Микробиологическое получение рибофлавина

КУРСОВАЯ РАБОТА на тему

Микробиологическое получение рибофлавина

1. РЕФЕРАТ Ключевые слова: Рибофлавин, Bacillus subtilis, биосинтез, биомасса, закономерности роста, ферментация, ферментер, сахароза.

Целью курсовой работы является проектирование типового производства рибофлавина (витамина B₂).

В курсовой работе рассмотрены теоретические основы производства. Описаны основные и вспомогательные процессы на всех стадиях производства рибофлавина. Также представлен эскиз и описание технологической схемы производства.

1. Введение

2. Литературный обзор

3.1 Условия культивирования

4. Характеристики процесса

4.1 Экспоненциальная фаза роста

4.2 Стационарная фаза роста

4.3 Выход рибофлавина от субстрата

5.Технологическя часть

5.1 Приготовление посевного материала

5.2 Производственный этап

5.3 Утилизация отходов

6. Заключение

7. Список использованной литературы

1.

ВВЕДЕНИЕ

Рис. 1 Химическая структура рибофлавина Рибофлавин, или витамин В2- один из наиболее важных водорастворимых витаминов, кофермент многих биохимических процессов. Название «рибофлавин» произошло от его внутренних составляющих: рибозы и природного жёлтого пигментафлавина.

В начале ХХ века было замечено, что под воздействием тепла некоторые витамины группы В вели себя по-разному: одни разрушались, а другие оказывались более устойчивыми к высоким температурам.

Это наблюдение позволило отделить витамин В1, очень неустойчивый к действию тепла, от витамина В2, который легко переносит высокие температуры, совершенно не меняя своей молекулярной структуры. В 1933 г эту устойчивую к теплу молекулу выделили из вещества, окрашенного в жёлтый цвет, и назвали «лактофлавином». Затем это вещество искусственно синтезировали, и оно получило своё нынешнее название «рибофлавин».

В организме человека рибофлавин синтезируется кишечной микрофлорой. Как и все витамины группы В, витамин В2 является водорастворимым, легко всасывается и выводится из организма, не накапливаясь. Из всех форм витаминов группы В витамин В2 расходуется быстрее всего.

В промышленности рибофлавин получают химическим или более приоритетным биотехнологическим синтезом. Недостатком химического синтеза рибофлавина является сложность технологического процесса и низкий выход целевого продукта.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР рибофлавин витамин производство Рибофлавин (витамин В₂) является незаменимым витамином, то есть не синтезируется организмом человека и животных. Рибофлавин принадлежит к группе коферментных витаминов и участвует в синтезе окислительновосстановитсльиых ферментов — флавопротеинов.

Биосинтез рибофлавина культурами Bacillus subtilis в настоящее время является наиболее перспективным способом получения данного витамина в промышленных целях.

В. subtilis является излюбленным объектом классической генетики и очень удобен для генно-инженерных манипуляцией. Кроме того, штаммы Bacillus subtilis обладают высокой степенью толерантности, т. е. могут расти в широком диапазоне значений температуры, рН и других важных физиологических параметров.

В конце 60-х годов появились первые работы, посвященные исследованию биосинтеза рибофлавина культурами Bacillus subtilis. Методами генетической инженерии были созданы высокопродуктивные рекомбинантные штаммы Bacillus subtilis, способные к сверхсинтезу рибофлавина. Штаммы Bacillus subtilis являются более технологичными и продуктивными по сравнению с культурами, использованными ранее. В последние годы высокопродуктивные рекомбинантные штаммы Bacillus subtilis были созданы в Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГНИИгенетика).

Целью данной работы явилось изучение закономерностей роста и продукции рибофлавина штамма Bacillus subtilis — специализированного продуцента витамина В₂. Изучали культуру Bacillus subtilis при периодическом выращивании.

2.1 УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ В качестве продуцента рибофлавина в работе используется рекомбинантный штамм Bacillus subtilis Y51. Штамм содержит автономно реплицирующуюся плазмиду, несущую рибофлавиновый оперон В. subtilis и селективный маркер Ег^г.

Посевной материал выращивали в жидкой среде LB при 37° и интенсивном перемешивании.

