Материалы и методы исследований

Материалами для исследования явились 4 образца периферической крови здоровых доноров и 4 образца клеток опухолевого очага больных раком толстого кишечника, предоставленные клиникой Областного онкологического центра им. Семашко г. Нижнего Новгорода.

Ферменты и биопрепараты

Дезоксинуклеозидтрифосфаты в растворе — смесь 4-х дНТФ, по 2 мМ каждого из дНТФ (Fermentas, Латвия); Taq — ДНК полимераза, укомплектованная 10Xбуфером (ООО «Генные и клеточные технологии», Россия, Н. Новгород); M-MuLV обратная транскриптаза, укомплектованная 5Xбуфером (Promega, США).

Выделение тотальной РНК (Chomczynski et al., 1987)

Образцы периферической крови здоровых доноров были помещены в пластиковую пробирку (типа «Eppendorf») и подвергались лизированию.

К 200 мкл лизирующего раствора (6М ГИТЦ, 1% Тритон X100, 100 мМ ацетат Na, pH 7.0, 2% в-меркаптоэтанол) добавлялся такой же объем периферической крови и перемешивался. Затем добавлялось 200 мкл смеси водонасыщенного фенола с хлороформом (1/1 pH 5.0). Смесь интенсивно перемешивалась на миксере «Rotamix RM-1» (ELMI, Латвия). Для разделения фракций проба центрифугировалась на микроцентрифуге «Eppendorf MiniSpinPlus» при 14.5 тыс. об./мин в течение 15 минут.200 мкл водной фазы отбиралось в чистую пробирку, депротеинизированная РНК преципитировалась 200 мкл изопропилового спирта (20−60 минут при -20?С). РНК осаждали центрифугированием на микроцентрифуге «Eppendorf MiniSpinPlus» при 15 тыс об./мин в течение 20 минут. Осадок промывался 800 мкл 75% этанола, центрифугировался 5 минут и сушился при комнатной температуре (или при 60? C в термостате) до исчезновения запаха спирта. Очищенная РНК ресуспендировалась в 20 мкл деионизированной воды, свободной от РНКаз и хранилась в холодильнике при -20?C до использования (не более 2 недель).