

Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики. — М.: Мир, 1985. — 460 с.

Манаков М.Н., Победимский Д. Г. Теоретические основы промышленной биотехнологии. — М.: Высшая школа, 1989 — 310 с.

Промышленная микробиология / Под ред. Н. С. Егорова. — М.: Высшая школа, 1989. — 688 с.

Смирнов В.В. и др. Антибиотики. — Киев: Высшая школа, 1985. — 191 с.

антибиотик полипептидный штамм многоэтажный