Комбинированные методы исследования флавоноидов

Широкое распространение в анализе получили комбинированные методы, включающие предварительное хроматографическое разделение на бумаге, в тонком слое с последующим определением веществ в элюатах из пятен хроматограмм, а также непосредственным сканированием оптической плотности или определением площади пятна па хроматограмме[10].

Хроматомасспектрометрическое определение флавоноидов Хроматомасспектрометрия — метод анализа смесей, преимущественно органических веществ, и определения следовых количеств веществ в объеме жидкости. Метод основан на комбинации двух самостоятельных методов — хроматографии и масс-спектрометрии. С помощью первого осуществляют разделение смеси на компоненты, с помощью второго — идентификацию и определение строения вещества, количественного анализа. Известны два варианта хроматомасспетрометрии, представляющие собой комбинацию масс-спектрометрии либо с газо-жидкостной хроматографией (ГЖХ), либо с ВЭЖХ.

При сочетании ГЖХ и масс-спектрометрии совместимость этих двух приборов обусловлена тем, что в обоих случаях анализируемое вещество находится в газовой фазе, рабочие температурные интервалы одинаковы, пределы обнаружения (чувствительность) близки. Различие состоит в том, что в ионном источнике масс-спектрометра поддерживается высокий вакуум (10^-5 — 10^-6 Па), тогда как давление в хроматографической колонке 10⁵ Па. Для понижения давления используют молекулярный сепаратор, который одним концом соединен с выходом хроматографической колонки, а другим — с ионным источником масс-спектрометра. Молекулярный сепаратор удаляет из газового потока, выходящего из колонки, основную часть газа-носителя, а органическое вещество пропускает в масс-спектрометр. При этом давление на выходе колонки понижается до рабочего давления в масс-спектрометре.

Наиболее удобный для хроматомасспектрометрии газ-носитель — гелий.

В масспектрометрах, соединенных с газовыми хроматографами, применяется ионизация электронным ударом, химическая или полевая. Хроматографические колонки должны содержать труднолетучие и термостабильные стационарные жидкие фазы, чтобы масс-спектр их паров не налагался на спектр анализируемого вещества.

Анализируемое вещество (обычно в растворе) вводится в испаритель хроматографа, где мгновенно испаряется, а пары в смеси с газом-носителем под давлением поступают в колонку. Здесь происходит разделение смеси, и каждый компонент в токе газа-носителя по мере элюирования из колонки поступает в молекулярный сепаратор. В сепараторе газ-носитель в основном удаляется и обогащенный органическим веществом газовый поток поступает в ионный источник масс-спектрометра, где молекулы ионизируются. Число образующихся при этом ионов пропорционально количеству поступающего вещества. С помощью установленного в масс-спектрометре датчика, реагирующего на изменение полного ионного тока, записывают хроматограммы. Таким образом, масс-спектрометр можно рассматривать как универсальный детектор к хроматографу. Одновременно с записью хроматограммы в любой ее точке, обычно на вершине хроматографического пика, может быть зарегистрирован масс-спектр, позволяющий установить строение вещества[15].

В современных масс-спектрометрах, снабженных ЭВМ, построение хроматограмм и обработка масс-спектров производится автоматически. Через равные промежутки времени по мере элюирования компонентов смеси регистрируются масс-спектры, количественные характеристики которых накапливаются в памяти ЭВМ. Для каждого сканирования производится сложение интенсивностей всех регистрируемых ионов. Так как эта суммарная величина (полный ионный ток) пропорциональна концентрации вещества в ионном источнике, то ее используют для построения хроматограммы (эта величина откладывается по оси ординат, по оси абсцисс — время удерживания и номер сканирования). Задавая номер сканирования, можно вызвать из памяти масс-спектр в любой точке хроматограммы. Как описано выше, может быть проанализированы смеси веществ, достаточно хорошо разделяемые на подходящих колонках. Иногда удается исследовать и неразрешенные хроматографические пики. Исследуемые вещества должны быть термически стабильны, хроматографически подвижны в интервале рабочих температур колонки, легко переводиться в паровую фазу при температуре испарителя.

