Обсуждение. 
Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами

Открытие стволовых клеток в нервной ткани вызвало переоценку целого ряда представлений, особенно для восстановительных процессов в центральной нервной системе. Стволовые нервные клетки идентифицируют по молекулярным маркерам, которые отражают стадии их развития: это нестин — для стволовой клетки, виментин — для клетки-предшественника, бета-III-тубулин — для нейробласта, GFAР — для клетки, развивающейся по глиальному пути и ряд других маркеров. Наличие таких маркеров позволило выявить популяционную гетерогенность первичных культур фетальных нейральных клеток. Например, типичное процентное распределение специфических иммуногистохимических маркеров в популяции фетальных стволовых нервных клеток человека следующее: нестин — 43,1%, виментин — 63,2%, бета-тубулин — 70,1%, GFAP — 3,2%, NCAM — 12,0%, CD34 — 1,3%, CD45 — 0,5%. Подобная гетерогенность в какой-то степени определяет специфику реакции стволовых клеток на различного рода внешние воздействия — в частности, изменение соотношения клеток с различным потенциалом отражается на характере их дифференцировки при попадании в различную микросреду. Например, повышенное содержание нестин-содержащих клеток будет способствовать повышению эффективности воздействия микроокружения на их дифференцировку.

Одной из задач работы являлся поиск генетического способа управления дифференцировкой нейральных стволовых клеток в условиях их культивирования и трансплантации. Эта проблема важна в теоретическом плане, поскольку приближает нас к пониманию сущности клеточной дифференцировки. Кроме того, решение этой проблемы позволит получать популяции клеток, дифференцирующихся в нужном для клеточной терапии направлении.

Существуют три способа воздействия на дифференцировку клеток: а) добавление кондиционной среды; б) добавление к культуральной среде факторов, активирующих дифференцировку; и в) трансфекция культивируемых клеток генами, которые кодируют факторы, индуцирующие дифференцировку. В случае нервной ткани этими факторами являются нейротрофические факторы. В данной работе изучается третий способ воздействия.

Критическое значение для экспрессии трансфицированного гена имеет правильный выбор промотора. Желательно, чтобы он был регулируемым, например, мог бы активироваться при температуре тела человека или активироваться только при более высокой тепературе не выходящей за физиологические пределы.

При создании наших базовых генетических конструкций в качестве управляющего элемента мы применили п/р область гена hsp70 дрозофилы. Нами были выяснены основные вопросы, касающиеся функционирования полученных нами конструкций, содержащих нейротрофические факторы под контролем упомянутой п/р области в клетках и тканях дрозофилы и млекопитающих, включая человека.

При исследовании полученных нами трансгенных линий дрозофилы, содержащих гены нейротрофических факторов человека — NGF, GDNF и BDNF под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы было показано, что нейротрофические гены млекопитающих экспрессируются в тканях дрозофилы находясь под неродственным промотором. Как и предполагалось, экспрессия данных генов оказалась температурно-зависимой. Полученные трансгенные линии дрозофилы характеризуются высокой транскрипционной активностью человеческих генов gdnf, ngf и bdnf в условиях теплового шока — при 37оС. Наличие экспрессии чужеродных белков подтверждена гибридизацией in situ, методом иммуноблотинга. Действие этих белков на окружающие клетки и ткани исследованы при трансплантации клеток дрозофилы в мозг крыс и при кокультивации их с клетками и органотипическими культурами нервных тканей животных и человека. В этих экспериментах во фрагментах эмбриональной эктодермы трансгенных линий дрозофилы активировался синтез трансдуцированных нейротрофических факторов и маркерных белков, обусловленный температурным воздействием среды по сути хит-шоковым для тканей насекомых. Продуцируемые факторы оказывали нейротрофное воздействие на окружающие ткани млекопитающих.

В результате исследований по ко-культивации, была получена модель, в которой эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, будучи источниками синтеза нейротрофического фактора, стимулируют рост нейральных отростков у ко-культивированных эмбриональных, нервных клеток в строго заданном направлении. Интересно, что волокна млекопитающих не просто росли, но и вступали в контакт с нейральными тканями такого отдаленного таксона как дрозофила. Разработанная экспериментальная модель может быть полезна для дальнейших исследований действия трансдуцированных белковых факторов и сигнальных молекул на ткани и клетки подопытных животных и человека.

