Апробация метода генотипирования штаммов винных дрожжей рода Saccharomyces на основе анализа геномных участков Inter-Delta

Современная винодельческая промышленность располагает большим количеством и разнообразием винных дрожжей, обладающих отличающимися физиолого-биохимическими свойствами — спирто-, сульфито-, холодои термоустойчивостью. Кроме того, выделены современные расы дрожжей, способные формировать определенные ароматы и воздействовать на вкус вина. По результатам анализа комплекса биохимических характеристик дрожжей в ходе брожения относительно недавно были выведены штаммы чистых дрожжевых культур с необходимыми метаболическими показателями, что позволило добиться большей воспроизводимости брожения и стабильных качественных показателей вина. В последние 15−20 лет, в целях обеспечения отрасли виноделия, в мире, ведется селекция новых штаммов, как за счет отбора лучших естественных штаммов, так и за счет скрещивания штаммов и последующего отбора в потомстве лучших образцов, позволяющих получать высококачественные виноматериалы. При этом необходимо получение способных к споруляции штаммов с образованием жизнеспособных аскоспор. Большинство промышленных штаммов — диплоиды или ануеплоиды, и редко — полиплоиды [1]. Не до конца выяснен вопрос, имеют ли какие-либо преимущества полиплоидные коммерческие штаммы. Когда были созданы гомои гетерозиготные штаммы с плоидностью от одного до восьми, было показано, что гетерозиготные триплоиды и тетраплоиды проявляли более высокую ферментативную активность, чем гомозиготные штаммы с большей или меньшей плоидностью. Таким образом, было показано, что скорее гетерозиготность, чем плоидность влияет на характеристики культуры [2].

Очевидно, что, в связи с созданием широкого перечня новых коммерческих штаммов винных дрожжей, а также с актуальностью исследований, направленных на поиск штаммов, обладающих ценными характеристиками, в естественных условиях, особую важность приобретает вопрос оценки генетической идентичности используемых штаммов и изучения их генетического разнообразия. На генетическом уровне возможно в короткие сроки выполнить максимально точную идентификацию принадлежности имеющейся культуры винных дрожжей к определенному штамму [3, 4].

За многие годы развития биотехнологии, было разработано несколько методик дифференциации дрожжевых штаммов, тем не менее, развитие ДНК технологии открыло новые подходы для дифференциации дрожжей в пищевой промышленности. Из молекулярно-биологических методов дифференциации дрожжевых штаммов следует выделить хроматографию, белковый электрофорез, гель-электрофорез дрожжевых хромосом в импульсном поле. Однако наибольшую распространенность получили методы, основанные на анализе структуры ДНК, которая не зависит от каких либо физиологических особенностей, что делает ДНК анализ одним из самых точных. Методы молекулярно-генетического анализа, позволяют в экспресс режиме идентифицировать генетическую чистоту дрожжевой культуры, как и оценивать уровень генетического разнообразия природных популяций.

Из методов, основанных на анализе полиморфизма ДНК следует выделить следующие: анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции митохондриальной ДНК (RFLP), ДНК-фингерпринтинг с использованием микросателлитных маркеров, анализ интер-дельта фрагментов генома и AFLP — анализ (amplified fragment length polymorphism). При этом к наиболее перспективным методам следует отнести метод на основе анализа микросателлитных локусов (SSR) и участков генома, известных как интер-дельта (interд). SSR-маркеры — простые повторяющиеся последовательности — широко используются в генотипировании и при конструировании генетических карт. Их широкое применение обусловлено равномерным покрытием генома, высоким полиморфизмом, мультиалельностью, кодоминантным характером наследования и воспроизводимостью. Эти характеристики сделали SSR-маркеры одними из наиболее часто используемых молекулярных ДНК-маркеров для выявления генетического разнообразия, ассоциативного картирования, картирования генетического сцепления, популяционного и эволюционного анализа.

