Сравнительная характеристика ЦОК у больных колоректальным раком в зависимости от выбора оперативного вмешательства

В настоящее время известно, что смертность от злокачественных заболеваний напрямую связана с ранним метастазированием и развитием рецидивов. С развитием современных технологий стало возможным детекция единичных опухолевых клеток в биоптатах костного мозга и периферической крови [11]. Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) — клетки эпителиального происхождения, своего рода клоны первичной опухоли [4,5,10]. Клетки опухоли приобретают способность проникать в кровоток после процесса эпителиально-мезенхимального перехода, в результате которого опухолевая клетка утрачивает клеточную адгезию, приобретает аномальную подвижность и инвазивность [7,16]. После попадания в кровоток основная часть опухолевых клеток (85%) подвергается апоптозу в течение 5 минут, часть — продолжает циркулировать, а часть клеток покидает кровоток в сосудах отдаленных органов, где могут находиться в «дремлющем» или «спящем» состоянии или, при реверсии мезенхимального фенотипа в эпителиальный, пролиферировать с формированием метастаза [8,13].

Основной интерес представляет фракция клеток опухоли, продолжающая свое существование в сосудистом русле. Эти клетки не вступают в клеточный цикл, не пролиферируют, устойчивы к действию цитотоксических агентов и не подвергаются апоптозу, благодаря активации антиапоптотических программ происходящей во время эпителиально-мезенхимального перехода [7]. ЦОК имеют агрессивный метастатический потенциал, приобретенный в результате эволюции клона, что позволяет рассматривать их как основной механизм опухолевой прогрессии [6]. Во время эпителиально-мезенхимального перехода опухолевая клетка теряет эпителиальные антигены и приобретает мезенхимальные, в связи с чем меняются ее фенотипические характеристики, по сравнению с клетками в первичной опухоли [14].

Колоректальный рак занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической заболеваемости и смертности, как в России, так и во всем мире [1,2,3]. Известно, что хирургический стресс может активизировать рост опухоли и способствовать ее метастазированию. В экспериментах A.M. Eggermont и соавт. и H. Goshima и соавт. показано, что после операций увеличивается способность опухолевых клеток к имплантации и диссеминации [9,12]. Лапароскопические вмешательства по сравнению с традиционными, открытыми операциями позволяют минимизировать хирургическую травму и хирургический стресс за счет прецизионной техники и малотравматичного доступа [15].

В исследование были включены 30 пациентов по поводу верифицированного рака толстой кишки с метастазированием в печень в ФГБУ «РНИОИ» Минздрава РФ. Все пациенты были разделены на основную группу (лапароскопические операции, 15 человек) и контрольную (традиционные открытые операции, 15 человек). Для определения ЦОК применялась технология анализа в системе CellSearch System™ (Janssen Diagnostics, LLC). Анализ выполнялся трижды: до оперативного вмешательства при поступлении, во время операции при мобилизации препарата и перед выпиской. Методика определения ЦОК заключалась в следующем: кровь в объеме 8−10 мл забиралась в пробирки СellSave Preservative Tube, содержащие антикоагулянт ЭДТА, а также реагент для сохранения жизнеспособности опухолевых клеток. Для отделения клеток крови и опухолевых от плазмы, кровь смешивалась с рабочим буфером из набора реагентов CellSearch® СТС kit и центрифугировалась при ускорении 800g в течение 10 минут. После этого образцы переносились в аппарат CellTracks® AutoPrep® System, который в автоматическом режиме, удаляя плазму крови и форменные элементы, иммуномагнитно обогащал образец микрочастицами железа, покрытыми антителами к маркерам адгезии эпителиальных клеток EpCAM, CD45 и цитокератинам 8,18,19. Качество работы системы оценивали с использованием стандартного контроля СТС control kit. Материал сканировался в анализаторе CellTracks® Analyzer II®. С учетом морфологических характеристик и экспрессии маркеров регистрировались циркулирующие опухолевые клетки.

При проведении количественного анализа ЦОК в крови больных основной группы на этапе до оперативного вмешательства опухолевые клетки были зарегистрированы у 13 больных из 15 (86,7% случаев). При этом от 1 до 3 клеток, что является допустимым при онкологических заболеваниях, наблюдалось в 46,7% случаев (у 7 из 15 больных). Уровень ЦОК выше 3-х наблюдался у 40% больных (6 из 15). Разброс опухолевых клеток в крови на этапе до оперативного вмешательства колебался от 1 до 121 ЦОК, в среднем составив 11,1±7,6%.