Одно из важнейших открытий в области транспланталогии, сделанное Л. И. Корочкиным, заключается в обнаружении выживаемости нервных клеток дрозофилы в нервных тканях амфибий и млекопитающих. Корочкин и Савельев с соавторами (1991) обнаружили, что нерные эмбриональные клетки дрозофилы образуют связи с клетками реципиента, т. е. встраиваются в нервную ткань хозяина. Причем, в тканях мозга амфибий данные клетки существовали длительное время, а в мозге млекопитающих исчезали в течение месяца, замещаясь нервными клетками хозяина. Такие характеристики ксенотрансплантата представляются нам крайне привлекательными для использования клеток дрозофилы в качестве носителей терапевтических трансгенов. Такие клеточные векторы позволят вносить необходимые гены в область поражения нервной системы с возможностью уменьшения уровня реактивного глиоза и последующим замещением нервных клеток дрозофилы на нервные клетки хозяина. На основе данной идеи в данной работе были построены эксперименты по ксенотрансплантации, с целью поиска решения проблемы восстановления нервных тканей млекопитающих.

Опыты с ксенотрансплантацией в мозг крысы нейральной ткани эмбриона трансгенной дрозофилы линии С3−1М (gdnf) в смеси с нервной тканью эмбриона крысы показали, что экспрессирующийся в ткани мухи тарнсдуцированный фактор выделяется в окружающюю ткань и оказывает трофическое воздействие на ткань реципиентного мозга и котрансплантированные фетальные клетки крыс. Полученные результаты свидетельствуют об успешном развитии котрансплантатов, состоящих из эмбриональных клеток неокортекса крыс и нейральных закладок дрозофилы, экспрессирующих GDNF, при их пересадке в мозг взрослых млекопитающих.

Морфологическое изучение показало, что в случаях такой ко-трансплантации наблюдается хорошая приживляемость трансплантата и резкое снижение гибели ко-трансплантированных фетальных клеток крыс. Хорошая выживаемость клеток трансплантата может быть отражением нейропротективной функции выделяемого тканью мухи GDNF, в результате чего сохраняется значительная часть тех клеток, которые погибли бы вследствие апоптоза. Помимо хорошей выживаемости ко-трансплантаты отличались тем, что содержали множество крупных сосудов, не типичных для окружающего трансплантат неокортекса крысы. Интересно отметить, что такой интенсивной васкуляризации не наблюдается в обычных аллотрансплантатах фетальной, нервной ткани в кору крыс. На этом основании можно предположить, что ангиогенный эффект обусловлен присутствием в трансплантате ксеногенной ткани дрозофилы. Усиленную васкуляризацию могут вызывать факторы, выделяемые ксеногенными клетками, в том числе возможно и трансдуцированный GDNF.

Было показало, что ткани трансгенных нейральных закладок дрозофилы не отделяются от окружающих крысиных клеток глиальным барьером. Более того, в ряде случаев видны тесные межклеточные взаимодействия, свидетельствующие об отсутствии межвидового антогонизма, значительная часть клеток нейральных закладок трансгенной дрозофилы сохраняется в жизнеспособном состоянии и экспрессирует тирозингидроксилазу в течение всего времени эксперимента.

По всей видимости, и другие белки дрозофилы также принимают активное участие в процессе приживления. Одним из таких белков является белок теплового шока HSP70 дрозофилы. Этот факт был подтвержден в экспериментах по ксенотрансплантации в мозг крыс эмбриональных, нервных клеток дрозофилы линии Oregon, меченой lacZ и эмбриональной, нервной ткани мутанта ts403, утратившего способность к синтезу HSP70. В этих экспериментах показано, что белок теплового шока Hsp70 снижает образование рубцовой ткани вокруг ксенотрансплантата эмбриональных, нервных клеток дрозофилы.