Микросателлитный анализ может быть рассмотрен, как один из наиболее удобных и точных методов делимитации S. cerevisiаe. В настоящее время имеется ряд работ по изучению популяционных взаимосвязей дрожжей [5]. Необходимо отметить, что SSR-анализ может быть наиболее востребован при изучении генетического разнообразия и генетической идентификации штаммов, имеющих близкое происхождение [6]. В тоже время, для предварительного определения видовой принадлежности, а также первичной идентификации и оценки степени генетической близости успешно используется метод, основанный на анализе полиморфизма д-последовательностей, которые в большом количестве содержатся в геноме.

Это постоянно повторяющиеся элементы размером 0,3 kb, которые фланкируют TY1 ретротранспозон. В лабораторных штаммах, TY1 элемент представлен примерно 35 копиями, распределенными по геному дрожжей. Около 100 копий д-последовательностей представлены в геноме, как часть TY1 элементов или самостоятельно. Статистическое распределение этих элементов примерно один на каждые 150 kb. Хотя д-последовательности чаще всего сконцентрированы около генов тРНК, д-последовательности, прямые или обратные, расположены на достаточных для их амплификации генетических расстояниях [7].

Две последовательности, комплементарные консенсусным последовательностям 5' конца д-последовательности были использованы в качестве маркеров. Таким образом, в результате ПЦР амплифицировались фрагменты различной длины, расположенные между двумя соседними д-последовательностями. Каждый штамм имел свой уникальный набор фрагментов. Полученные праймерные пары способны дифференцировать штаммы дрожжей на основании полиморфизма длин амплифицированных фрагментов. Проводились работы, в которых было изучено большое количество промышленных образцов и во всех случаях штаммы имели различный набор амплифицированных фрагментов. Данный метод обладает высокой воспроизводимостью, но, иногда, у образцов на электрофореграммах могут присутствовать бледные бэнды с различной интенсивностью свечения, независящей от остального мультипаттерного набора бэндов. Это может быть объяснено доступностью ДНК-матрицы для ПЦР в конкретном участке, что и определяет эффективность при гибридизации праймера. В связи с этим, также, возникал вопрос о стабильности таких фрагментов, что связано с потенциальной мобильностью TY-элементов. Воспроизводимость была доказана на различных штаммах на разных стадиях культивирования и при различных условиях культивирования. Данный метод позволяет, помимо прямой дифференциации штаммов, выявлять и контаминацию другими дрожжами до 1% [7].

Учитывая перспективность использования для генетической идентификации штаммов винных дрожжей метода, основанного на анализе полиморфизма д-последовательностей, в задачу наших исследований входило выполнение апробации ДНК — маркерного анализа на основе использования праймерных пар — д1 + д2 и д1 + д12 и генотипирование некоторых коммерческих штаммов. Кроме того, для упрощения методологической составляющей ДНК-маркерного анализа, была выполнена апробация экспресс методики экстракции ДНК.

Объекты и методы исследований. Объектами исследования послужили активные сухие дрожжи — коммерческие штаммы винных дрожжей, используемые в виноделии: ERBSLЦH Oenoferm Bouquet (Sacch. cerevisiae), Zymaflore X5 (Sacch.cerevisiae), SP49 (Association de Sacch. cerevisiae et Sacch.cerevisiae galastose), EC 1118 (Sacch. cerevisiae(ex bayanus)), L? food I fantastici 4 S. cerevisiae var. bayanus, Sacch. сerevisiae I laFORT7. BO 213 LaFORT, Primavera (Sacch. cerevisiae), Pro Elif (S. cerevisiae). Все образцы, за исключением образца Pro Elif (S. cerevisiae) были представлены высушенным препаратом культуры. Указанный образец представлял желатинизированные гранулы содержащие инкапсулированные клетки.

Для экстракции ДНК апробировали упрощенный метод с общей продолжительностью экстракции около 1,5−2 часов, использованный ранее для получения проб ДНК с уровнем чистоты, достаточным для проведения ПЦР-амплификации из культуры фитопатогенного гриба Venturia inequalis. Использовали экстрагирующий буфер следующего состава: 200 mM TrisHCL (pH 8,5), 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS. Для экстракции 30−40 мг пробы лиофильно высушенных дрожжей гомогенизировали в 300 мкл экстрагирующего буфера и инкубировали в течение 10 минут при 65С. Этап инкубации был введен нами в протокол экстракции, т. к. в оригинальной методике инкубация при 65^о С отсутствует. Далее экстракцию проводили по методике, описанной Zhang [8].

