Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на уровне целого организма

В настоящем эксперименте нам предстояло оценить, насколько прогнозы относительно биологических эффектов ФОС, сделанные на основании анализа их эстеразных профилей, соответствуют эффектам соединений на уровне целого организма, т. е. исследовать связь между эстеразным профилем соединения и степенью ингибирования эстераз головного мозга и крови мышей при в/бр введении соединений.

С этой целью было исследовано изменение активности АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ мозга и крови мышей через 1 час после однократного в/бр введения возрастающих доз трех соединений: diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP, обладающих разным эстеразным профилем, разной острой токсичностью и разным нейропатичным потенциалом. Вводимые животным дозы diEt-PFP и diBu-PFP не превышали величины LD50: для diEt-PFP интервал вводимых доз составлял 15 ч 200 мг/кг (LD50 = 200 мг/кг), для diBu-PFP — 0.5 ч 2000 мг/кг (LD50 > 2000 мг/кг), интервал вводимых доз diPr-DClVP составлял 0.2 ч 24 мг/кг. Дозы diPr-DClVP, превышающие LD50 (15 мг/кг), вводили мышам на фоне предварительного введения атропина-сульфата (20 мг/кг за 20 мин. до введения diPr-DClVP).

Ингибирование эстераз мозга мышей при внутрибрюшинном введении ФОС

Результаты ингибирования эстераз мозга мышей in vivo соединениями diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP представлены на Рисунке 3.5.-1. diEt-PFP в исследуемом интервале доз, практически не ингибирует НТЭ, слабо ингибирует АХЭ (26%-ное ингибирование) и тормозит активность БХЭ на 50% (Рис 3.5.-1А). diBu-PFP (Рис. 3.5.-1Б) и diPr-DClVP (Рис. 3.5.-1В) в указанных выше интервалах доз ингибируют АХЭ, БХЭ и НТЭ в мозге мышей дозо зависимым образом.

Из полученных дозозависимостей определены величины ED50, мг/кг, для diBu-PFP и diPr-DClVP, для diEt-PFP указан % ингибирования каждой эстеразы при введении максимальной дозы. Ингибиторная селективность соединений in vivo рассчитана в соответствии с уравнением: S (EX/EY) = ED50(EY)/EC50(EX).

Величины ингибиторной селективности для diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга мышей при в/бр введении соединений, и величины ингибиторной селективности, рассчитанные из эстеразного профиля Таблица 3.5. — 2. Ингибиторная селективность diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга мышей в экспериментах на целом животном в сравнении с данными эстеразного профиля соединений.

Наблюдаются хорошие корреляции между величинами ингибиторной селективности diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз мозга мышей, полученными в эксперименте in vivo, и соответствующими величинами, полученными из анализа эстеразного профиля соединений: для diBu-PFP r = 0.998, p = 0.425, n = 3; для diPr-DClVP r = 0.882, p = 0.3 126, n = 3.

Это касается как потенциальных фармакологических эффектов соединения таких как селективность в отношении БХЭ по сравнению с АХЭ, так и негативных эффектов, в частности, отставленной нейротоксичности (селективность в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ). Так, diBu-PFP, в соответствии с его эстеразным профилем, преимущественно ингибирует БХЭ в мозге мышей по сравнению с АХЭ (ED50 = 38.45 ± 5.61 и 498.3 ± 41.2 мг/кг, соответственно (Рис. 3.5.-1Б, Табл. 3.5.-1), причем это происходит в дозах, значительно меньших LD50 (>2000 мг/кг). Т. е., соединение могло бы представлять интерес как селективный ингибитор БХЭ мозга in vivo. Однако, в соответствии с величиной отношения ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ) = 4.1, diBu-PFP представляет опасность как отставленный нейротоксикант, как предсказывает анализ его эстеразного профиля. Это исключает фармакологическое применение данного соединения.

Для diPr-DClVP эффекты в мозге in vivo также соответствуют его эстеразному профилю: соединение эффективно ингибирует АХЭ, БХЭ и НТЭ мозга, обладает высоким нейропатичным потенциалом, о чем свидетельствует отношение ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ) = 2.1 (Табл. 3.5.-1). Эффективное ингибирование АХЭ мозга (ED50АХЭ = 3.9 ± 0.5 мг/кг) согласуется с его высокой острой токсичностью (LD50 = 15 мг/кг).

