Контроль возбудителей острых кишечных инфекций на основе полимеразной цепной реакции в реальном времени

В медицинской практике при поиске возбудителей пищевых токсико-инфекций и определении направлений противоэпидемических мероприятий важным является сочетание быстроты и качества проведения исследований. Условия и факторы, способствующие распространению этих инфекций, многообразны. Ими могут быть как не выявленные источники инфекции, так и множественные пути и факторы передачи инфекции. Одним из самых современных и удобных вариантов лабораторной диагностики является метод ПЦР-РТ с использованием тест-систем в формате «мультиплекс».

В проведенных нами исследованиях для постановки ПЦР-РТ в формате «мультиплекс» использовали набор реагентов для выявления и дифференциации ДНК микроорганизмов рода Shigella (Shigella spp.) и энтероинвазивных E. coli (EIEC), Salmonella (Salmonella spp.) и Campylobacter (Campylobacter spp.), аденовирусов F (Adenovirus F) и РНК ротавирусов группы, А (Rotavirus A), норовирусов 2 генотипа (Norovirus 2 генотип) и астровирусов (Astrovirus) в объектах окружающей среды и клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора. Выделение ДНК и РНК из исследуемого материала проводили с использованием набора «РИБО-сорб», производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, а также с помощью автоматическую станцию для экстракции нуклеиновых кислот «NucliSENS® easyMAG^TM» («BioMerieux», Франция). Для перевода РНК в форму кДНК использовали реакцию обратной транскрипции. Амплификацию проводили на приборе «Rotor Gene 6000» (производства «Corbett Research», Австралия). На амплификаторе запускали программу для тестов «Shig/Salm» и «Camp/Adeno», и для тестов «Noro/ВКО» и «Rota/Astro». Допускается использование универсальной программы амплификации для всех образцов.

Поводили индикацию Shigella spp., EIEC, Salmonella spp., Campylobacter spp., Adenovirus F, Rotavirus A, Norovirus 2 генотип, и Astrovirus в объектах окружающей среды (вода открытых водоемов, вода бассейнов, смывы с поверхностей. Всего исследовано 118 проб воды бассейнов с различной системой водоподготовки (хлорированием — с концентрацией остаточного хлора 0,3 мг/л и озонированием) и 120 смывов с поверхностей на наличие вышеперечисленных патогенов в осенне-зимний период. мультиплексный полимеразный нуклеиновый бактериальный Термином «сальмонеллезы» обозначают большую группу острых инфекционных заболеваний, возбудителями которых являются многочисленные серовары рода Salmonella. Они характеризуются значительным полиморфизмом течения с преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта и высокой степенью выраженности симптомов общей интоксикации, и могут встречаться как в виде спорадических случаев, так и групповых заболеваний (5).

Сальмонеллы принадлежат к числу микроорганизмов, широко распространенных во всех странах мира; при этом одни из сероваров являются убиквитарными, тогда как другие скорее можно рассматривать как локальные, свойственные определенным регионам (5).

Род Salmonella включен в семейство Enterobacteriaceae. Этот род объединяет более 2200 серовариантов, которые разделены по антигенному родству на 65 серогрупп (представлены в схеме Кауфмана-Уайта). В пределах каждого серовара сальмонеллы подразделяются на биовары, фаговары, кроме того, они различаются по характеру продуцируемого бактериоцина и по устойчивости к действию определенных антибиотиков.

Сальмонеллы являются микроорганизмами, характеризующимися выраженной полипатогенностью. Подавляющее большинство известных ныне серовариантов патогенны как для человека, так и для различных животных и птиц.