Для амплификации использовали праймерные пары д1 + д2 и д1 + д12 и [9]. ПЦР проводили по следующей программе: денатурация при 95^о С 2 мин, затем 35 циклов — 30 с при 95^о С, 43,2^о С — 1 мин, 72^о С — 1 мин; финальная элонгация при 72^о С — 10 мин. Электрофорез проводили в 1,5% агарозном геле в 0,5Х ТБЕ буфере при напряжении 150V в течении 40 минут. После окрашивания гелевых пластин в бромистом этидии, продукты ПЦР визуализировали и фотографировали в ультрафиолетовом свете.

Результаты исследований. В соответствии с поставленными задачами, на первом этапе исследования апробировали упрощенную методику экстракции ДНК, указанную в разделе «Материалы и методы исследования». Проверка наличия ДНК в пробах, выполненная методом электрофореза полученных проб в 1,5% агарозном геле, показала, что для всех образцов, за исключением образца Pro Elif (S. cerevisiae) экстракция ДНК прошла успешно — на электрофореграмме присутствовал фрагмент с предполагаемой молекулярной массой превышающий 4−5 тысяч пар оснований (отмечен стрелкой).

Рисунок 1 Проверка наличия ДНК в экстрагированных пробах Примечание: М — маркер молекулярной массы ДНК; 1 — Pro Elif, 2 — ERBSLЦH Oenoferm Bouquet, 3 _ Zymaflore X5, 4 — SP49, 5 — EC 1118, 6 — L? food I fantastici 4.

Неудовлетворительная экстракция ДНК по образцу Pro Elif (S. cerevisiae) может быть связана с тем, что данный образец представлял собой не лиофильно-высушенную культуру дрожжей, а абсорбированные в желатиновых гранулах дрожжевые клетки. Тем не менее, на этапе апробации экспериментальных параметров ПЦР этот образец был включен в эксперимент, с целью исключить ошибочность выводов, основанных на проверке в агарозном геле.

Рисунок 2 Апробация условий ПЦР с праймерными парами д1 + д2 и д1 + д12.

Примечание: М — маркер молекулярной массы ДНК; 1 — 8 штаммы дрожжей: 1 — Pro Elif, 2 — ERBSLЦH Oenoferm Bouquet, 3 — Zymaflore X5, 4 — SP49, 5 — EC 1118, 6 — L? food I fantastici 4, 7 — Cerevisiae I laFORT, 8 — BO 213 LaFORT.

На рисунке, А представлены результаты ПЦР с праймерной парой, А (д1 и д2) при концентрации каждого праймера 0,48 mM, на рисунке Б — результаты ПЦР с праймерной парой Б (д1 и д12) при концентрации каждого праймера 0,32 mM. Результаты апробации подтвердили, что пробу ДНК образца дрожжей, абсорбированных в желатиновых гранулах Pro Elif (S. cerevisiae) не удалось экстрагировать с использованием предложенного метода. Видно, что амплификация лучше проходит при повышенной концентрации праймеров в реакционной смеси, а именно 0,48 mM (3 мкл рабочего раствора праймеров) на реакцию. Таким образом, было установлено, что оптимальной концентрацией праймеров в ПЦР-смеси является 0,48 mM. ген штамм винный дрожжи На следующем этапе эксперимента выполнили ПЦР анализ восьми штаммов винных дрожжей с использованием повышенной концентрации праймеров (0,48 mM). На рисунках 3 и 4 представлены результаты электрофореза амплифицированных фрагментов, полученных с использованием комбинаций праймеров д1 + д2 и д1 + д12 для восьми изученных штаммов.

Рисунок 3 Детекция полиморфизма с праймерной парой д1 + д2.

Примечание: М — маркер молекулярной массы ДНК; 1−8 штаммы дрожжей: 1 — ERBSLЦH Oenoferm Bouquet, 2 — Zymaflore X5, 3 — SP49, 4 — EC 1118, 5 — L? food I fantastici 4, 6 — Cerevisiae I laFORT, 7 — BO 213 LaFORT, 8 — PRIMAVERA.

