Гаметная и зиготная селекция растений

Гаметофитный отбор в качестве метода селекции предложен недавно. Теоретически он был основан Д. Малкэхи в 1979 году. Автор высказал мысль, что отбор микрогаметофитов, устойчивых к какомулибо экстремальному фактору, может обеспечить появление спорофитов со сходной устойчивостью.

Важный вклад в развитие исследований по гаметной и зиготной селекции был внесен школой академика А. А. Жученко в Молдавии (А.В. Кравченко, В. А. Лях, Н. Н. Балашова и др.). Отбор по гаметофиту не предполагает обязательного использования техники культивирования in vitro, хотя для оценки параметров пыльцы используют специальные среды. Однако учитывая, что отбор на уровне гаметофита происходит путем элиминации одной или группы клеток, его можно отнести к методам, весьма близким к клеточной селекции in vitro.

С чем связана потребность в методах гаметной селекции? Традиционным для селекционера является отбор на уровне спорофита. Между тем в онтогенезе растений на репродуктивных фазах развития происходит интенсивная элиминация нетрадиционных рекомбинантных генотипов, носящая характер стабилизирующего отбора. До стадии взрослого растения доходит только очень малая часть генотипов. Согласно данным А. А. Жученко, А. Н. Кравченко, у некоторых межвидовых гибридов томата на стадиях гаметогенеза, сингамии, эмбриогенеза, формирования и прорастания семян гибнет свыше 90% рекомбинантных гамет и зигот. Этот процесс в большинстве случаев не контролируется селекционером и протекает в условиях культивирования генотипов F_1.

На этапе развития споры и начала формирования гаметофита (особенно мужского) элиминируется 30−40% и более рекомбинантов. Значительная элиминация отмечается на этапах зрелой пыльцы, начала ее прорастания и роста пыльцевых трубок, оплодотворения, развития зародыша, формирования и прорастания семян. Полученный фактический материал свидетельствует, что селективная элиминация происходит на всех названных критических этапах, в первую очередь «нетрадиционных» рекомбинантов, что приводит к значительному сужению спектра генетической изменчивости и отбору рекомбинантов, лишь незначительно уклоняющихся от исходных генотипов (фиксируются адаптивные формы) в результате действия стабилизирующего естественного отбора.

В эволюционном плане гаплоидное поколение всегда подвергалось более жесткому отбору, чем диплоидное. Это привело к реакции «избежания» гаплоидного гаметофита из-под действия отбора за счет сокращения продолжительности гаплоидной фазы, упрощения строения гаметофита, перемещения его под защиту спорофитного организма.

Особенное значение элиминация генотипов имеет при отдаленной гибридизации. Она сужает спектр доступной генетической изменчивости в селекционной практике, требует разработки принципиально новых методов и подходов, основанных на индуцировании генетической рекомбинации, сохранении рекомбинантных гамет и зигот, повышении эффективности отбора нужных генотипов в расщепляющихся популяциях.

Гаметная селекция имеет ряд преимуществ в сравнении с традиционными методами отбора:

• 1. Селекционер оперирует с пыльцой или женским гаметофитом, причем в первом случае число генотипов, подвергаемых отбору, исчисляется миллионами. В одной метелке кукурузы до 25 млн. пыльцевых зерен;
• 2. Малый размер пыльцы позволяет выполнять отбор в лабораторных условиях, используя для этого регулируемые условия среды (фитотрон, теплица), анализировать небольшое количество растений;
• 3. Гаплоидный генотип гаметофита дает возможность обнаружить редкие рецессивные аллели, выявить сбалансированность генома;
• 4. Гаплоиды более уязвимы для действия факторов среды, что позволяет вести отбор на устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам;

Гаметная селекция выполняется на уровне:

• 1. Мужских гаметофитов (этапы зрелой пыльцы, прорастания пыльцы и роста пыльцевых трубок.
• 2. Женских гаметофитов.

Наиболее часто используется отбор на уровне мужских гаметофитов.

Главное условие успешного отбора на уровне гаметофита — проявление генов, детерминирующих признак, на уровне гаметофита и спорофита. Рядом авторов при изучении ферментов гаметофита и спорофита показано, что приблизительно 60−70% структурных генов, экспрессирующихся в пыльце, проявляется также в спорофите. Это дает основание вести отбор спорофита по гаметофиту.

Зиготная селекция производится после образования зиготы на различных этапах ее развития вплоть до образования семян.

Цели гаметной и зиготной селекции. Возможны две основные цели селекционного процесса, достигаемых на ранних этапах онтогенеза (рис. 2).

Рис. 2 методы гаметной и зиготной селекции (Жученко, Кравченко, 1986)

1. Расширение спектра генетической изменчивости в результате создания комфортных условий для прохождения развития от спорогенеза до образования семян. В этом случае смягчается действие естественного отбора в его стабилизирующей форме, и большее число редких рекомбинантов проходит через «сито» лимитирующих факторов среды. Среднее значение признака х в популяции после такого отбора не изменяется (Рис. 3).

Рис. 3. Влияние комфортных условий среды в F₁ на расширение спектра рекомбинантов в F₂

2. Отбор устойчивых генотипов. Для этого направления гаметной и зиготной селекции ставится задача направить спектр изменчивости рекомбинантов в желаемое для селекционера русло путем создания стрессовых условий при развитии гамет и зигот (Рис.4). Среднее значение признака в популяции после такого движущего отбора изменяется. Отобранные генотипы более устойчивы к стрессовому фактору.

Рис. 4 Влияние стрессовых условий среды в F₁ на отбор устойчивых генотипов в F₂

Стресс может создаваться путем моделирования абиотических (неоптимальная температура, засоленность), биотических (токсины патогенов) и антропических (поллютанты) факторов среды.

