Влияние циклогексимида (in vivo) и целита (in vitro) на содержание катионов магния и стабильность РНК проростков пшеницы

Известно, что ингибитор синтеза белка циклогексимид (ЦГС) осуществляет блокаду трансляции, т. е. блокирует деятельность рибосом. При этом происходит стабилизация мРНК in vivo, предположительно в результате распада короткоживущих РНКаз [19]. Вместе с тем, стабилизация мРНК in vitro достигается при обработке водного раствора РНК целитом (SiO2) [21,31].

Рибосомная РНК (рРНК) также подвергается магний-зависимому распаду в системе ommp [22]. Вышеупомянутые два агента противоположно влияют на содержание катионов магния в рРНК: 8-ми часовая инкубация проростков пшеницы на растворе ЦГС при комнатной температуре (20оС) приводила к увеличению содержания магния в рРНК на 40%, а обработка водного раствора рРНК суспензией целита определяла потерю 20% магния от уровня контрольного варианта [24].

Представляло несомненный интерес изучить влияние комбинации воздействия этих двух факторов на степень полиаденилирования и стабильность поли (А)-содержащей мРНК, а также стабильность ген-специфических мРНК проростков пшеницы. Для этого проростки озимой пшеницы сорта Краснодарская 39 инкубировали на растворе ЦГС в течение 6 и 10 часов. In vivo обработка проростков пшеницы ЦГС вызывала увеличение индекса стабильности суммарной поли-(А)-содержащей мРНК; дополнительная обработка РНК in vitro целитом приводила к дальнейшему увеличению индекса стабильности полиаденилированной РНК (таблица 5).

Таблица 5. Влияние циклогексимида (ЦГИ) на изменение стабильности суммарной полиаденилированной мРНК и трёх специфических мРНК проростков пшеницы в ommp системе [26].

1) — приводится для суммарной поли-(А)+мРНК; отношение (А)n65o/(А)n35o непрогретых образцов составляло 1,25.

Анализ изменений стабильности ген-специфических мРНК актина, субъединицы б фактора элонгации трансляции 1 (eEF-1б) и УДФ-глюколилтрансферазы (waxy) проводили методом молекулярной гибридизации с соответствующими радиоактивномечеными олигонуклеотидными зондами на колонке поли (У)-сефарозы (сэндвич-гибридизация). В результате шестичасовой обработки проростков ЦГС значительно увеличилась эффективность гибридизации всех использованных олигонуклеотидных зондов по сравнению с образцами РНК из контрольных растений. При этом наблюдали деаденилирование поли-(А)-содержащей мРНК контрольных и опытных образцов: соотношение молекул с относительно длинными и относительно короткими поли-(А)-хвостами ((А)n65о/(А)n35o) снижалось от величины 1,25 у исходных препаратов РНК до 0,57 по окончании инкубации в системе ommp.

Напротив, после 10-часовой обработки ЦГС отсутствовал процесс деаденилирования мРНК при инкубации РНК в системе ommp: результаты гибридизации были близки или ниже контрольных в противоположность дальнейшему увеличению общей стабильности поли-(А)-содержащей мРНК. Сходные результаты были получены при гибридизации поли-(А)-содержащей РНК из проростков, подвергнутых 6-ти часовой обработке ЦГС, в том случае, если РНК предварительно (перед прогревом в ommp системе) обрабатывали целитом (таблица 5). Представленные результаты хорошо интерпретируются, если предположить, что с мРНК ассоциированы две РНКазы, различающиеся по времени жизни. Одна из них — относительно долгоживущая, деаденилирующая мРНК РНКаза, действие которой прекращается только после 10-часовой инкубации проростков с ЦГС. Вторая — разрушающая мРНК РНКаза — относительно короткоживущая, действие которой замедляется уже через 6 часов инкубации проростков с ЦГС.

Таким образом, при инкубации в системе ommp водного препарата РНК из контрольных растений происходило деаденилирование и распад мРНК. Блокирование при помощи ЦГС синтеза белка в течение 6 часов замедляло распад поли-(А)-содержащей мРНК in vitro на фоне продолжающегося процесса деаденилирования, что приводило к возрастанию индексов стабильности как суммарной, так и индивидуальных поли (А)-содержащих мРНК в результате увеличения количества сайтов гибридизации.