Процентное соотношение выявленных опухолевых клеток в крови в основной группе больных на этапе мобилизации препарата по сравнению с детекцией до оперативного вмешательства было немного меньше, так ЦОК регистрировались в 80% случаев (у 12 из 15 больных). От 1 до 3 клеток обнаружено в 53,3% случаев (у 8 из 15 больных). На долю больных с уровнем ЦОК свыше 3-х приходилось 26,7% больных (4 из 15). Уровень ЦОК в крови больных на этапе мобилизации препарата находился в пределах от 1 до 52 опухолевых клеток, в среднем составив 5,3±3,3%.

На 7 сутки после оперативного вмешательства доля больных с выявленными ЦОК составила 46,7% (7 из 15). От 1 до 3 ЦОК наблюдалось у 33,3% больных основной группы (5 из 15). У двоих больных уровень ЦОК был выше 3-х. Количество ЦОК в крови больных на 7 сутки после оперативного вмешательства составляло от 1 до 12 клеток, в среднем составив 1,5±0,8%.

В целом, при анализе динамики уровня ЦОК во всех трех точках исследования при проведении лапароскопического оперативного вмешательства были получены следующие типы изменений содержания опухолевых клеток:

• · Уровень ЦОК постепенно снижался от исходного фона к этапу мобилизации препарата и к 7-м суткам после оперативного вмешательства в 33,3% случаев (у 5 из 15 больных).
• · В первой и второй точках исследования был одинаков и снижался на 7-е сутки в 20% случаев (у 3 из 15 больных).
• · Снижался на этапе мобилизации препарата и оставался таким же на 7-е сутки в 20% (у 3 из 15 больных).
• · Повышался на этапе мобилизации препарата, но снижался к 7-м суткам (в нашем случае, наблюдалось отсутствие ЦОК в 3 точке) в 13,3% у 2 из 15 больных.
• · Снижался и отсутствовал на этапе мобилизации препарата, но увеличивался до 1 ЦОК на 7-е сутки после вмешательства в 6,7% случаев (1 из 15).
• · В 1 случае из 15 анализ показал отсутствие опухолевых клеток в крови во всех трех точках исследования, что составило 6,7%.

Проведение количественного анализа ЦОК в крови больных контрольной группы на этапе до оперативного вмешательства выявило отсутствие опухолевых клеток в 13,3% случаев (у 2 из 15 больных), против 86,7% больных с наличием ЦОК (13 из 15). Детекция от 1 до 3 клеток происходила в 40% случаев (у 6 из 15 больных). Доля больных с уровнем ЦОК свыше 3 клеток составила 46,7% больных (7 из 15). Количество опухолевых клеток в крови на этапе до оперативного вмешательства у больных контрольной группы колебалось от 1 до 142 ЦОК, в среднем составив 12,2±9,2%.

Процентное соотношение выявленных опухолевых клеток в крови в контрольной группе больных на этапе мобилизации препарата составило 93,3% (у 14 из 15 больных). От 1 до 3 клеток зарегистрировано в 40% случаев (у 6 из 15 больных). На долю больных с уровнем ЦОК свыше 3-х приходилось 53,3% (8 из 15). Уровень ЦОК в крови больных на этапе мобилизации препарата находился в пределах от 1 до 140 опухолевых клеток, в среднем составив 12,7±9,1%.

На 7 сутки после оперативного вмешательства в крови больных контрольной группы наличие клеток опухоли выявлено в 86,7% (13 из 15). От 1 до 3 ЦОК обнаружено у 33,3% больных контрольной группы (5 из 15). На долю больных с уровнем ЦОК свыше 3-х клеток приходилось 53,3% (8 из 15).

Уровень ЦОК в крови больных контрольной группы на 7 сутки после оперативного вмешательства находился в пределах от 1 до 160 клеток, в среднем составив 14,7±10,4%.

