Материалы и методы

вирусный материал — вирус ящура типа А, выделенный в неблагополучных по ящуру хозяйствах Чуйской области;

матрасы со сплошным клеточным монослоем ВНК-21 и ПК;

реактивы — спирт этиловый, наборы среды Игла, солевой раствор Хенкса, пенициллин, поддерживающая среда;

оборудование — бокс, морозильник, спиртовка, дозатор, термостат 37 °C.

Для заражения клеток отбирали матрасы со сплошным клеточным монослоем (Фото 1.). Ростовую питательную среду сливали, клетки 1 -2 раза промывали раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы.

В матрасы вносили 150мкл вируссодержащего материала (вирус ящура типа, А выделенный в Чуйской области) и покачиванием распределяли его равномерно по слою клеток. В таком виде матрасы оставляли на 1ч при 37 °C для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссодержащий материал удаляли из матраса и ввели поддерживающую среду. Матрасы закрыли герметичной резиновой пробкой и ставили на инкубацию в термостат при 37 °C, в горизонтальном положении.

Зараженный матрас ежедневно исследовали под электронным микроскопом на происходящие процессы.

Результаты исследования

Технология культивирования вируса ящура на культуре клеток состоит в следующем. В зараженном матрасе адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают внутрь их, и начинается их репродукция. Новые вирусные частицы покидают (полностью или частично) клетки, в которых они образовались, проникают в непоражённые клетки, репродуцируются в них, переходят в новые клетки и поражают их. Так продолжается до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки. В результате происходящего процесса практически основная масса клеток в матрасе поражается вирусом.

На фото 2 отображены результаты индикации вируса в культуре клеток которые оказались неодинаковы по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию (ЦПЭ, ЦПД) (Фото 2).О размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому эффекту или цитопатическому действию. Цитопатическое действие — это любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно использовать электронный микроскоп и осмотреть монослой в матрасе. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в матрасе, не подвергающиеся заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскопе отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков изменённых клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. ЦПД часто оценивают в крестах или баллах. Вирус ящура проявил ЦПД через 1 -2 суток после заражения монослоя.

В наших экспериментах как видно, клетки становятся более вытянутые, их контуры.

На четвертый день после заражения видно, как образовались гигантские синцитиальные, многослойные скопления клеток, содержащие по 1000 ядер (Фото 3.).

На шестой день наблюдения, очевидно что, клетки истощены, нарушается целостность клеточного монослоя. В некоторых местах клетки повреждены и отслаиваются от стекла. (Фото 4.).

Как видно по фотографиям на 2-й день зараженияв матрасе ВНК-21 (ЦПД — 20%) по сравнению с матрасом ПК (ЦПД — 10%) на второй день заражения ЦПД проявляется интенсивнее, на четвертый день ЦПД в матрасе ВНК-21 составило 40% всего матраса, когда в ПК составило всего 20%, а на шестой день ЦПД в матрасах ВНК-21 и ПК было одинаково и составило примерно 70%. По нашим наблюдениям вирус ящура в матрасе ВНК-21 заражает клетки быстрее, чем в матрасе ПК.