Ферментационная среда включает в качестве ростовых факторов пекарские дрожжи— 20 г/л, кукурузный экстракт- 6,2 г/л, а кроме того, сахарозу— 30 г/л; MgS0₄— 0,6 г/л; (NH)₄S0₄— 5 г/л; КН₂PO₄— 0,75 г/л; К₂НPO₄ — 2,5 г/л.

В течение процесса культивирования в ферментер подается подпитка, содержащую сахарозу (36%).

Скорость подпитки составляет 3,0 мл/ч при начальном объеме культуральной жидкости 300 мл.

Парциальное давление кислорода поддерживают в диапазоне 30−60%, изменяя частоту вращения мешалки (600−1100 об/мин) при постоянной аэрации (0,3 л/мин).

Культивирование проводится при 37°. Значение рН 7,2±0,2 поддерживали 6%-ным раствором (NH)₄OH и 5%-ным раствором H₂S0₄.

Концентрацию рибофлавина в культуральной жидкости определяют спектрофотометрическим методом.

Для определения абсолютно сухой биомассы (АСБ), последнюю отделяют от культуральной жидкости путем центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы и глицерина. Разработанный метод позволяет с точностью не менее 5% определять концентрацию биомассы свыше 1,5 г/л в сложных по составу средах, содержащих нерастворимые компоненты (дрожжи, кристаллы рибофлавина и так далее).

3. ХАРАКТЕРИСТИКИ ПРОЦЕССА На рис. 2 приведены данные, касающиеся типичного процесса ферментации штамма Bacillus subtilis.

Рис. 2 Концентрация биомассы и рибофлавина в зависимости от времени культивирования Процесс проводили с принудительной подпиткой, которую начинали подавать после 6 часов культивирования с постоянной скоростью (3 мл/ч). Приведены концентрации биомассы (АСБ) и рибофлавина в зависимости от времени культивирования. Как видно из графиков на рис. 2, процесс разбивается на три ярко выраженных этапа:

1. Лаг-фаза (0—3 часа), при которой отсутствует как рост, так и сколько-нибудь значительный синтез рибофлавина;

2. Фаза экспоненциального роста (6—16 часов), в ходе которого рибофлавин синтезируется со значительной скоростью;

3. Стационарная фаза, в течение которой рост практически отсутствует, а скорость синтеза рибофлавина в ходе культивирования существенно снижается (16— 116 часов).

4. Характеристики процесса

4.1Экспоненциальная фаза роста На рис. 3 в полулогарифмическом масштабе изображены зависимости концентрации биомассы и рибофлавина от времени культивирования в экспоненциальной фазе роста. Как видно, концентрация рибофлавина (как и биомасса) экспоненциально возрастает с ростом времени культивирования.

Рис. 3 Концентрация биомассы (АСБ) и рибофлавина в экспоненциальной фазе роста в зависимости от времени культивирования; rкоэффициент корреляции Рассмотрим рост культуры на среде с сахарозой в качестве основного источника углерода. Рост и синтез рибофлавина может быть описан следующим образом:

(1)

(2)

(3)

где t — время культивирования, ч; X — концентрация биомассы, г/л; R — концентрация рибофлавина в ферментере, г/л; S — концентрация сахарозы в ферментере, г/л; S_OP — концентрация сахарозы в подпитке, г/л; F — скорость подачи подпитки, мл/ч; V — объем культуральной жидкости, мл; — выход биомасса на единицу массы потребленного субстрата (сахарозы). г/г; — коэффициент конверсии, г/г; µ — удельная скорость роста, ч^-1; q_R —удельная скорость синтеза рибофлавина, ч^-1.

В экспоненциальной фазе роста удельная скорость роста µ= 0,26 ч^-1 = constant, а удельная скорость синтеза рибофлавина q_R = 0,29 ч^-1 = constant.

В этом случае рост концентрации биомассы (X) описывается как:

(4)

Для концентрации рибофлавина R:

(5)

Интегрируя уравнение (1) получим:

Для вычислений в качестве исходных использованы следующие значения параметров: t₀ = 6 ч — время лагфазы; S₀ = 30 г/л — концентрация сахарозы в исходной среде; S_OP= 360 г/л — концентрация сахарозы в подпитке; F = 3 мл/ч — скорость подачи подпитки; V₀ = 300 мл — первоначальный объем культуральной жидкости; Х₀ = 1,5 г/л — начальная концентрация биомассы; R₀ = 0,03 г/л — начальная концентрация рибофлавина; = 0,4; = 0,045.