Важно отметить, что раздельное действие белка теплового шока (в экспериментах с мутантами ts403) и нейротрофического фактора (в экспериментах с клетками трансфицированными HEK293) приводило лишь к ослаблению рубцевания, в то время как совместное действие GDNF и HSP70 (в экспериментах с трансгенными линиями мух) приводило к полной редукции рубца. Так как при трансплантации клетки дрозофилы попадают в среду поддерживающую температуру теплового шока для дрозофилы, то вероятно, что именно комбинация экспрессий нейротрофического фактора и активированного белка теплового шока дает столь положительную динамику приживления трансплантата и обуловленное этим подавление глиоза.

Наши исследования показали, что присутствие трансгенных клеток дрозофилы в составе клеточного терапевтического препарата может оказывать протективное, трофическое и антиглиозное действие на трансплантируемые клетки и на клетки окружающие ткани мозга реципиента. Перспективность использования клеточных препаратов с добавлением трансгенных клеток дрозофилы обусловлена на наш взгляд сочетанием нескольких факторов, принципиально недоступным в чистых аллоили аутотрансплантатах. В настоящее время получение клеточных препаратов носителей трансгенных белков на основе клеток млекопитающих возможно только с использованием линейных клеток или при помощи вирусных конструкций. Применение и тех и других в клинике опасно. Аутологичные или аллогенные клеточные препараты в сочетании с клетками дрозофилы в качестве носителя трансгена не несут вирусных генетических конструкций. Клетки дрозофилы обеспечивают эффективную доставку и экспрессию терапевтического трансгена в сочетании с протективным белком теплового шока Hsp70, действие которого показано в нашей работе. Продолжительность этого действия, как и действия трансгена, ограничена продолжительностью жизни клеток дрозофилы в условиях тканей реципиента и составляет 1 месяц. Этого времени во многих случаях достаточно для действия факторов, выживания и интеграции котрансплантированных аутологичных или аллогенных клеток в ткань мозга реципиента и для возможного замещения дегенерировавших нейронов. Такой сценарий терапевтического воздействия может быть оптимален для лечения многих патологических процессов.

Результаты исследования тканей линий дрозофилы содержащих гены нейротрофических факторов млекопитающих под контролем п/р области гена hsp70 дрозофилы показали целесообразность использования этого промотора для трансформации стволовых клеток человека, которые в дальнейшем могут быть использованы в экспериментах по нейротрансплантации, а возможно и в нейрохирургических операциях.

Также в нашей работе были получены конструкции, несущие гены нейротрофических факторов, для использования их непосредственно в клетках млекопитающих. Полученные нами генные конструкции, содержащие гены нейротрофических факторов, были трансдуцированы в клетки человека линии HEK293, в эмбриональные клетки мышей и в клетки фетального мозга человека.

При исследовании полученных трансгенных клеточных препаратов было обнаружено, что ко-культивация эмбриональной, нервной ткани фрагмента зачатка спинного мозга, получившей повреждения, с клетками линии НЕК293, экспрессирующими NGF, стимулирует образование нервных отростков у поврежденной ткани. При ко-культивации клеток линии НЕК293, продуцирующих GDNF, со спинальным ганглием новорожденного крысенка наблюдалось активное образование нервных отростков клеток спинального ганглия в сторону трансгенных клеток уже в течение первых двух часов в отличие от контроля, где отростки образовывались через 2−3 суток и в разных направлениях.

Также было показано, что при трансплантации эмбриональных НЕК293 клеток, трансфицированных генами gdnf в мозг крысы, присутствие GDNF снижает образование рубцовой ткани. В отличие от модели с клетками дрозофилы, клетки НЕК293, являясь клетками человека, в мозге млекопитающих находятся в более комфортных условиях. В результате мы не наблюдали исчезновения данных клеток с течением времени. Однако, в отличие от разрастания данной трансгенной культуры при культивации, при трансплантации трансплантат оставался нормальных размеров, что подтверждает известный факт отсутствия туморигенности у клеток линии НЕК293.

Полученные результаты свидетельствуют о возможности длительного переживания в мозгу мышей реципиентов клеток линии НЕК293, содержащих чужеродные гены. Отсутствие миграции трансплантированных клеток может быть следствием значительных фенотипических различий между трансплантированными клетками линии НЕК293, которая была получена из клеток эмбриональной почки человека, и окружающей тканью мозга реципиента. Не найдено также признаков трансформации фенотипа трансплантированных клеток в мозгу реципиента.