Сальмонеллы — мелкие грамотрицательные палочки с закругленными концами от 1 до 4 мкм длиной и 0,3−0,8 мкм шириной. Они, как правило, подвижны благодаря перитрихиально расположенным жгутикам. Некоторые серовары всегда неподвижны. В мазках располагаются одиночно, беспорядочно. Спор и капсул не образуют. Сальмонеллы — аэробы и факультативные анаэробы. Границы температурного режима для роста сальмонелл находятся между +7С и +45С, при этом оптимальной температурой является +35С — +37С (наиболее короткое время генерации). Возможность размножения этих бактерий вне указанных границ не исключается, однако, интенсивность его значительно уменьшается. При температуре ниже +5С рост их полностью прекращается.

Существенное влияние на рост сальмонелл оказывает рН среды. Они могут расти при значениях рН не ниже 4,1 и не выше 9,0, оптимальной концентрацией водородных ионов является 6,5 — 7,5. Рост сальмонелл ограничивается или подавляется в присутствии высоких концентраций солей или сахаров.

Динамика заболеваемости дизентерией с 2000 года до настоящего времени характеризуется стабильным снижением количества случаев заболеваний. Дизентерию в последние десятилетия чаще всего вызывают шигеллы Зоне и Флекснера. В этиологической структуре возбудителей на долю шигелл Зонне и Флекснера приходится по 50%. На фоне практически повсеместного снижения заболеваемости дизентерией, остается высокая «вспышечная» заболеваемость как пищевого, так и водного характера, причем при водных вспышках в качестве этиологического агента преобладают шигеллы Флекснера, а при пищевых — шигеллы Зоне. На долю вспышек пищевого характера приходится 73%, водного — 18%, контактно-бытового — 7% от общего их количества. Заболеваемость носит сезонный характер, возрастая в летне-осенний период.

Возбудители дизентерии относятся к семейству Enterobacteriaceae роду Shigella. Род Shigella включает 4 группы и соответственно вида: Sh. dysenteriae, Sh. flexneri, Sh. boydii, Sh. sonnei, различающиеся по биохимическим свойствам и составу антигенов.

Шигеллы — грамотрицательные неподвижные палочки с закругленными концами, факультативные аэробы. Не имеют жгутиков (а следовательно — Н-антигена), капсул не образуют. Большинство шигелл имеют фимбрии общего типа, выполняющие функцию адгезии к эпителию слизистой оболочки толстой кишки (5).

Кампилобактериоз — зооантропонозная инфекционная болезнь, характеризующаяся преимущественным поражением желудочно-кишечного тракта, тенденцией к генерализации процесса, развитием септицемии и поражением различных органов и систем. Возбудители — микроаэрофильные грамотрицательные палочки подвижные неспрообразующие бактерии рода Campylobacter. Резервуар и источники инфекции — дикие и сельскохозяйственные животные и птицы. Механизм передачи — фекально-оральный, основной путь передачи — пищевой.

Аденовирусная инфекция — острая вирусная инфекция, характеризующаяся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей, кишечника, лимфоидной ткани и протекающая с умеренно выраженной интоксикацией. Возбудители — ДНК-геномные (линейная двунитиевая ДНК) безоболочечные вирусы семейства Adenoviridae с икосаэдрической симметрией капсида. В данное семейство входят аденовирусы человека, животных и птиц. Большинство из вызываемых ими инфекций ассоциировано с респираторными заболеваниями, часть — с кишечными и глазными инфекциями.

Ротавирусная инфекция — острая вирусная инфекционная болезнь, характеризующаяся преимущественным поражением пищеварительного тракта, общей интоксикацией, дегидратацией. Возбудители ротавирусной инфекции РНК-геномные (геном представлен сегментированной двунитиевой РНК) вирусы семейства Reoviridae, не имеют липидной оболочки. Первоначально вирусы семейства Reoviridae были классифицированы как ЕСНО-вирусы 10 типа. Название представляет собой аббревиатуру английского «respiratory enteric orphans» (респираторно-кишечные «сиротские» вирусы. Резервуар и источник инфекции — человек; хотя вирус патогенен для многих видов животных (2).

