Методы разделения белков с помощью ионообменной и аффинной хроматографии

Ионообменная хроматография основана на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники — полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Рис. 3. Электрофорез белков сыворотки крови здорового человека на бумаге.

Выбор ионообменника определяется зарядом выделяемого белка. Так, для выделения отрицательно заряженного белка используют анионообменник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН.

Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

По указанным соображениям для разделения белков используют ионообменники, в которых матрица («подложка») отчетливо гидрофильна. Особенно распространены ионообменники, получаемые присоединением монотонных групп к целлюлозе, поперечно-сшитым декстранам (сефадексы).

Для получения катионов в качестве ионогенной чаще всего используют карбоксильную группу рКа которой, несколько изменяющийся в зависимости от микроокружения, близок к 4 (карбоксиметил (СМ)-производные целлюлозы, сефадекса, содержащие группировки.

Карбоксильные группы таких ионитов отрицательно заряжены при рН 5 и выше и, следовательно, способны связывать белки, которые в этих условиях несут положительный заряд. Связывание белков усиливается, если на их поверхности встречаются скопления («гроздья») катионных групп. При прочих равных условиях с катионитом лучше связываются белки большей молекулярной массы, что объясняется кооперативностью многоточечного взаимодействия обширных участков поверхности такого белка с анионными группами ионообменника.

Десорбция белков, связанных катионитом, обычно достигается повышением ионной силы элюирующего раствора, причем взаимодействующие между собой заряженные группы белка и ионита оказываются в окружении противоположно заряженных ионов солей.

В результате при определенной концентрации соли, характерной для каждого белка, электростатические взаимодействия между ним и ионитом снимаются и белок элюируется с колонки.

Плавное увеличение ионной силы раствора, применение линейного или более сложного градиента концентрации соли вызывает десорбцию сначала наиболее слабо удерживаемых молекул, затем более прочно связанных белков и т. д.

В препаративных опытах нередко прибегают к ступенчатой элюции, при которой концентрации соли повышается скачками. Это ускоряет разделение и позволяет собрать белок в небольшом объеме, однако легко приводит к образованию одним и тем же белком нескольких ложных.

При промывании колонки с ионитом раствором соли подходящей концентрации белок десорбируется, иногда образуя довольно длинный «хвост», что может быть следствием неравномерного распределения ионных групп в сорбенте.

Участки с их повышенным содержанием, скопления таких групп прочнее удерживают белок, что и вызывает задержку элюции и образование «хвоста». В такой ситуации скачкообразное повышение ионной силы элюирующего раствора резко улучшает условия десорбции, поэтому часть белка, которая в обычных условиях образовывала бы «хвост», десорбируется скачком, давая ложный пик.

Ввиду этого следует определять белковый состав каждой фракции независимым методом, например электрофорезом в полиакриламидном геле, или подвергать сомнительные пики повторной хроматографии в тех же условиях. Несоблюдение таких предосторожностей нередко приводит к ошибочному обнаружению «множественных форм» белков.

Аффинная хроматография, или хроматография по сродству наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т. д.

Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом (рис. 4). Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок в тысячи раз.

Рис. 4. Аффинная хроматография.

Для разделения белков применяется также ряд др. аналогичных методов. Т. называют ковалентная хроматография основана на избирательном образовании и последующем расщеплении ковалентных связей между выделяемым веществом и носителем, например между белком с SH-группами и ртуть-органическое производными агарозы.

Применяется также лигандообменная хроматография, при которой ферменты связываются через функциональный ион металла с комплексоном, иммобилизованным на носителе. Получила распространение гидрофобная хроматография, при которой сорбент (например, фенилсефароза), содержащий гидрофобные группировки, вкрапленные в гидрофильную матрицу, взаимодействует с гидрофобными участками, содержащимися на поверхности белков. Нередко при этом наблюдаются также ионообменные взаимодействие, как, например, при использовании в качестве сорбента алкиламиносефароз.

Рис. 5. Схема хроматографии белков на аффинном носителе.

Рис. 6. Ионообменная колоночная хроматография.