Чувствительность хроматомасспетрометрии (обычно 10^-6-10^-9 г) определяется чувствительностью детектора масс-спектрометра. Более чувствительна (10^-12-10^-15 г) разновидность хроматомасспетрометрии — массфрагментография, называемая также селективным ионным или многоионным детектированием. Суть ее состоит в том, что запись хроматограмм осуществляется не по полному ионному току, а по наиболее характерным для данного вещества ионам. Этот вид хроматомасспетрометрии используют для поиска, идентификации и количественного анализа вещества с известным масс-спектром в составе сложной смеси, например при количественном определении следов веществ в больших объемах биологических жидкостей (медицина, фармакология, токсикология, допинг-контроль, биохимия).

Другой вариант хроматомасспетрометрии заключается в сочетании ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Метод предназначен для анализа смесей труднолетучих, полярных веществ, не поддающихся анализу методом ГЖХ. Для сохранения вакуума в ионном источнике масс-спектрометра необходимо удалять растворитель, поступающий из хроматографа со скоростью 0.5−5 мл/мин. Для этого часть жидкого потока пропускают через отверстие в несколько мкм, в результате чего образуются капли, которые далее попадают в обогреваемую зону, где большая часть растворителя испаряется, а оставшаяся вместе с веществом попадает в ионный источник и ионизируется химически.

Метод хроматомасспетрометрии используют при структурно-аналитических исследованиях в органической химии, нефтехимии, биохимии, медицине, фармакологии, для охраны окружающей среды и других областях[15].

Наиболее часто встречаемым методом количественного определения содержения флавоноидов является спектрофотометричесий.

Разработана методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в побегах черники обыкновенной, которая может быть использована для стандартизации данного вида лекарственного растительного сырья.

В соответствии с ГФ XI издания стандартизация сырья черники проводится по внешним признакам.

Для разработки методики количественного определения флавоноидов в побегах черники был использован метод дифференциальной спектрофотометрии, отличающийся высокой точностью и экспрессностью, и вследствие этого широко применяемый в последнее время для количественного анализа флавоноидов в растительном сырье.

Метод базируется на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. Происходящий при этом батохромный сдвиг первой полосы поглощения флавоноидов с 330−350 нм до 390−415 нм позволяет применить в качестве контроля испытуемый раствор без реактива, и тем самым исключить влияние сопутствующих окрашенных веществ. В качестве стандартного вещества используют рутин, максимум дифференциального спектра поглощения которого (415 нм) совпадает с максимумом дифференциального спектра извлечения из побегов черники.

Для определения оптимального времени комплексообразования суммы флавоноидов побегов черники с алюминия хлоридом определяют оптическую плотность полученного комплекса на фоне чистого извлечения через равные промежутки времени. Полученные результаты свидетельствуют о том, что через 40 мин величина оптической плотности исследуемого комплекса достигает максимального значения. Вследствие этого измерение оптической плотности необходимо проводить через 40 мин после добавления алюминия хлорида к извлечению.

Для выяснения подчиняемости исследуемого комплекса закону Ламберта-Бугера-Бера из него были приготовлены разведения, и установлено, что в диапазоне оптических плотностей 0,2−0,7 у.е. наблюдается линейная зависимость между концентрацией растворов и величиной поглощения.

В процессе разработки методики количественного определения изучены и подобраны оптимальные условия экстракции исследуемого сырья. Оптимальными параметрами получения извлечений из побегов черники обыкновенной являются: экстрагент — 70% этиловый спирт, степень измельчения сырья — 0,5−1,0 мм, температура экстракции — 90 °C, соотношение сырье: экстрагент — 1: 100, кратность экстракции — 2, продолжительность I экстракции — 60 мин, II экстракции — 60 мин. Измеряют оптическую плотность раствора в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 415 нм.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора комплекса ГСО рутина с алюминия хлоридом.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в % Х вычисляют по формуле:

X=.

где D — оптическая плотность испытуемого раствора;

D0 — оптическая плотность ГСО рутина;

m — масса сырья в г;

m0 — масса ГСО рутина в г;

w — потеря в массе при высушивании сырья в %.

