Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Коклюш и дифтерия являются воздушно-капельными инфекциями, управляемыми средствами специфической вакцинопрофилактики. Массовая иммунизация детского населения АКДС-вакциной против коклюша и дифтерии, осуществляемая в России с 1959 года, позволила достигнуть значительных успехов в борьбе с этими заболеваниями и коренным образом изменила характер течения эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций (Герасимова А.Г. и др., 2004; Лыткина И. Н. и др., 2004; Максимова Н. М. и др., 2002, 2003, 2008; Маркина С. С. и др., 2002, 2005, 2006; Петрова М. С. и др., 2000; Селезнева Т. С. и др., 2002, 2004; Чистякова Г. Г. и др., 2001, 2005).

Несмотря на очевидные успехи проводимой массовой иммунизации детского населения, коклюш и дифтерия по-прежнему остаются актуальными инфекциями, как для детского, так и для взрослого населения. До настоящего времени сохраняются основные эпидемиологические особенности поддержания эпидпроцессов этих инфекций.

Однако, в настоящее время в г. Москве на фоне высокого охвата профилактическими прививками (до 95,0%) отмечается относительная стабилизация заболеваемости коклюшем (показатель заболеваемости на 100 000 населения (ПЗ) 2006 г. — 13,28; 2007 г. — 12,87), регистрируется заболеваемость среди привитых детей, наметились изменения в возрастной структуре заболеваемости (увеличилась доля детей школьного возраста при сохраняющейся высокой заболеваемости детей раннего возраста) и тяжесть клинического течения коклюша (регистрируются тяжелые формы не только среди детей раннего возраста, но и у детей школьного возраста) (Лыткина И.Н. и др., 2004; Чистякова Г. Г. и др., 2005). Аналогичные тенденции развития эпидпроцесса коклюшной инфекции отмечаются в России (Герасимова А.Г. и др., 2004; Селезнева Т. С. и др., 2002). При дифтерии в настоящее время в России отмечается заболеваемость на спорадическом уровне (ПЗ — 0,48 — 0,35 в 2005 — 2007 гг.), однако, продолжают регистрировать тяжелые формы заболевания, летальные исходы, заболеваемость среди привитых лиц, а также бактерионосительство, которое имеет место на фоне высокого уровня антитоксического иммунитета (Максимова Н.М. и др., 2002, 2003; Маркина С. С. и др., 2002, 2005, 2006). Все это свидетельствует о продолжающейся циркуляции и сохранении возбудителей коклюша и дифтерии в окружающей среде, а значит, существует риск возникновения заболеваний, особенно среди неиммунных и/или лиц с ослабленным иммунитетом.

Таким образом, в настоящее время сохранились все условия для поддержания эпидемических процессов коклюшной и дифтерийной инфекций, что определяет необходимость борьбы с ними на современном этапе и невозможность иррадикации возбудителей дифтерии и коклюша как биологических видов с помощью существующих средств вакцинопрофилактики (Мазурова И.К., 1993, 2002, 2006, 2008).

Одной из причин поддержания эпидпроцессов является изменчивость возбудителей, лежащая в основе их адаптации в меняющихся условиях существования. В последнее десятилетие появилось значительное число работ отечественных и зарубежных исследователей, рассматривающих природные и антропогенные факторы, в том числе иммунизацию, как мощный селективный фактор отбора (Борисова И.Э. и др., 2008; Селезнева Т. С., 2002; Семенов Б. Ф. и др., 2002, 2003; Cassiday P. et all, 2000; de Melker H.E. et all, 2000; Gandon S. et all, 2003, 2007; Packard E.R. et all, 2004; Preston A. et all, 2005).

Поэтому, в сложившихся условиях необходимо проводить постоянный мониторинг циркулирующих штаммов возбудителей коклюша и дифтерии с использованием молекулярно-генетических методов исследования, позволяющих выявлять самые незначительные изменения в геномах, в первую очередь, в генах, ответственных за проявление патогенных свойств микробов. Эти мутации могут привести к достаточно серьезным изменениям фенотипа и появлению новых клонов возбудителя, что, в свою очередь, может оказать влияние на течение эпидемических и инфекционных процессов и требует разработки новых технологий диагностики и наблюдения за возбудителями, как дифтерии, так и коклюша.