Рисунок 4 Детекция полиморфизма с праймерной парой д1 + д12.

Примечание: М — маркер молекулярной массы ДНК; 1−8 штаммы дрожжей: 1 — ERBSLЦH Oenoferm Bouquet, 2 — Zymaflore X5, 3 — SP49, 4 — EC 1118, 5 — L? food I fantastici 4, 6 — Cerevisiae I laFORT, 7 — BO 213 LaFORT, 8 — PRIMAVERA.

Анализ электрофореграмм позволяет говорить о том, что праймерная пара д1 + д12 пара позволяет амплифицировать от двух до шести фрагментов в спектре. При этом максимальное количество фрагментов, получаемое с комбинацией праймеров д1 + д2 — три. Это согласуется с данными, полученными рядом исследователей ранее [7, 9]. Анализируя суммарный спектр, полученный в двух комбинациях праймеров можно сделать заключение о высоком уровне полиморфизма, выявляемом с использованием данных ДНК-маркеров. Все изученные штаммы, за исключением двух имеют достоверно разные наборы фрагментов. В тоже время, образцы L? food I fantastici 4 S. cerevisiae и PRIMAVERA (номера на электрофорезе 5 и 8, соответственно) имеют идентичные спектры амплификации. Это может быть связано с возможно высоким уровнем их генетической близости. Как было сказано ранее, для выявления генетических различий между близкими по происхождению образцами более оптимально использование SSR-генотипирования. Несмотря на это можно сделать вывод о высокой эффективности использованных ДНК-маркеров, т. к. с применением двух праймерных пар были получены уникальные спектры для большинства изученных генотипов S. cerevisiae.

Таким образом, в результате выполненной работы была подтверждена высокая эффективность использования inter-д ДНК-маркеров для генотипирования штаммов винных дрожжей, оптимизированы условия ПЦР для более высокого уровня амплификации фрагментов и определена упрощенная методика экстракции ДНК, позволяющая получать пробы из высушенных препаратов дрожжевых культур с уровнем чистоты, достаточным для проведения ПЦР.

• 1. Snow, R. Genetic improvement of wine yeast. In Yeast Genetics Fundamental and Applied Aspects, Spencer JFT, Spencer DM, Smith ARW (eds). Springer-Verlag: New York, 1983. p. 439−459.
• 2. Hammond, J.R.M. Yeast genetics. In Brewing Microbiology, Priest FG, Campbell I (eds). Chapman and Hall: London, 1996. p. 45−82.
• 3. Degre, R. Wine yeast strain identification / R. Degre, D.Y. Thomas, J. Ash [et al.] // Am.J. Enol. Vitic. — 1989. — V. 40. — p. 309−315.
• 4. Pretorius, I.S. The impact of yeast genetics recombinant DNA technology on the wine industry / I.S. Pretorius, T.J. Westhuizen // S. Afr. J. Enol. Vitic. — 1991. — V. 12. — p. 3−31.
• 5. Schuller, D. Genetic Diversity and Population Structure of Saccharomyces cerevisiae Strains Isolated from Different Grape Varieties and Winemaking Regions / D. Schuller, F. Cardoso, S. Sousa [et al.] // 2112. — PLoS ONE 7(2): e32507. doi:10.1371/journal.pone.32 507.
• 6. Hennequin, C. Microsatellite typing as a new tool for identiўcation of Saccharomyces cerevisiae strains / C. Hennequin, A. Thierery, G.F. Richard [et al.] // J. Clin. Microbiol. — 2001. — V. 39. — p. 551−559.
• 7. Ness, F. Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction / F. Ness, F. Lavallee, D. Dubourdieu [et al.] // J. Sci. Food Agric. — 1993. — V. 63. — p. 89−94.
• 8. Zhang, L. Genetic diversity and temporal dynamics of venturia inaequalis populations following two apple scab epidemics in pennsylvania: in Plant Pathology. — 2010. — p. 24−33.
• 9. Legras, J.-L. Optimisation of interdelta analysis for Saccharomyces cerevisiae strain characterisation / J.-L. Legras, F. Karst // FEMS Microbiology Letters, 2003. — V. 221. — p. 249−255.