Анализ динамики уровня ЦОК во всех трех точках исследования при проведении традиционной полостной операции соответствовал следующим типам изменений содержания опухолевых клеток:

• · Постепенное снижение уровня ЦОК от исходного фона к этапу мобилизации препарата и к 7-м суткам после оперативного вмешательства не выявлено ни в одном из проанализированных случаев контрольной группы.
• · В первой и второй точках исследования уровень ЦОК был одинаков и снижался на 7-е сутки в 1 из 15 случаев, что составило 6,7%.
• · Случаи снижения уровня ЦОК на этапе мобилизации препарата и такие же значения на 7-е сутки после операции среди больных контрольной группы нами выявлены не были.
• · Уровень ЦОК повышался на этапе мобилизации препарата, но снижался к 7-м суткам у 4 из 15 больных, в 26,7%.
• · Снижался на этапе мобилизации препарата, но увеличивался на 7-е сутки после оперативного вмешательства в 26,7% случаев (4 из 15).
• · Постепенное повышение уровня ЦОК от исходного фона к этапу мобилизации препарата и к 7-м суткам после оперативного вмешательства выявлено в 20% случаев (у 3 из 15 больных).
• · По 1 случаю приходилось на следующие типы динамики ЦОК: отсутствие опухолевых клеток в крови на всех этапах исследования и одинаковый исходный уровень и во время операции на этапе мобилизации препарата с увеличением к 7-м суткам (по 6,7%).
• · Увеличение уровня ЦОК на этапе мобилизации препарата и сохранение на 7-е сутки отмечено у 1 из 15 больных (6,7%).

Проведенный сравнительный анализ количества ЦОК у больных обеих групп на этапах исследования выявил, что исходные показатели средних значений опухолевых клеток до оперативного вмешательства в основной и контрольной группах находились практически на одинаковом уровне и составили 11,1±7,6 и 12,2±9,2 соответственно. При проведении лапароскопической операции на этапе мобилизации препарата у больных основной группы отмечено снижение в 2,4 раза среднего количества ЦОК в крови в сравнении со значениями больных контрольной групппы (с 12,7±9,1 при полостной операции против 5,3±3,3 при лапароскопической). Наиболее выраженные изменения количества ЦОК, хотя и не имеющие достоверной разницы, отмечены на 7-е сутки у больных основной группы, где их средние значения в 9,8 раз снижались в сравнении со значениями больных контрольной группы (с 14,7±10,4 больных контрольной группы, против 1,5±0,8 больных основной группы).

При сравнительном анализе динамики уровня ЦОК на этапах исследования у больных основной и контрольной групп выявлены следующие типы изменений содержания опухолевых клеток:

• · Одинаково часто в 6,7% у больных исследуемых групп опухолевые клетки не выявлены ни на одном из этапов исследования.
• · У больных основной группы в 53,3% отмечено снижение уровня ЦОК к этапу мобилизации препарата, причем у 33,3% снижение количества ЦОК продолжалось и к 7-е суткам в сравнении с исходным фоном и этапом мобилизации препарата. Подобная динамика уровня ЦОК у больных контрольной группы выявлена не была.
• · У больных основной группы снижение уровня ЦОК только к 7-м суткам выявлено в 3 раза чаще в сравнении с контрольной группой (20% против 6,7%).
• · Увеличение уровня ЦОК у больных контрольной группы на этапе мобилизации препарата выявлено в 4 раза чаще в сравнении с больными основной группы (53,3% против 13,3%). При этом в 33,3% случаев контрольной группы высокий уровень ЦОК сохранялся и на 7-е сутки после оперативного вмешательства. Подобная динамика уровня ЦОК у больных основной группы нами не выявлена.
• · Снижение уровня ЦОК на этапе мобилизации препарата и увеличение к 7-м суткам у больных контрольной группы выявлено в 4 раза чаще, в сравнении с больными основной группой (26,7% против 6,7%).

Проведенное нами исследование количества и частоты выявления циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови больных основной и контрольной групп наглядно демонстрирует уменьшение количества ЦОК при проведении лапароскопических вмешательств и изменение динамики уровня опухолевых клеток в виде их снижения начиная с этапа мобилизации препарата за счет малотравматичного доступа, минимизации манипуляций в проекции опухоли и как, следствие, препятствию выхода в кровяное русло единичных опухолевых клеток.

опухолевый биоптат кровь костный.