Таким образом, принципиальное отличие методов гаметной и зиготной селекции растений от традиционных подходов в том, что объектом отбора является генотип на ранних стадиях развития, а его пригодность для целей селекции оценивается по реакции на условия среды. В результате можно сохранить уникальные рекомбинанты, возникшие при отдаленной гибридизации, а также изменить генотипическую структуру популяции рекомбинантов в результате гибели неприспособленных генотипов.

Рассмотрим отдельные аспекты методики гаметной и зиготной селекции в зависимости от ее цели на устойчивость генотипов к ботическим и абиотическим факторам.

Методы снижения элиминации генотипов для расширения спектра генетической изменчивости в расщепляющихся поколениях (по А. Н. Кравченко, 1993).

Стимуляция образования спор. Период развития спор, начиная от выхода их из тетрад и до начала формирования гаметофита (первое дифференцирующее деление ядра) у растений довольно длительный и является самым критическим. Поэтому использование различных биологически активных вещества является весьма эффективным. Так, у межвидовых гибридов томата обработка бутонов гибридов F₁ мелангозидом и смесью индолилуксусной кислоты и гиббереллина повышает выход фертильной пыльцы на 22−37%. Кроме биологически активных веществ, на элиминационные процессы на этой стадии влияют температурный фактор и обрыв бутонов в кисти. При анализе структуры популяции наблюдается значительная элиминация рекомбинантных гомозигот по маркерным генам относительно теоретически ожидаемой частоты.

Стимуляция развития и прорастания пыльцы, роста пыльцевых трубок.

При повышении жизнеспособности пыльцы увеличивается ее конкурентоспособность и возможность участия в оплодотворении обычно элиминирующихся рекомбинантных гамет. Стимулирующее действие проявляют химические (витамины В_1, В_6,ИУК, гиббереллины, пыльца других растений, стероидные гликозиды) и физические факторы (Х-лучи, ультрафиолет, видимый свет, пониженные температуры). При нанесении биологически активных веществ на рыльце пестика перед опылением повышается число пыльцевых трубок, дорастающих до завязи, что приводит к значительному расширению спектра генетической изменчивости.

Стимуляция женского гаметофита. При обработке завязей гибридов томата F₁ биологически активными веществами на этапе формирования зародышевого мешка наблюдается повышение осемененности в 1.5−1.8 раза. Еще более эффективным (в два раза) оказывается снижение элиминации рекомбинантов при обрыве бутонов в кисти, что способствует перераспределению эндогенных питательных веществ и выживанию маложизнеспособных генотипов. Таким образом, женские гаметофиты гибридов F₁ так же, как и мужские, различаясь по жизнеспособности и устойчивости, способны дифференцированно реагировать на эндогенные и экзогенные стимулирующие и стрессовые факторы, изменяя соотношение генотипов в F_2.

Стимуляция эмбриогенеза и развития семян. Выращивание зародышей межвидовых гибридов томата in vitro снижает селективную элиминацию рекомбинантов. На этапе эмбриогенеза у межвидовых гибридов томатов происходит естественный отбор против рецессивных гомозигот.

Обработка семян гиббереллином, борной, янтарной, никотиновой кислотами снижает частоту элиминации рекомбинантных генотипов в популяциях, что необходимо использовать для расширения спектра генетической изменчивости.

Такой отбор проводится на этапах развития организма от формирования спор до образования семян, однако задача этого подхода диаметрально противоположна предыдущей — создание стрессовых условий для отбора устойчивых генотипов. Такие условия создаются в фитотронах или непосредственно в поле. Успех такой селекции возможен только при тесной связи в проявлении устойчивости на уровне гаметофита и спорофита. При этом возможны два подхода для селекции:

• 1. Экспресс-оценка устойчивости генотипа на ранних стадиях онтогенеза (в т.ч. по гаметофиту).
• 2. Прямая селекция по устойчивости генотипов.

Интересно отметить, что второй вариант может проявляется и в естественных условиях при заражении растений болезнью, что может вызвать экспрессию генов у мужского гаметофита по устойчивости к патогену.

Чаще всего объектом такой селекции является пыльца на различных этапах развития, которая подвергается стрессовому воздействию (неоптимальные температуры, действие солей, токсикантов, фитопатогенов и др.). Например, для отбора на устойчивость к фузариозу капелька раствора фузариевой кислоты наносится на рыльце пестика перед опылением. Ряд исследователей успешно применяли отбор на уровне пыльцы с целью улучшения спорофитного поколения. Таким образом была повышена устойчивость растений к высоким и низким температурам, фитопатогенам, засолению, токсическим продуктам, гербицидам и др.

Отбор гамет и зигот необходимо рассматривать не только в качестве метода, но и цели селекции. Экспериментально доказана эффективность гаметофитного отбора на повышение устойчивости репродуктивной системы томата к повышенным и пониженным температурам. (Жученко и др, 1983). Очевидно, что повышение фертильности пыльцы и ее оплодотворяющих возможностей в стрессовых условиях играют важную роль в обеспечении стабильно высоких урожаев растений.

Эффективность гаметной селекции на устойчивость стрессам может быть повышена при сочетании с отбором по спорофиту. Так, А. В. Кильчевским, И. Г. Пугачевой (2001) предложен вариант циклической селекции томата по гаметофиту и спорофиту на устойчивость к пониженным температурам.

Таким образом, методы гаметной и зиготной селекции значительно расширяют возможности селекционеров по сохранению редких рекомбинантов, а также отбору генотипов, устойчивых к абиотическим и биотическим факторам среды. Несомненным преимуществом этих методов является их простота и доступность.