Цель исследования: выявление молекулярно-генетических особенностей структуры основных генов патогенности B. pertussis и С. diphtheriae, циркулирующих на современном этапе развития эпидемических процессов этих инфекций, и разработка принципиально новых подходов к совершенствованию лабораторной диагностики и средств вакцинопрофилактики коклюша и дифтерии.

Задачи исследования

• 1. Выявить особенности структуры пяти основных генов патогенности: ptxА гена, кодирующего энзиматически активную S1 субъединицу коклюшного токсина, prn гена, кодирующего пертактин, fim2 и fim3 генов, кодирующих фимбриальные белки, и tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в период 1948 — 2007 гг.
• 2. Изучить генетическую структуру штаммов B. pertussis, используемых для приготовления коклюшного компонента АКДС-вакцины, и провести сравнительный анализ с генетической структурой штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем на современном этапе. Оценить вирулентные свойства штаммов B. pertussis, несущих новые аллельные вариации основных генов патогенности.
• 3. Разработать ускоренный метод мониторинга, основанный на технологии ПЦР-ПДРФ, для выявления распространенных в настоящее время штаммов B. pertussis с измененной структурой гена коклюшного токсина.
• 4. Разработать и провести клинико-микробиологические испытания ускоренного молекулярно-генетического метода лабораторной диагностики коклюша (LAMP-вариант), позволяющего идентифицировать возбудителя коклюша в клиническом материале без предварительного выделения «чистой» культуры B. pertussis.
• 5. Изучить структуру гена дифтерийного токсина (tox) и провести наблюдение за распространением штаммов С. diphtheriae, имеющих изменения в его структуре.
• 6. Определить нуклеотидную последовательность (amy ген), являющуюся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность С. diphtheriae, и выявить «мишени» — нуклеотидные последовательности ДНК, ответственные за принадлежность возбудителя дифтерии к биовару gravis или mitis, и на этой основе разработать новый метод дифференциальной диагностики биоваров.
• 7. Систематизировать коллекцию штаммов B. pertussis, выделенных за период 1948 — 1994 гг., и пополнить коллекцию штаммов B. pertussis и С. diphtheriae штаммами современного периода эпидпроцессов.

Научная новизна

Впервые проведен молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, и показано, что происходит вытеснение штаммов, содержащих «вакцинные» аллели, штаммами с «невакцинными» аллелями генов, кодирующих S1 субъединицу коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков. коклюш дифтерия ген патогенность Получены новые данные об особенностях структуры пяти основных генов патогенности штаммов B. pertussis. Установлено, что в настоящее время штаммы B. pertussis с новым «невакцинным» ptxА1 аллелем гена коклюшного токсина распространились и полностью вытеснили штаммы B. pertussis с «вакцинными» ptxА4 и ptxА2 аллелями; новые «невакцинные» prn2 и prn3 аллели гена пертактина встречаются у 76,0% и 21,9% штаммов, соответственно. В тоже время формирование и распространение штаммов с «невакцинными» fim2−2 и fim3 В аллелями фимбриальных генов происходит медленнее и встречается в 53,3% и в 83,4% случаев, соответственно. Изменений в структуре гена, кодирующего фактор колонизации трахеи (tcfA) не выявлено. Обнаружено, что современная популяция штаммов B. pertussis, характеризующаяся новыми «невакцинными» аллелями основных генов патогенности, обладает высокой патогенностью и высокой лейкоцитозстимулирующей активностью, что влияет на тяжесть клинического течения коклюша.

Получены новые данные о несоответствии структуры основных генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертактин, фимбриальные белки, штаммов B. pertussis, которые используют в нашей стране для производства АКДС-вакцины, и штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем в настоящее время, что является обоснованием совершенствования средств вакцинопрофилактики при коклюше.

Показано, что сохраняется циркуляция штаммов C. diphtheriae (в 60,0% случаев) с незначительными множественными единичными мутациями в tox гене, которые не сказываются на первичной структуре белка дифтерийного токсина, что формирует генетическую вариабельность вида. В последние годы не произошло распространения штаммов C. diphtheriae с измененной структурой tox гена (в положении 1252), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина.

Выявлено, что в геноме штаммов C. diphtheriae биовара gravis имеется нуклеотидная последовательность (amy ген), являющаяся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность, в то время как штаммы С. diphtheriae биовара mitis имеют делецию этого фрагмента генома.