Проведенный эксперимент демонстрирует хорошее соответствие ингибиторной активности и селективности diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ мозга мышей при однократном в/бр введении соединений их биологическим эффектам, предсказанным в результате анализа эстеразного профиля соединений.

Ингибирование эстераз крови мышей при внутрибрюшинном введении ФОС

Кровь является наиболее подходящей для исследований тканью организма в плане ее доступности и информативности (в силу наличия активности всех исследуемых эстераз).

На данном этапе мы исследовали изменение активности АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в крови мышей через 1 час после однократного в/бр введения возрастающих доз соединений diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP, которые, как упоминалость выше, имеют различный эстеразный профиль, разную острую токсичность и разный нейропатичный потенциал.

Соединение diBu-PFP (Рис. 3.5.-2Б) ингибирует АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в крови дозозависимым образом, при этом проявляет более высокую ингибиторную активность в отношении всех четырех эстераз крови по сравнению с diEt-PFP, что согласуется с различиями в эстеразных профилях данных соединений. Наблюдается более сильное ингибирование БХЭ и особенно КЭ по сравнению с АХЭ и НТЭ.

diPr-DClVP (Рис. 3.5.-2В) демонстрирует дозозависимое ингибирование всех исследуемых эстераз крови при в/бр введении и наибольшую ингибиторную эффективность в отношении всех эстераз по сравнению с diBu-PFP и diEt-PFP. Соединение наиболее эффективно ингибирует КЭ крови.

Из полученных дозозависимостей определены величины ED50, мг/кг, для ингибирования эстераз крови всеми соединениями.

Таблица 3.5. — 3. Эффективность ингибирования (ED50, мг/кг) эстераз крови мышей через 1 час после в/бр введения соединений diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP.

Из Таблицы 3.5.-3 видно, что эффективность ингибирования эстераз крови мышей исследуемыми соединениями на уровне целого организма (величины ED50) располагается в ряду: diEt-PFP < diBu-PFP << diPr-DClVP, что соответствует эстеразным профилям соединений. В соответствии с эстеразным профилем находится и ряд чувствительности эстераз крови к каждому соединению: для diEt-PFP: НТЭ << АХЭ < БХЭ < КЭ; для diBuPFP и diPr-DClVP: АХЭ < НТЭ? БХЭ < КЭ (Рис. 3.5.-2).

Ингибиторная селективность соединений in vivo рассчитана в соответствии с уравнением S (EX/EY) = ED50(EY)/EC50(EX)., для сравнения приведены также величины ингибиторной селективности соединений, полученные при анализе их эстеразного профиля.

Результаты показывают, что в эксперименте на целом животном diBu-PFP и diPr-DClVP проявляют наибольшую селективность в отношении КЭ по сравнению с АХЭ, селективность БХЭ/АХЭ ниже, что хорошо согласуется с результатами анализа эстеразного профиля данных соединений. Также наблюдается выраженная селективность соединений в отношении КЭ по сравнению с НТЭ, соответствующая результатам in vitro.

Ингибиторная селективность diPr-DClVP и diBu-PFP в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ в крови, ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ), подтверждает нейропатичную опасность соединений, предсказанную при анализе их эстеразного профиля, и соответствует величинам RIP (Табл. 3.5.-4).

diEt-PFP при в/бр введении проявляет слабую ингибиторную активность по отношению к АХЭ и особенно НТЭ в крови (Табл. 3.5.-3), что подтверждает его безопасность в плане развития отставленной нейропатии и соответствует низким величинам RIP = 0.07.

Наблюдаются хорошие корреляции между величинами ингибиторной селективности diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз крови мышей, полученными в эксперименте in vivo, и величинами ингибиторной селективности, полученными из анализа эстеразного профиля соединений.

Вклад эстераз-скэвенджеров в формирование токсических эффектов ФОС

На основании результатов, полученных в предыдущем эксперименте, мы оценили вклад эстераз-скэвенджеров, БХЭ и КЭ, в формирование острой и отставленной нейротоксичности при в/бр введении мышам diBu-PFP и diEt-PFP, которые отличаются степенью гидрофобности алкильных радикалов.