Увеличение экспозиции до 10 часов приводило к полной остановке процесса деаденилирования и стабилизировало мРНК, однако эффективность гибридизации изучаемых транскриптов оставалась на уровне контрольных растений, не обработанных ЦГС. Очевидно, остановка деаденилирования приводила к стабилизации пространственной структуры мРНК и, как следствие, к экранированию части сайтов гибридизации (как и в случае мРНК кукурузы: таблица 4). Это ограничение, связанное с методическими особенностями гибридизации на колонке поли-(У)-сефарозы (как и при использовании ОТ-ПЦР), не сказывается на спектрофотометрическом выявлении процесса стабилизации суммарной поли-(А)-содержащей мРНК.

Обработка целитом РНК из проростков шести часового опыта останавливает действие деаденилирующего фермента (дополнительно к уже инактивированной при помощи ЦГС разрушающей РНКазе), что и приводит к сходству индексов стабильности мРНК 6-часового и 10-часового экспериментов. То есть, обработка РНК целитом, останавливая деаденилирование и распад мРНК, моделирует in vitro ситуацию, имеющую место in vivo при 10-часовой блокаде синтеза белка. Имеет место кумулятивный эффект действия обработок ЦГС и целитом.

Эти РНКазы, по-видимому, являются ключевыми ферментами, контролирующими время жизни мРНК. Возможно, снижение их активности и является причиной нарушения процесса деаденилирования и распада мРНК в созревающем зерне курурузы, мутантной по регуляторному гену opaque-2. Наличие подобных РНКаз у растений известно [26], однако в нашем случае необходимо допустить, что они очень прочно связаны с мРНК и устойчивы к действию традиционных депротеинизирующих агентов.

Вместе с тем не исключено, что здесь имеет место проявление рибозимных свойств мРНК, для детального объяснения которых на сегодняшний день не имеется достаточной информации. Механизм ингибирования синтеза белка в клетке при помощи ЦГС плохо изучен [26]. ЦГС — молекула с небольшой молекулярной массой (281.3 Да) и, возможно, его взаимодействие с молекулой РНК приводит к незначительному изменению её третичной структуры, достаточному, однако, для ликвидации рибозимных свойств РНК без потери катионов магния. Целит же, в силу своей огромной площади взаимодействия отнимает катионы магния, необходимые для проявления рибозимных свойств РНК. Не исключено, что in vivo эти свойства только усиливаются специфическими белками.

Основной вывод. Интерпретация фактов взаимодействия целита с мРНК in vitro и влияния циклогексимида in vivo, с современной точки зрения может быть конкретизирована с позиции исследований явления РНК-интерференции.

Многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что остановка синтеза белка в клетках эукариот циклогексимидом приводит к стабилизации короткоживущих мРНК. Это связывали с наличием у эукариот специфических короткоживущих РНКаз, которые быстро распадаются в условиях блокады синтеза белка [26].

Однако являются ли эти короткоживущие белки рибонуклеазами или они участвуют в распаде мРНК in vitro опосредовано? Возможно, гипотетические короткоживущие белки участвуют в формировании комплекса RISC (РНК-индуцируемый комплекс сайленсинга, состоящий из РНКовых и белковых компонентов), определяющего явление РНК-интерференции — разрушение определённых ген-специфических мРНК. Это белки семейства Argonaute. Однако структура белков этого семейства (в литературе обычно обозначаемое, как семейство piwi/ zwille/argonaute, или просто Argonaut) не позволяет сделать каких-либо выводов об их биохимической функции. У плодовой мушки известны два гомолога этих белков: Ago2 ассоциируется с малыми интерферирующими РНК в RISC и осуществляет расщепление мРНК; Ago1 ассоциируется с микроРНК и выполняет функцию ингибитора трансляции мРНК-мишени [16].

Вместе с тем, наличие длинных полиаденилированных не кодирующих РНК [26] теоретически позволяет объяснить молекулярный механизм тождественности магний-зависимого распада РНК in vivo и in vitro тем, что в пуле поли-(А)+мРНК в обоих случаях имеются РНК-интерференции (iRNA), осуществляющие дифференциальный распад мРНК за счёт Mg+±зависимых процессов.