Сформированы новые подходы в системе мониторинга коклюшной инфекции и лабораторной диагностики коклюша и дифтерии, основанные на современных амплификационных технологиях, использующих выбранные «мишени» (нуклеотидные последовательности ДНК).

Впервые разработан новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе молекулярно-генетического изучения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ) и получен патент на изобретение № 2 299 908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.

Впервые разработан прямой ускоренный, высокочувствительный, специфичный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша — LAMP-вариант; получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2 007 147 797/13 (52 390).

Впервые разработан молекулярно-генетический способ дифференцирования штаммов C. diphtheriae по принадлежности к биовару; получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2 007 140 879/13(44 745).

Теоретическая значимость

Новые знания о генетической структуре возбудителей коклюшной и дифтерийной инфекций, об измененных нуклеотидных последовательностях и мутациях в генетических детерминантах факторов патогенности штаммов B. pertussis и C. diphtheriae являются обоснованием для создания новых вакцинных препаратов, в первую очередь, при коклюшной инфекции, на основе современных штаммов B. pertussis. Установленные факты имеют значение для формирования новых подходов в системе мониторинга и ускоренной лабораторной диагностики возбудителей коклюша и дифтерии, основанных на выборе генетических «мишеней» и на современных амплификационных технологиях. Данные о генетической гетерогенности штаммов свидетельствуют о резерве изменчивости, лежащем в основе механизмов формирования адаптаций микроорганизмов к меняющимся условиям существования и сохранению B. pertussis и C. diphtheriae как биологических видов.

Практическая значимость

Пополнена уникальная коллекция штаммов B. pertussis и С. diphtheriaе, позволяющая проводить многоплановые исследования возбудителей коклюша и дифтерии с целью создания новых препаратов и биотехнологий, направленных на совершенствование лабораторной диагностики и средств иммунопрофилактики при этих инфекциях.

Подобраны штаммы B. pertussis, вызывающие заболевание коклюшем на современном этапе эпидпроцесса, с новой генетической структурой основных факторов патогенности, как кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов.

Новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе ПЦР-ПДРФ позволяет определять штаммы с измененной структурой ptxА гена коклюшного токсина для наблюдения за циркулирующей на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции популяцией B. pertussis.

Прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша LAMP-вариант выявляет возбудителя заболевания непосредственно из клинического материала больного без выделения «чистой» культуры в течение 9 — 10 часов. Клинические испытания метода показали его высокую специфичность (100%), высокую чувствительность (10³ м.кл.) и высокую диагностическую эффективность (84,9% ± 4,9% (р < 0,001), по сравнению с бактериологическим методом, эффективность которого не превышала 22,7% ± 5,7% (р < 0,001). Использование LAMP-варианта расширило возможности обследования больных с различной тяжестью клинического течения болезни, в различные сроки от начала заболевания, начиная с ранних сроков, а также при обследовании детей до 1 года, детей с коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции, в первую очередь, в детских специализированных учреждениях.

Способ дифференциальной диагностики C. diphtheriae позволяет определять принадлежность к биовару по более специфичному, по сравнению с биохимической идентификацией, признаку — нуклеотидной последовательности в amy гене, что является одним из этапов в создании новых мультиплексных тест-систем для выявления возбудителя дифтерии при обследовании больных с подозрением на дифтерию и для своевременного проведения противоэпидемических мероприятий в очаге.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты проведенных исследований послужили основой для лекций и практических занятий на курсах сертификации и повышения квалификации для врачейбактериологов «Актуальные вопросы медицинской микробиологии», проводимых на базе ФГУН «МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора» (2000 г.; 2004 г.; 2005 г.; 2006 г.); семинара «Биологические свойства возбудителя коклюша и лабораторная диагностика» для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ г. Москвы на базе ФГУЗ ЦГиЭ (г. Москва) (2008 г.); семинара по лабораторной диагностике дифтерии для врачей-бактериологов филиалов ФГУЗ ЦГиЭ Центрального федерального Округа Российской Федерации, проводимого в рамках программы Всемирной Организации Здравоохранения (2002 г.) и были использованы при составлении следующих пособий, рекомендаций и информационного письма (совместно с сотрудниками лаборатории):

• 1. Пособие для врачей «Характеристика Corynebacterium diphtheriae, циркулирующих в России в период 1984 — 1998 гг. (микробиологический мониторинг в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией)».
• 2. Методические рекомендации «Ускоренные методы лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции».
• 3. Пособие для врачей «Нетоксигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, несущие ген дифтерийного токсина».
• 4. Пособие для врачей «Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae».

