Список литературы. 
Белки: история исследования, химический состав, свойства, биологические функции

В.Т. Иванов, А.Н. Шамин. Путь к синтезу белка. Ленинград: Химия, Ленинградское отделение, 1982 г.

Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1998 г.

Р. Марри, Д. Греннер. Биохимия человека. Т. 1−2. М.: Мир, 1993 г.

А. Уайт, Ф. Хендлер. Основы биохимии. Т. 1−3. М.: Мир, 1981 г.

Б. Албертс, Д. Брей. Молекулярная биология клетки. Т. 1−3. М.: Мир, 1994 г.

Г. Шульц, Р. Ширмер. Принципы структурной организации белков. М.: Мир, 1982 г.

А.О. Рувинский, В. К. Шумной. Общая биология. М.: Просвещение, 1995 г.

Н.Н. Приходченко, Т.П. Шкурат. Основы генетики человека. Ростов_на-Дону: Феникс, 1997 г.

В.Н. Ярыгин. Биология. Т. 1−2. М.: Высшая школа, 1999 г.

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение I

Приложение II.

Открытие аминокислот в составе белков.

Приложение III

Цветные реакции на белки

Цветные реакции применяются для установления белковой природы веществ, идентификации белков и определение их аминокислотного состава в различных биологических жидкостях. В клинической лабораторной практике эти методы используются для определения количества белка в плазме крови, аминокислот в моче и крови, для выявления наследственных и приобретенных патологий обмена у новорожденных.

Биуретовая реакция на пептидную связь

В основе ее лежит способность пептидных связей (- CO-NH-) образовывать с сульфатом меди в щелочной среде окрашенные комплексные соединения, интенсивность окраски которых зависит от длины полипептидной цепи. Раствор белка дает сине-фиолетовое окрашивание.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р (белок куриного яйца фильтруют через марлю и разводят дист-ой водой 1:10); 2) NaOH, 10% р-р; 3) Cu (OH)₂, 1% р-р.

Ход определения. В пробирку вносят 5 капель р-ра яичного белка, 3 капли NaOH, 1 каплю Cu (OH)₂, перемешивают. Содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовое окрашивание.

Нингидриновая реакция

Сущность реакции состоит в образовании соединения, окрашенного в сине-фиолетовый цвет, состоящего из нингидрина и продуктов гидролиза аминокислот. Эта реакция характерна для аминогрупп вположении, присутствующих в природных аминокислотах и белках.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) нингидрин, 0,5% водный р-р.

Ход определения. В пробирку вносят 5 капель р-ра яичного белка, затем 5 капель нингидрина, нагревают смесь до кипения. Появляется розово-фиолетовое окрашивание, переходящее с течением времени в сине-фиолетовое.

Ксантопротеиновая реакция

При добавлении к р-ру белка конц-ой азотной к-ты и нагревании появляется желтое окрашивание, переходящее в присутствии щелочи в оранжевое. Сущность реакции состоит в нитровании бензольного кольца циклических аминокислот азотной к-ой с образованием нитросоединений, выпадающих в осадок. Реакция выявляет наличие в белке циклических аминокислот.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) конц. азотная к-та; 3) NaOH, 10% р-р.

Ход определения. К 5 каплям р-ра яичного белка добавляют 3 капли азотной к-ты и (осторожно!) нагревают. Появляется осадок желтого цвета. После охлаждения добавляют (желательно на осадок) 10 капель NaOH, появляется оранжевое окрашивание.

Реакция Адамкевича

Аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот, образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.

Реактивы: 1) неразбавленные яичный белок, 2) конц. (ледяная) уксусная к-та; 3) конц. серная к-та.

Ход определения. К одной капле белка прибавляют 10 капель уксусной к-ты. Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют по каплям 0,5 мл серной к-ты так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей появляется красно-фиолетовое кольцо.

Реакция Фоля

Аминокислоты, содержащие сульфгидрильные группы — SH, подвергаются щелочному гидролизу с образованием сульфида натрия Na₂S. Последний, взаимодействуя с плюмбитом натрия (образуется в ходе реакции между ацетатом свинца и NaOH), образует осадок сульфида свинца PbS черного или бурого цвета.

Na₂S + Na₂PbO₂ + 2H₂O PbS + 4NaOH.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) реактив Фоля (к 5% -р-ру ацетата свинца прибавляют равный объем 30% р-ра NaOH до растворения образовавшегося осадка).

Ход определения. К 5 каплям р-ра белка прибавляют 5 капель реактива Фоля и кипятят 2−3 мин. После отстаивания 1−2 мин появляется черный или бурый осадок.

Приложение IV

Реакции осаждения белков

Белки в р-ре и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и освобождения от них с целью получения безбелкового р-ра.

Обратимое осаждение

Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов обратимого осаждения белков является высаливание.

Высаливание. Насыщенным р-ом сульфата аммония осаждается альбуминовая фракция белков, полунасыщенным р-ром — глобулиновая фракция.

Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.

Реактивы: 1) неразведенный яичный белок; 2) насыщенный р-р сульфата аммония; 3) NaOH, 10% р-р, 4) CuSO₄, 1% р-р; 5) дистл-ая вода; 6) сульфат аммония в порошке.

Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразв-го яичного белка и добавляют равное количество насыщенного р-ра сульфата аммония. Содержимое пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный р-р сульфата аммония, при этом глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в р-ре. Последнюю отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не прекратится раств-ие соли, при этом выпадает осадок — глобулины.

Необратимое осаждение белков

Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков (вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения белков можно вызвать кипячением, действием конц. р-ров минеральных и органических к-т, солями тяжелых металлов.

Осаждение при кипячении

Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50−60С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствми — в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных р-рах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором — отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в р-ре.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) уксусная к-та, 1% и 10% р-ры; 3) NaOH, 10% р-р.

Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель р-ра яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом р-р мутнеет, но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают. Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства (его изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% р-ра уксусной к-ты и нагревают до кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его р-р приближается к изоэлектрической точке и белок теряет заряд (один из факторов устойчивости белка в р-ре); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% р-ра уксусной к-ты и нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы белка приобретают положительный заряд (сохраняется один из факторов устойчивости белка в р-ре); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю р-ра NaOH, нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде отрицательный заряд белка увеличивается.

Осаждение концентрированными минеральными к-тами

Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.) вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в р-ре (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и серной к-т выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного их гидролиза. При добавлении избытка азотной к-ты растворения осадка не происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при клинических исследованиях применяется азотная к-та.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) конц. серная к-та; 3) конц. хлористоводородная к-та; 4) конц. азотная к-та.

Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной серной, хлористоводородной и азотной к-т. затем, наклонив пробирку под углом 45, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и хлористоводородной к-тами, в пробирке с азотной к-ой растворения белка не происходит.

Осаждение органическими к-ами

Трихлоруксусноая к-та осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой к-ой пользуются при определении белка в моче.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) трихлоруксусная к-та, 10% р-р; 3) сульфосалициловая к-та, 10% р-р.

Ход определения. В две пробирки вносят по 5 капель р-ра белка. В одну из них прибавляют 2 капли сульфосалициловой к-ты, а в другую — 5 капель трихлоруксусной к-ты. В пробирках выпадает осадок белка.

Осаждение белка солями тяжелых металлов

Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка. Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.

Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) сульфат меди, 10% р-р; 3) ацетат свинца, 5% р-р; 4) нитрат серебра, 5% р-р.

Ход определения. В три пробирки вносят по 5 капель белка. В первую добавляют 1 каплю ацетата свинца, в третью — 1 каплю нитрата серебра. Во всех пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель нитрата серебра — растворения осадка нет.