Гемоглобинцианидный метод. 
Методы определения концентраций общего гемоглобина в крови человека

Принцип гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну — гемиглобинцианид (то же что и цианометгемоглобин). Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3−5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Основные достоинства гемиглобинцианидного метода:

• 1) HbCN является стабильной производной гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbCN;
• 2) Спектр поглощения HbCN имеет плоский максимум при л= 540 нм, поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;
• 3) Растворы HbCN строго подчинены закону Ламберта-Бера при л= 540 нм в широком диапазоне концентраций;
• 4) Калибровочный раствор HbCN устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет.

Реагенты, необходимые для количественного определения гемоглобина:

Трансформирующий реагент:

Назначение трансформирующих реагентов переводить все формы гемоглобина в гемиглобинцианид. Оптимальный состав и чистота исходных компонентов для трансформирующего раствора, предложенные Van Kampen и Zijlstra, позволяют количественно трансформировать все формы гемоглобина в гемиглобинцианид, получать результаты через 3−5 мин, которые практически не зависят от присутствия белков плазмы крови.

Состав трансформирующего раствора: К3Fe (CN)6, 200 мг; КСN, 50 мг; KH2PO4; 140 мг; неионные детергенты типа Nonic 218, Nonidet P-40, Triton X-100 по 1 мл/л. Все компоненты растворяют и разбавляют до 1 л дистиллированной водой; рН приготовленного раствора должен быть в пределах 7,0−7,4.

Модификации трансформирующего реагента:

Для гемиглобинцианидного метода оптимальный состав трансформирующего реагента указан выше. В некоторых коммерческих наборах реагентов, предназначенных для определения гемоглобина, состав и концентрация исходных компонентов трансформирующего реагента отличаются от оригинала. Так, КСN часто заменяют ацетонциангидрином, KH2PO4 — NаНСО3; во многих наборах детергенты исключены совсем.

Однако, замена рекомендуемых компонентов в определенной концентрации приводит к увеличению времени выхода реакции на устойчивые показатели оптической плотности (20 мин против 5) и меньшему сроку сохранности трансформирующего раствора.

Для устранения влияния некоторых компонентов, присутствующих в крови, в состав трансформирующих реагентов вводят соответствующие добавки.

Введение

липазы устраняет влияние липидов; увеличение концентрации KH2PO4? солей аммония; введение метанола, этанола, этиленгликоля устраняет распад компонентов реагента при его замерзании. Эти добавки не влияют на правильность результатов анализа.

Калибровочный раствор гемиглобинцианида:

При определении гемоглобина трансформирующий реагент только переводит все его формы в стойкое соединение гемиглобинцианид (метгемоглобин), но не определяет точность процедуры измерения гемоглобина. Для гарантии точности метода применяют калибровочные растворы с точно установленной концентрацией гемоглобина. Международный (стандартный) калибровочный раствор гемиглобинцианида готовится от имени ICSH и служит для аттестации коммерческих калибровочных растворов. Допустимая ошибка определения гемоглобина при использовании Международного калибровочного раствора — менее ± 2%.

Калибровочные растворы гемиглобинцианида получают, как правило, путем введения высокоочищенного раствора гемоглобина в трансформирующий раствор. Международный комитет по стандартизации в гематологии начал работу по стандартизации калибровочного раствора гемиглобинцианида в 60-х гг. Первый образец гемиглобинцианида был предложен ВОЗ в 1967 г., но в последующие годы (1980, 1981, 1983) еще проводились уточнения его характеристик, и только в 1985 г. был установлен международный стандарт гемиглобинцианида, отвечающий всем требованиям, сформулированным Международным Комитетом по стандартизации в гематологии.

Контрольные растворы гемоглобина:

Использование калибровочных растворов позволяет точно определить концентрацию гемоглобина в крови, если при анализе не было допущено различных погрешностей. Погрешности можно выявить с помощью контрольных растворов гемоглобина. Контрольные растворы гемоглобина — это высокоочищенные имитаторы крови человека, не содержащие примесей, искажающих результаты анализа. Концентрация гемоглобина в контрольных растворах определена с точностью ~ 2%. Аттестация этих растворов проводится на фотометрах высокого класса точности при использовании дозаторов с погрешностью дозирования менее 1%.

Наличие панели наборов реагентов для определения гемоглобина в крови: трансформирующего реагента, калибровочных растворов гемиглобинцианида и контрольных растворов гемоглобина обеспечивает возможность получения результатов с погрешностью, не превышающей ± 2%. гемоглобинцианидный медицинский калибровочный корреляция Требования безопасности при работе с раствором, содержащим цианистые соединения:

При всех положительных параметрах гемиглобинцианидного метода большим его недостатком является то, что он основан на применении ядовитых цианистых соединений. Вместо цианистого калия многие применяют маскированный цианид? ацетонциангидрин. Характер действия ацетонциангидрина на человека сходен с действием синильной кислоты, но эффект развивается медленнее.

Ацетонциангидрин всасывается через кожу и может вызывать тяжелые отравления. Его предельно-допустимая концентрация (ПДК) составляет 0,9 мг/м3, класс опасности 2.

Для работы с цианистыми соединениями необходимо соблюдение специальных мер предосторожности: применение фильтрующих противогазов, спецодежды; оснащение рабочего места местной и общей вытяжной вентиляцией; необходимостью проведения контроля за концентрацией ацетонциангидрина в воздухе, тщательную герметизацию аппаратуры и ее продувание перед началом работы.

Реакцию ацетонциангидрина с гемом метгемоглобина можно представить в следующем виде (где пунктирными линиями обозначены координационные связи железа):