На рис. 4 приведены зависимость остаточной концентрации сахарозы, рассчитанная по уравнению (6), и экснерименгальные значения данной величины. Как видно, имеется вполне удовлетворительное соответствие расчетной величины с экспериментальными данными на экспоненциальном участке кривой роста.

4.2 СТАЦИОНАРНАЯ ФАЗА РОСТА В стационарной фазе роста µ = 0. следовательно,

Предполагая, что изменение остаточной концентрации сахарозы мало (что по нашим данным соответствует действительности), а коэффициент конверсии Y_RS = constant, имеем = 0.

В этом случае или

(7)

R_0l — концентрация рибофлавина в ферментере по завершении экспоненциальной фазы роста (1,8 г/л в нашем эксперименте).

Положим, = 0,1 = constant в течение стационарной фазы роста.

На рис. 5 представлены экспериментальная и рассчитанные по формулам (5) и (7) кривые зависимости концентрации рибофлавина от времени культивирования.

Рис. 5. Экспериментальная и теоретическая кривые зависимости продукции рибофлавина от времени культивирования Как видно, на участке 6—50 ч культивирования наблюдается вполне удовлетворительное совпадение кривых. Однако к 72 ч расхождение экспериментальной и расчетных величин становится значительным (12,1 г/л в эксперименте против расчетной величины 16,5 г/л).

Последнее можно интерпретировать как снижение коэффициента конверсии на последней стадии культивирования клеток. Причины последнего неясны. Не исключено, например, что в процессе культивирования в среде накапливаются вторичные метаболиты, угнетающие синтез рибофлавина.

4.3 ВЫХОД РИБОФЛАВИНА ОТ СУБСТРАТА (Коэффициент конверсии) Оценка выхода рибофлавина в расчете на потребленную сахарозу (коэффициент конверсии) является важной для выработки стратегии культивирования продуцентов рибофлавина.

Расчет искомой величины в стационарной фазе роста достаточно прост, поскольку в данном случае сахароза на рост биомассы не используется (расход на поддержание мы не учитываем за его малостью). Кроме того, остаточная концентрация сахарозы в культуральной жидкости в стационарной фазе роста пренебрежимо мала. Учитывая вышесказанное, средний коэффициент конверсии в промежутке времени t_n м t_n-1) можно рассчитать из следующего соотношения:

(8)

Где — концентрация рибофлавина и объем культуральной жидкости в моменты времени, соответственно.

Несколько сложнее рассчитать в логарифмической фазе роста, поскольку часть сахарозы здесь идет на рост биомассы.

В нашем случае = 0.42 (здесь приводится усредненная величина по времени на участке 6—14,5 часов), а величину можно определить из соотношений (2)—(3), переписав их в виде:

Учитывая, что dR = dX, имеем:, отсюда, или, используя уравнение (9),

. (10)

На рис. 7 приведены расчетные значения выхода рибофлавина на единицу массы потребленной сахарозы. Расчеты были выполнены для логарифмической фазы (6—15 часов), исходя из соотношения (10), а для стационарной фазы (19—116 часов) использовано соотношение (8).

Рис. 7 Зависимость выхода рибофлавина по сахарозе (Коэффициент конверсии) от времени культивирования Как видно, обсуждаемая зависимость имеет достаточно острый максимум в районе 19—24 ч, где выход достигает значения 0,16.

Этот участок соответствует концу логарифмической фазы и началу стационарной.

Таким образом, в наших условиях максимальная скорость синтеза рибофлавина имеет место в логарифмической фазе роста (q_R = 0,29 ч^-1), при этом концентрация рибофлавина в ферментере растет экспоненциально. Переход в стационарную фазу роста сопровождается снижением удельной скорости синтеза рибофлавина.

На рис. 7 приведена зависимость удельной скорости роста рибофлавина q_R от времени культивирования.