• 1. Архипова О. Е. Анализ встречаемости онкологических заболеваний в Ростовской области. Пространственно-временная статистика / Архипова О. Е., Черногубова Е. А., Лихтанская Н. В., Тарасов В. А., Кит О. И., Матишов Д. Г. // Фундаментальные исследования. — 2013. — № 7−3. — С. 504−510.
• 2. Архипова О. Е. Уровень онкологических заболеваний как индикатор медико-экологической безопасности территории (на примере Ростовской области) / Архипова О. Е., Черногубова Е. А., Тарасов В. А., Лихтанская Н. В., Кит О. И., Еремеева А. А., Матишов Д. Г. // Вестник Южного научного центра РАН. — 2013. — Т. 9. — № 3. — С. 7−14.
• 3. Кит О. И. Проблема колоректального рака XXI века: достижения и перспективы / Кит О. И. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2013. — Т. 23. — № 3. — С. 65−71.
• 4. Кит О. И. Первый опыт детекции циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови / Кит О. И., Новикова И. А., Бахтин А. В., Никипелова Е. А., Шатова Ю. С., Габараева В. М., Нистратова О. В. // Международный журнал экспериментального образования. — 2013. — № 11. — С. 37−39.
• 5. Непомнящая Е. М. Циркулирующие опухолевые клетки и некоторые морфоиммуногистохимические показатели при колоректальном раке / Непомнящая Е. М., Кит О. И., Нистратова О. В., Новикова И. А., Никипелова Е. А., Бахтин А. В., Ульянова Е. П., Вострикова Ж. И., Селютина О. Н. // Современные проблемы науки и образования. — 2016. — № 2.
• 6. Осинский С. П. Диссеминированные опухолевые клетки в крови и костном мозге (молекулярный прогноз в клинической онкологии) / С. П. Осинский, Д. Ф. Глузман // Онкология. — 2006. — Т. 8, № 2. — С. 102−108.
• 7. Тупицын Н. Н. Циркулирующие и диссеминированные раковые клетки при раке молочной железы и раке яичников / Тупицын Н. Н. // Онкогинекология. — 2013. — № 1. — С. 12−18.
• 8. Bednarz-Knoll N. Plasticity of disseminating cancer cells in patients with epithelial malignancies / Bednarz-Knoll N., Alix-Panabieres C., Pantel K. // Cancer Metastasis Rev. — 2012. — Vol. 3−4. — P. 673−87. doi: 10.1007/s10555−012−9370-z.
• 9. Eggermont A.M. Local regional promotion of tumor growth after abdominal surgery is dominant over immunotherapy with interleukin-2 and lymphokine activated killer cells / Eggermont A.M., Steller E.P., Marquet R.L. et al. // Cancer. Detect. Prev. — 1988. — Vol. 12. — P. 421−429.
• 10. Fehm T. Clinical utility of serial serum c-erbB-2 determinations in the follow-up of breast cancer patients / Fehm T, Gebauer G, Jдger W. // Breast Cancer Res Treat. — 2002. — Vol. 75. — P. 97−106.
• 11. Gafforio J.J. Detection of breast cancer cells in the peripheral blood is positively correlated with estrogen receptor status and predicts for poor prognosis / Gafforio J.J., Serrano M.J., Sanches Rovira P. et al. // Int. J. Cancer. — 2003. — Vol. 107. — № 6. — P. 984−990.
• 12. Goshima H. Experimental study on preventive effects of lung metastases using LAK cells induced from various lymphocytes: special references to enhancement of lung metastasis after laparotomy stress / Goshima H., Saji S., Furuta T. et al. // Jpn J. Surg. Soc. — 1989. — Vol. 90. — P. 1245−1250.
• 13. Lu X. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging б4в1-positive osteoclast progenitors / Lu X, Mu E, Wei Y, Riethdorf S, Yang Q, Yuan M, Yan J, Hua Y, Tiede B, Lu X, Haffty B, Pantel K, Massaguй J, and Kang Y. // Cancer Cell. — 2011. — Vol. 20 (6). — P. 701−14.
• 14. Pantel, K. Circulating tumour cells in cancer patients: challenges and perspectives / Pantel K., Alix-Panabieres C. // Trends Mol. Med. — 2010. — Vol. 16. — P. 398−406.
• 15. Sбkra L., Lotkovб H., Kohoutek L., Siller J. Different impact of the laparoscopic and laparotomic approach on the immune response induced by surgical procedure // Rozhl. Chir. 2011 Vol. 90, № 6. P. 324−328
• 16. Shah M. Keeping an open mind: highlights and controversies of the breast cancer stem cell theory / Shah M., Allergucci C. // Breast cancer: targets and therapy. — 2012. — V. 4. — P. 155−166.