Относительная ошибка определения суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной составляет 3,44%. В связи с этим, по предлагаемой методике достаточно проводить анализ в 3 повторностях.

Таким образом, для стандартизации побегов черники обыкновенной предлагается количественное определение суммарного содержания флавоноидов, базирующееся на достаточно точном и нетрудоемком методе дифференциальной спектрофотометрии. В побегах черники обнаружено относительно высокое количество флавоноидов[19].

На практике трудно обойтись каким-то одним методом идентификации и количественного определения флавоноидов, как и других веществ, в лекарственном растительном сырье, поэтому применяют комплекс методов, сочетание которых может быть различным.

Впервые из надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) выделены и идентифицированы с использованием современных физико-химических методов (ВЭЖХ, УФ-, ПМР-спектроскопии и масс-спектрометрии) флавоноиды, относящиеся к группе флавонов: гиспидулин (5,7,4'-тригидрокси-6-метоксифлавон), апигенин (5,7,4'-тригидроксифлавон), хризоэринол (5,7,4'-тригидрокси-3'-метоксифлавон) и лютеолин (5,7,3', 4'-тетрагидроксифлавон), а также скутелляреин (5,6,7,4'-тетрагидроксифлавон).

Для изучения состава флавоноидов был получен экстракт на 70% этаноле методом мацерации при нагревании. Полученное извлечение отделяют от обработанного сырья процеживанием через несколько слоев марли, растворитель удаляют под вакуумом, остаток высушивают, высушенный экстракт измельчают. Для разделения сложных смесей веществ полученного экстракта применяют методы избирательной экстракции, используя в качестве экстрагентов: хлороформ, этилацетат и н-бутанол. Полученные фракции анализируют с применением методов одномерной и двумерной хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента (селикогель) параллельно со стандартными образцами веществ-свидетелей в различных системах растворителей (н-бутанол — уксусная кислота — вода 4:1:5, 15 -60% уксусная кислота, хлороформ — этанол 8:2, 1:1). Обнаружение веществ проводят в фильтрованном УФ-свете при длине волны 254 нм до и после обработки хроматограмм 5% этанольным раствором гидроксида калия и 2% этанольным раствором хлорида алюминия.

Выделение индивидуальных соединений из этилацетатной фракции проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикогеле. Элюирование проводили хлороформом, смесью хлороформ-этилацетат, затем этилацетатом, смесью этилацетат-этанол, этанолом.

Контроль за элюированием веществ осуществляют с помощью методов ТСХ («Сорбфил», элюенты: метанол — хлороформ (1:1; 1:4; 1:9)) и хроматографией на бумаге (FN -4, элюенты: н-бутанол — уксусная кислота — вода (4:5:1; 6:4:3)) и 1, 15, 30, 60% растворы уксусной кислоты), просматривая хроматограммы в фильтрованном УФ-свете (254 нм).

Для изучения компонентного состава и химического строения образцы веществ с колонки анализируют методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе с диодно-матричным УФи масс-селективным детекторами.

Методом ESI-масс-спектрометрии получают масс-спектры веществ, используя ионную ловушку MSD Trap XCT Ultra. Регистрацию масс-спектров образцов проводят как с положительной, так и с отрицательной ионизацией. Полученные спектры анализируются и обрабатываются в программном пакете flexAnalysis.

Спектры ПМР записаны на спектометре Фурье AVANCE AV 300. В качестве внутреннего стандарта используют тетраметилсилан (ТМС).

R=H, R₁=H (флавоноид 1);

R=OCH₃, R₁=H (флавоноид 2);

R=H, R₁=OCH₃,(флавоноид 3);

R=OH, R₁=H (флавоноид 4);

R=H, R₁=OH (флавоноид 5).

По физико-химическим свойствам выделенных из василька шероховатого флавоноидов установили наличие флавоноидов: гиспидулин (5,7,4'-тригидрокси-6-метоксифлавон), апигенин (5,7,4'-тригидроксифлавон), хризоэринол (5,7,4'-тригидрокси-3'-метоксифлавон) и лютеолин (5,7,3', 4'-тетрагидроксифлавон), а также скутелляреин (5,6,7,4'-тетрагидроксифлавон).