Результаты подтверждают перспективность применения трансгенного GDNF в качестве нейропротектора в тканевой терапии. Дальнейшее совершенствование техники невирусной трансдукции терапевтических генов в клетки млекопитающих позволят создавать эффективные клеточные препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний.

При исследовании клеток млекопитающих, трансфицированных конструкциями с маркерными белками под управлением п/р области гена hsp70 дрозофилы было обнаружено, что п/р область способна активировать чужеродный ген в клетках млекопитающих. Данная п/р область выгодно отличается от ранее известных, так как обладает высокой активностью, не имеет вирусной природы и ее активность можно регулировать, двумя разными способами: температурным воздействием (39oC) и с помощью белка Hsp83. Полученный вектор можно активизировать температурой 39оС и включение промотора может быть многократным. Данные результаты являются новыми, так как ранее утверждалось, что исследуемый промотор в клетках млекопитающих активизируется при 42 °C, что крайне травматично для клеток, и снижает возможности использования данного промотора в практике (Glazenburg K et.al.1992, Roigas J. et.al.1997).

Таким образом, получена модель для регулирования активности чужеродного гена в клетках млекопитающих. Также было обнаружено, что при введении голой ДНК вектора Lp1, несущего комплекс hsp70-GFP в мозг мыши, наблюдалась трансфекция клеток мозга причем активация вводимого гена gfp под контроле промотора hsp70 обнаруживалась при температуре тела млекопитающих (37оС). По всей видимости, в данном случае наблюдается воспалительный процесс, обсловленный травмированием инъекционной иглой, который и запускает активацию исследуемого промотора.

Использование п/р области гена hsp70 дрозофилы в качестве элемента управления экспрессией терапевтического трансгена дает возможность регулировать экспрессию чужеродного гена в трансплантате. При этом можно стимулировать гиперэкспрессию, с последующим снижением продуцирования трансгенного фактора.

Таким образом, нами были разработаны две клеточные системы экспрессии нейротрофических факторов для трансплантации трансгенных клеток или тканей в мозг млекопитающих. Для первой из них донорами факторов являются клетки дрозофилы. Эта система обладает рядом преимуществ, а именно: трансгенные клетки дрозофилы быстро образуют связи с клетками мозга реципиента; препятствуют образованию глиального рубца на границе тканей трансплантат — реципиент и короткий срок жизни трансгенных клеток (менее месяца). Данная система привлекательна для терапии заболеваний требующих локального и кратковременного действия нейротрофных факторов.

Вторая клеточная система на основе трансгенных линий клеток человека способна снабжать поврежденный участок мозга млекопитающих нейротрофным фактором длительное время, поскольку эти клетки способны долго жить после трансплантации. При экспрессии клетками нейротрофического фактора было показано резкое снижение (но не полное отсутствие как для первой системы) глиоза. По-видимому, обладая ярко выраженными ксеногенными свойствами трансгенные эмбриональные, нервные клетки дрозофилы, в отличие от клеток человека, не вызывают межклеточной реакции на границе двух тканей при трансплантации.

Таким образом, обнаружено, что сочетание белка теплового шока и нейротрофического фактора блокирует образование глиального рубца, повышая при этом приживаемость трансплантата и его васкуляризацию.

На основании полученных данных напрашиваются некоторые практические рекомендации для использования в нейрохирургической практике. Суть их заключается в предложении изыскать способы мобилизации белка Нsp70 и введения нейротрофических генов при нейротрансплантациях. Таких способов несколько: 1. можно добавлять белок Нsp70 и нейротрофический фактор к трансплантату перед операцией, 2. можно активировать синтез белка в трансплантате посредством предварительного прогревания трансплантата при температуре, вызывающей тепловой шок, и при этом добавлять нейротрофический фактор с трансплантацией, 3. можно трансформировать используемую для трансплантации культуру, введя в ее геном гены, кодирующие белок Нsp70 и нейротрофический фактор.