Патенты на изобретения (в соавторстве):

• 1. Патент на изобретение «Способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis» № 2 299 908 от 27 мая 2007 г.
• 2. «Способ дифференцирования штаммов C. diphtheriae»; положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2 007 140 879/13(44 745).
• 3. «Набор и ускоренный способ лабораторной диагностики коклюша»; положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2 007 147 797/13 (52 390).

Штаммы B. pertussis — кандидаты для конструирования перспективных вакцинных препаратов переданы в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН.

Разработанные методы ускоренной лабораторной диагностики коклюша и дифтерии внедрены в практическую работу отделений № 2 и № 20 ИКБ № 1 (г. Москва).

Основные положения, выносимые на защиту:

• 1. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов B. pertussis выявил особенности циркуляции возбудителя коклюша в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции и изменения в распространении штаммов, несущих «вакцинные» и «невакцинные» аллели генов патогенности, ответственных за коклюшный токсин, пертактин и фимбриальные белки.
• 2. У штаммов B. pertussis, циркулирующих на современном этапе развития эпидемического процесса коклюшной инфекции, произошли изменения структуры генов, кодирующих основные факторы патогенности коклюшного микроба — коклюшного токсина (ptxА ген), пертактина (prn ген) и фимбриальных белков (fim2 и fim3 гены), и отмечается усиление их вирулентных свойств. Структура основных генов патогенности штаммов B. pertussis, используемых в нашей стране для производства АКДС-вакцины, не соответствует структуре этих генов современных штаммов B. pertussis, вызывающих заболевание коклюшем.
• 3. Мутационные изменения происходят в структурном tox гене дифтерийного токсина C. diphtheriae — циркулируют штаммы с незначительными единичными мутациями, не приводящими к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина. Распространения штаммов C. diphtheriae с измененной структурой этого гена (в положении 1252), приводящей к замене аминокислот, не произошло. Определена последовательность нуклеотидов, являющаяся генетической детерминантой дополнительного фактора патогенности C. diphtheriae, не связанного с токсином, — amy геном, ответственным за амилазную активность.
• 4. Новые знания о структуре генетических детерминант, кодирующих основные факторы патогенности штаммов B. pertussis и C. diphtheriae, позволили подобрать специфические «мишени» (нуклеотидные последовательности ДНК) и разработать на их основе новые молекулярно-генетические методы — мониторинга штаммов B. pertussis и лабораторной диагностики коклюша и дифтерии для ускоренного выявления возбудителей этих болезней непосредственно в клиническом материале.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ФГУН «МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора», протокол № 6 от 23 октября 2008 г. Основные результаты исследований представлены и доложены на 4-х Российских и 15-ти международных конференциях: съездах Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002; 2007); Российских научно-практических конференциях «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (Москва, 2000), «Вакцинология — 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2006); на международных конференциях «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1998; 2003; 2008); на Международных совещаниях Международной лабораторной рабочей группы ВОЗ по дифтерии и проекта по контролю за дифтерией в странах Европейского Союза (International meetings of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network, DIPNET — Халхидики, 1998; Брюссель, 2000; Вена, 2002; Копенгаген, 2004; Вольягмени, 2006; Ларнака, 2008).

Основное содержание работы отражено в 40 научных публикациях.

Работа выполнялась в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Эпидемиология, микробиология», Федеральной целевой программы «Предупреждение и борьба с социально значимыми заболеваниями (2007 — 2011 годы)», подпрограммы «Вакцинопрофилактика», Международных проектов IncoCopernicus, INTAS, Международного научно-технического центра (МНТЦ), деятельности Международной Лабораторной Рабочей Группы ВОЗ по Дифтерии.

Объем и структура диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы и четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Библиография включает 473 наименований работ, в том числе отечественных — 167 и зарубежных — 306 авторов. Общий объем диссертации составляет 292 страницы машинописного текста. Текст иллюстрирован 25 таблицами и 48 рисунками.