Для гидрофобного diBu-PFP наблюдаются высокие величины селективности в отношении эстераз-скэвенджеров по сравнению с АХЭ in vivo: ED50(КЭ)/ED50(АХЭ) = 49.7 и ED50(БХЭ)/ED50(АХЭ) = 6.1, что свидетельствует о высоком защитном эффекте эстераз-скэвенджеров в отношении формирования острой токсичности и хорошо согласуется с низкой острой токсичностью соединения (LD50 > 2000 мг/кг).

При этом ингибиторная селективность diBu-PFP в отношении КЭ и БХЭ по сравнению с НТЭ, т .е. защитный эффект от ОНТФОС, существенно ниже: ED50(КЭ)/ED50(НТЭ) = 11.7 и ED50(БХЭ)/ED50(НТЭ) = 1.44. Учитывая высокий нейропатичный потенциал diBu-PFP, можно ожидать высокой вероятности развития ОНТФОС при отравлении этим соединением.

Для менее гидрофобного diEt-PFP величины селективности in vivo в отношении эстераз-скэвенджеров по сравнению с АХЭ ниже, чем для diBu-PFP: ED50(КЭ)/ED50(АХЭ) > 8 и ED 50(БХЭ)/ED50(АХЭ) > 4. Это свидетельствует о более низком защитном эффекте эстераз-скэвенджеров в отношении формирования острой токсичности в случае diEt-PFP, что отражается на величине LD50 (200 мг/кг). Острая токсичность diEt-PFP значительно выше, чем у diBu-PFP (LD50 > 2000 мг/кг), несмотря на его существенно более низкую анти-АХЭ активность в сравнении с diBu-PFP: ki=(1.80±0.11)Ч103 и (8.44±0.34)Ч104 M-1мин-1 соответственно (по данным эстеразного профиля, Отсутствие ингибирования НТЭ in vivo, характеризующее diEt-PFP как безопасное соединение с точки зрения ОНТФОС, может быть связано как с довольно низкой собственной анти-НТЭ активностью diEt-PFP in vitro: ki = (1.31 ± 0.08)Ч102 M-1мин-1 (Табл. 3.1.-7.), так и с высоким защитным эффектом эстераз-скэвенджеров, обусловленным высокой ингибиторной селективностью соединения в отношении БХЭ и особенно КЭ и in vitro: ki (БХЭ)/ki (НТЭ)=34.6, ki (КЭ)/ki (НТЭ)=779 (Табл. 3.1.-7), а также довольно высокой ингибиторной активностью соединения в отношении БХЭ и КЭ in vivo: ED50(БХЭ) = 46.8 ± 1.5; ED50(КЭ)= 25.0 ± 1.0 (Табл. 3.5.-3).

Таким образом, результаты эксперимента на целом животном полностью подтверждают высказанную нами гипотезу о различном вкладе эстераз-скэвенджеров — КЭ и БХЭ, в формирование острой и отставленной нейротоксичности ФОС при увеличении гидрофобности соединения, сделанныена основании анализа эстеразного профиля. А именно: для более гидрофобного diBu-PFP наблюдается выраженный защитный эффект КЭ и БХЭ в отношении развития острой токсичности и снижение данного эффекта в отношении развития ОНТФОС; в то время как для менее гидрофобного diEt-PFP наоборот: защитный эффект эстераз-скэвенджеров выше в отношении ОНТФОС по сравнению с острой токсичностью.

Селективные ингибиторы КЭ плазмы крови мышей

Известно, что карбоксилэстеразы являются детерминантой в фармакокинетике большинства терапевтических средств, содержащих сложноэфирную или амидную группировку.

Литературные данные и полученные нами результаты, показывают, что для грызунов свойственна высокая активность КЭ плазмы (ES1), в то время как у человека активность КЭ в плазме практически отсутствует [173], что осложняет экстраполяцию результатов с животных на человека при доклинических, в том числе фармакокинетических исследованиях потенциальных лекарственных средств, содержащих сложноэфирные или амидные группы, а также при токсикологических исследованиях. Это обусловливает потребность в селективных ингибиторах КЭ для проведения исследований на плазме мышей и на целом животном. В последнем случае ингибиторы КЭ плазмы мышей должны также обладать низкой острой токсичностью.