Ранее считалось, что патогенные для животных ротавирусы не имеют эпидемиологического значения, однако, выявлены вспышки ротавирусной инфекции, вызванные реассоциантами ротавирусов людей и свиней, описаны случаи заражения ротавирусом собак.

Ротавирусы и аденовирусы длительно сохраняются во внешней среде, довольно устойчивы к воздействию физических и химических факторов. Возможна реализация пищевого и контактно-бытового путей передачи возбудителя.

Астровирусная инфекция — вирусная инфекционная болезнь с фекально-оральным механизмом передачи возбудителя, характеризующаяся нарушением функций пищеварительной системы. Распространена повсеместно. Отмечена зимне-весенняя сезонность в странах с умеренным климатом.

Наиболее часто реализуется водный путь передачи возбудителя, но зарегистрированы и случаи пищевой передачи инфекции, при этом, фактором передачи возбудителя являлись морепродукты.

Возбудитель — РНК-содержащий вирус семейства Astroviridae (геном представлен одноцепочечной РНК позитивной полярности, 6,4 — 7,4×10³ н.о.).

Вирионы астровирусов (Astrovirus) имеют сферическую форму, лишены оболочки. Поверхность нуклеокапсида на электронно-микроскопических фотографиях имеет звездчатую форму. Нуклеокапсид имеет икосаэдрическую симметрию (1).

Ассоциированные с Astrovirus спорадические диарейные заболевания и эпидемические вспышки небактериальной природы, по различным источникам, составляет от 2 до 8%.

Норовирусные инфекции занимают значительное место среди острых кишечных инфекций вирусной этологии. По всему миру регистрируются как спорадические вспышки норовирусной инфекции, так и массовые вспышки и очаги в закрытых коллективах (1).

Механизм передачи вируса фекально-оральный, также реализуются водный, пищевой и контактно-бытовой пути передачи возбудителя. Описаны вспышки при употреблении в пищу устриц, в которых вирус сохраняется до нескольких недель и сохраняет способность к размножению. Доказана возможность норовируса персистировать в воде бассейнов и источниках питьевой воды, накапливаться в ягодах, овощах, птице и мясных продуктах (2). Норовирусы вызывают более 85% небактериальных гастроэнтеритов у проживающих в Европе (4).

Прослеживается осенне-зимняя сезонность подъема заболеваемости. Норовирусы обладают достаточно высокой устойчивостью к воздействию факторов окружающей среды: замораживанию, нагреванию до 60 °C, хлорированию в концентрации от 0,5 до 1,0 мг/л, рН 2,7 и обработке эфиром, этанолом или детергентами (3).

Норовирус (Norovirus) (первоначальное название Norwalk virus), — это РНК-содержащий вирус семейства Caliciviridae. Вирион норовирусов (27 -40 нм) лишен оболочки. Капсид имеет икосаэдрическую симметрию и состоит из 32 субъединиц с чашеобразной формой внешней поверхности и осью симметрии 5-го порядка; более мелкие субъединицы имеют ось симметрии 3-го порядка. Основным Структурным компонентом капсида является капсидный белок СР (capsid protein). Геном норовируса представляет собой одноцепочечную РНК позитивной полярности размером приблизительно 7,3 -8,3 тыс. нуклеотидов.

Для индикации вышеперечисленных возбудителей разработан комплекс лабораторных методов, однако, наиболее эффективным и удобным, в том числе по количеству затраченного на анализ времени, в настоящее время является метод ПЦР-РТ.

Все исследуемые образцы тестировали, используя как метод выделения нуклеиновых кислот с использованием набора «РИБО-сорб», так и автоматическую экстракцию.

