Хроматографические методы. 
Современная газовая хроматография в контроле качества фармацевтических и лекарственных препаратов

Анализ литературных источников показал, что в начале второго десятилетия XXI века ведущее положение при определении жирорастворимых витаминов (в т.ч. витамина Е) занимают исключительно хроматографические методы. В мировой научной литературе около 95% работ посвящено современным хроматографическим методам для контроля качества и стандартизации различных лекарственных средств [14]. Наибольшее применение получили методы ВЭЖХ [7,13,21−24] и ТСХ [10,12,13,25−28].

Метод ВЭЖХ с использованием различных детекторов (спектрофотометрических, флуоресцентных, ИК-фурье, масс-спектрометрических) в последние годы получил более широкое признание в фармацевтическом анализе для количественного определения токоферолов [7,13,21−24]. В зарубежных государственных фармакопеях данный метод применяют в качестве основного для определения витамина Е в лекарственных формах [14]. В USP 24 издания описаны три метода определения б-токоферола (таблица 1), различающиеся предподготовкой пробы, а также качественным и количественным составом подвижной фазы. Детектирование осуществляют с помощью УФ-детектора при длине волны 285 нм.

Таблица 1 — Примеры методик USP 24 анализа витамина Е в лекарственных формах

Описан способ определения жирорастворимых витаминов, исключающий стадию омыления [21]. При этом исследовались гетерогенные системы: этанол (96%) — растительное масло с добавками витаминов. Детектирование токоферола проводили при 292 нм (рисунок 4).

Рисунок 4 — Хроматограмма этанольной фазы гетерогенной системы этанол-растительное масло, содержащее ретинол и б-токоферол: 1 — ретинол; 2 — б-токоферол.

Хроматографическое определение жирорастворимых витаминов (A, D₃, E) методом ОФ ВЭЖХ перспективно для решения аналитических задач в производственных условиях. В качестве объектов исследования применяют фармакопейные препараты жирорастворимых витаминов. Идентифицируют пики по временам удерживания витаминов. Для разделения смеси жирорастворимых витаминов наилучшей является подвижная фаза состава вода — изопропиловый спирт в соотношении 30: 70 (рисунок 5). Объем вводимой пробы 1 мкл. Определение проводят по градуировочной зависимости высоты пика h (см) от содержания витамина Е (мг/мл) [21].

Рисунок 5 — Хроматограмма смеси жирорастворимых витаминов.

Подвижная фаза — смесь воды и изопропанола (30:70): 1 — витамин К₃ (0,24 мкг); 2 — витамин, А (2,0 мкг); 3 — витамин D₃ (27 мкг); 4 — витамин Е (64 мкг) Авторами работы [22] изучено поведение витаминов Е и D₃ при совместном присутствии в условиях ОФ ВЭЖХ с использованием немодифицированных и модифицированных подвижных фаз. Для косвенного спектрофотометрического детектирования витаминов выбран ацетонитрил, модифицированный хлорофиллом (а+в) и тетрафенилпорфирином. При этом пределы обнаружения веществ с данным способом детектирования (нг) превосходят чувствительность УФ-детектора (мкг) и сравнимы с флуориметрическим (нг) детектированием.

ВЭЖХ, в соответствии с современным уровнем развития фармацевтической науки, вытесняет спектральные методы анализа водои жирорастворимых витаминов. Так, в последнюю ГФ XIII издания [23] включена общая фармакопейная статья «Количественное определение витаминов», в которой определение витамина Е после омыления пробы рекомендуется проводить методом ОФ ВЭЖХ с детектированием при 292 нм. Возможно также одновременно определять витамины, А и Е, проводя детектирование при длине волны 300 нм.

В работе [24] была разработана унифицированная упрощенная методика, основанная на применении ВЭЖХ для качественного и количественного анализа жирорастворимых витаминов А, D и Е при их совместном присутствии в многокомпонентных витаминных препаратах, исключающая большинство вспомогательных операций при подготовке образцов к анализу. Извлечение жирорастворимых витаминов проводилось в одну операцию — сначала проба обрабатывалась 0,05 М раствором хлористоводородной кислоты, затем смесью эфира и этанола.

Разработаны методики определения изомеров токоферола в капсулах витамина Е (рисунок 6) с применением нормально-фазового варианта ВЭЖХ и флуоресцентного способа детектирования (л_ex 295 нм, л_еm 340 нм) [14].

Рисунок 6 — Определение изомеров токоферола в капсуле витамина Е.

Несмотря на вышеперечисленные достоинства метода ВЭЖХ, высокая стоимость оборудования существенно ограничивает его применение в аналитических лабораториях [9,12,13].

Метод ТСХ в настоящее время в фармацевтическом анализе токоферолов применяют для оценки подлинности и чистоты субстанций и лекарственных форм [10,12,13,25−28]. Группу токоферолов определяют по величинам Rf после хроматографирования в условиях, представленных в таблице 2.

Таблица 2 — Характеристика условий хроматографического определения б-токоферола методом ТСХ.

В качестве реагентов-детекторов могут использоваться: реактив Эммера-Энгели — токоферолы окрашиваются в розовый или красный цвет на белом фоне; растворы фосфорно-молибденовой кислоты — на желто-зеленом фоне наблюдается окрашивание в сине-голубой цвет; водный раствор нитрата серебра — на белом фоне токоферолы окрашиваются в красный цвет и водный раствор гексацианоферрата калия (III) — на синем фоне имеет место окрашивание в желто-оранжевый цвет [26].

В последнее время стали появляться публикации, свидетельствующие о возможностях ТСХ для количественного анализа с применением специализированного программного обеспечения [25−28], не требующих наличия дорогостоящих аналитических приборов и позволяющих объективно количественно оценить содержание вещества при минимальных затратах времени [28]. Разработаны методики идентификации и количественного определения б-токоферола методом хроматографии в тонком слое сорбента с применением обработки сканированных хроматограмм компьютерной программой «Sorbfil Videodensitometer» [25−27].

Методы ТСХ часто объединяют с ГЖХ, поскольку последняя отличается большей чувствительностью и более пригодна для количественных определений [29]. В этом случае пластинки опрыскивают раствором родамина G или 2,7-дихлрфлуоресцеина (либо хроматографию проводят на пластинках, содержащих указанные флуоресцентные индикаторы), соединения группы витамина Е обнаруживают по тушению индуцированной УФ-облучением флуоресценции, соответствующие зоны сорбента соскабливают, вещества экстрагируют и анализируют с помощью ГЖХ. Высокой разрешающей способностью обладают открытые капиллярные колонки с непористым слоем, внутренняя поверхность которых дезактивирована силаноксом и покрыта полярной фазой — сульфоном полифенилового эфира [29]. На таких колонках разделяют токоферолы в виде их триметилсилильных производных.