Основываясь на результатах экспериментов, проведенных в настоящей работе, мы оценили возможность использования diBu-PFP и diEt-PFP в качестве селективных ингибиторов КЭ плазмы мышей в исследованиях на препаратах крови in vitro и на уровне целого организма.

Использование diEt-PFP в концентрации 1Ч10−5 М и diBu-PFP в концентрации 1Ч10−7 М позволяет селективно ингибировать КЭ в крови мышей, не затрагивая существенно активности АХЭ и БХЭ.

Мы также исследовали длительность ингибирования КЭ в препаратах крови мышей после инкубации с более эффективным ингибитором КЭ — diBu-PFP, в концентрации 1Ч10−7 М.

Таким образом, diBu-PFP эффективно избирательно и длительно ингибирует КЭ плазмы мышей in vitro, что позволяет рассматривать его как инструмент для стабилизации потенциальных лекарственных соединений, содержащих сложноэфирные группы, в фармакокинетических исследованиях на грызунах in vitro.

Полученные результаты позволяют рассматривать diBu-PFP и в меньшей степени diEt-PFP как эффективные и селективные ингибиторы КЭ в препаратах крови мышей in vitro.

Результаты экспериментов на целом животном (анализ дозозависимостей ингибирования эстераз крови мышей через 1 час после однократного в/бр введения возрастающих доз diEt-PFP и diBu-PFP, Глава 3.5.2) показывает, что diEt-PFP (Рис. 3.5.-2А) в дозе 45 мг/кг (0.22 LD50) эффективно (на 80%) ингибирует КЭ, не затрагивает активность АХЭ, при этом он также снижает активность БХЭ на 50%.

В случае diBu-PFP (Рис. 3.5.-2Б) полное ингибирование КЭ достигается при дозе 10 мг/кг (< 0.004 LD50), в то время как активность БХЭ снижается незначительно, изменений активности АХЭ при этой дозе не наблюдается.

Следует отметить, что отношение LD50/ED50(КЭ) — терапевтический индекс соединения, для diBu-PFP составляет 800 Т. е. эффект ингибирования КЭ проявляется в дозах, значительно меньших LD 50. Для diEt-PFP этот показател равен 8.

Наряду с высокой ингибиторной активностью и селективностью в отношении КЭ и низкой острой токсичностью, diBu-PFP, как было нами показано ранее (Глава 3.5.1.) является нейропатичным соединением (ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ) = 4.1). Однако полное ингибирование КЭ плазмы достигается при низких дозах diBu-PFP (10 мг/кг), не влияющих на активность НТЭ мозга (ED50(НТЭ) = 127.3 мг/кг), что позволяет рассматривать diBu-PFP в качестве эффективного селективного малотоксичного ингибитора КЭ плазмы крови мышей in vivo в указанных дозах. Анализ полученных результатов показал, что diBu-PFP является более эффективным и селективным ингибитором КЭ плазмы мышей, чем diEt-PFP. Использование diBu-PFP позволяет уже в малых дозах необратимо ингибировать КЭ плазмы крови мышей, не затрагивая активности остальных эстераз, при этом данное соединение обладает низкой острой токсичностью (LD50 >2000 мг/кг) и высоким терапевтическим индексом, что позволяет рассматривать его в качестве нового эффективного ингибитора КЭ плазмы крови мышей in vitro и in vivo при исследовании на грызунах фармакологически активных веществ, содержащих гидролитически нестабильные сложноэфирные или амидные группы.

Таким образом, ингибиторная активность и селективность diEt-PFP и diBu-PFP в отношении КЭ, предсказанная при анализе эстеразного профиля данных соединений, проявляется на уровне целого организма. На примере данных соединений, показано, что анализ эстеразного профиля позволяет прогнозировать биологические эффекты соединений и их потенциальную применимость в качестве фармакологических агентов, а также их потенциальные нежелательные (побочные) эффекты.

Проведенные эксперименты показали, что анализ эстеразного профиля фосфорорганических соединений, т. е. их ингибиторная активность и селективность в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ, определяемые в экспериментах in vitro (на ферментных препаратах), позволяет прогнозировать эффекты данных соединений на уровне тканей и целого организма (ингибиторную активность и селективность соединений в отношении эстераз мозга и крови) и дает информацию о механизмах формирования токсичности ФОС, включая защитную роль эстераз-скэвенджеров.