Перед выделением нуклеиновых кислот из возбудителей проводили процесс концентрирования проб воды. В случае значительного загрязнения исследуемых проб их предварительно фильтровали через бумажные фильтры. Затем, 1 — 2 мл проб воды концентрировали высокоскоростным центрифугированием (10 мин, 12000g). Смывы с поверхностей брали с помощью комплекта для отбора проб «Portagerm». Затем, сваб отжимали о стенки пробирки, содержащей 2 мл стерильного физиологического раствора и концентрировали высокоскоростным центрифугированием (10 мин, 12000g). Для выделения нуклеиновых кислот с помощью набора «РИБО-сорб» использовали 100 мкл осадка. Для экстракции НК на автоматической станции «NucliSENS® easyMAG^TM» использовали 150 мкл осадка.

Лизис при автоматической экстракции проводили вне прибора в течение 30 минут с внесением внутреннего контроля вместе с сорбентом. Далее экстракцию проводили в автоматическом режиме.

Для детекции РНК-содержащих вирусных агентов: Rotavirus A, Norovirus 2 генотип, и Astrovirus непосредственно после этапа экстракции РНК проводили реакцию обратной транскрипции в соответствии с инструкцией к тест-системе «АмплиСенс ОКИ скрин-FL», производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора. Готовый препарат кДНК использовали для постановки реакции амплификации.

На рис. 1 показаны кривые мультиплексной реакции амплификации микроорганизмов рода Shigella (Shigella spp.) и энтероинвазивных E. coli (EIEC), Salmonella (Salmonella spp.) и Campylobacter (Campylobacter spp.), аденовирусов F (Adenovirus F) и РНК ротавирусов группы, А (Rotavirus A), норовирусов 2 генотипа (Norovirus 2 генотип) и астровирусов (Astrovirus).

Рис. 1. Кривые мультиплексной реакции амплификации возбудителей острых кишечных инфекций.

Как видно из данных, представленных на рисунке 1, положительные контроли и внутренние контроли имеют характерные кривые, отрицательные контроли лежат ниже базовой линии, что свидетельствует об отсутствии ингибиторов и нормальном прохождении реакции с возможностью интерпретации результатов. При этом, использование автоматического экстрактора нуклеиновых кислот сокращает время анализа в 3 раза.

Результаты мониторинговых исследований индикации возбудителей пищевых токсико-инфекций в пробах воды и смывах с поверхностей представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты исследований проб воды и смывов с поверхностей на наличие возбудителей пищевых токсико-инфекций.

• · Число проанализированных проб воды — 118;
• · Число проанализированных смывов с поверхностей — 120.

Показана возможность использования прибора «NucliSENS^® easyMAG^TM» («BioMerieux», Франция) в комплексе с коммерческими тест-системами «АмплиСенс» для автоматизации ПЦР-исследований, что позволяет повысить количество проводимых исследований и значительно сократить время проведения анализа, а также в значительной мере позволит исключить ошибки оператора при «ручном» выделении, и устранить связанную с этим возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

Показано, что применение методологии «мультиплексной» ПЦР в сочетании с автоматической экстракцией способно значительно повысить информативность анализа при сокращении времени его проведения, а также проводить качественную дифференциальную диагностику возбудителей вирусных инфекций. Кроме того, применение данной технологии позволяет многократно повысить результативность диагностических исследований.

• 1. Кальцивирусная инфекция: клиника, диагностика, лечение: Методические рекомендации. — М., 2006.-19с.
• 2. Hansman G. S., Sano D., Ueki Y. et al. Sapovirus in water, Japan // Emerg. Infect. Dis. — 2006/ - Vol.131/ - p.133−135.
• 3. Hansman G. S., Oka T., Okamato R. et al. Human sapovirus in Clams, Japan // Emerg. Infect. Dis. — 2007/ - Vol.132/ - p.620−622.
• 4. Lapman B. A. Adak G. K. Reacher M. H. et al. Two epidemiologic patterns of norovirus outbreaks: surveillance in England and wales, 1992;2000 // Emerg. Infect. Dis. — 2003/ - Vol.9/ - p.71−77.
• 5. Рут Ф. Гастроэнтерология. — М.: Медицина, 1985. — С. 350 — 351.