Рис. 7 Зависимость удельной скорости синтеза рибофлавина q_R от времени культивирования Как видно из графика, величина q_R снижается с 0,29 ч^-1 (6—16 ч) до 0,003 ч^-1 за 96 ч культивирования.

Логарифмическая фаза роста характеризуется низкой эффективностью утилизации субстрата (сахарозы): выход рибофлавина по сахарозе на данном этапе составляет 3—5%, переход к ранней стационарной фазе приводит к значительному повышению выхода до 15—16% и существенному снижению скорости синтеза рибофлавина (см. рис. 6). В ходе стационарной фазы выход рибофлавина вновь снижается, достигая в поздней стационарной фазе значений 4—6%.

5.ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Рибофлавин — содержится в клетках различных микроорганизмов, будучи коферментом в составе флавопротеинов (прежде всего — соответствующих ферментов из класса оксидоредуктаз — ФМН, ФАД). Поэтому в качестве продуцентов рибофлавина (флавопротеинов) могут быть бактерии, дрожжи и нитчатые грибы. Однако наиболее заманчивыми являются те штаммы, которые образуют на жидких средах 0,5 г и более рибофлавина в 1 л среды. К подобным организмам относятся Bacillus subtilis, Eremothecium ashbyii и Candida guilliermondii. Учитывая изменчивость активных продуцентов названных видов по способности синтезировать витамин В2, необходим систематический отбор культур в процессе их эксплуатации на производстве. Обычно активные продуценты первых двух видов формируют яркооранжевые колонии на агаризованных средах. Методами генной инженерии удалось получить штамм сенной палочки, образующий около 6 г рибофлавина в 1 л среды, включающей мелассу, белково-витаминный концентрат и его гидролизат.

Высокий выход рибофлавина у Bacillus subtilis коррелирует с азотом пуринов и другими азотистыми источниками, содержание которых должно быть достаточным. В качестве источников углерода применяют глюкозу или сахарозу, практикуют использование дрожжевого и кукурузного экстрактов, соевой муки, масла (жира). Жидкие питательные среды для получения инокулюма и для основной ферментации могут несколько различаться между собой. Например, для получения посевного материала известна среда, содержащая сахарозу, пептон, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, магния сульфат, подсолнечное масло, время выращивания продуцента на этой среде — 2 суток при 27−30 С^О (в зависимости от штамма). Ферментационная среда обычно включает кукурузную и соевую муку, сахарозу, кукурузный экстракт, калия дигидрофосфат, кальция карбонат, натрия хлорид и ненасыщенный жир.

Обычно ферментацию проводят в течение 5 суток при рН 5,5- 7,7. После использования сахарозы (примерно через 30 часов) начинает заметно накапливаться витамин В2, вначале — в мицелии, а затем — в культуральной жидкости. Всю биомассу можно подвергнуть высушиванию и полученный сухой продукт с остаточной влажностью 8%, содержащий 1,5−2,5% рибофлавина, 20% белка, тиамин, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, микроэлементы и другие вещества.

В случае высоких выходных показателей по рибофлавину, витамин можно выделять в индивидуальном состоянии и, наряду с синтетическим рибофлавином, использовать в медицине.

5.1 ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА Лабораторный этап заключается в приготовлении рабочего посевного материала. Для этого исходный штамм Bacillus subtilis, сохраняемый в состоянии анабиоза (высушенный на стерильной почве, песке, пшене путем лиофилизации или сублимационной сушки) оживляют добавлением стерильной жидкой питательной среды, а затем высевают на уплотненную питательную среду и проверяют на чистоту культуры. После оживления проводят пересев штамма на среду возрастающих объемов, переходя постепенно от пробирок к колбам (емкостью 1л), бутылям (емкостью 20 л). При этом следует соблюдать соотношение посевного и рабочего объемами 1:10. Коэффициент заполнения емкостей не должен превышать 0,5 — 0,6.

5.2 производственный этап Дальнейшую подготовку посевного материала осуществляют в ферментаторах — инокуляторах, в которых наращивают посевной материал (рис.8). При этом культуру доводят до середины лаг — фазы (когда клетки делятся синхронно). Рабочую культуру подают в инокулятор, заполненный стерильной питательной средой, из расчета 8−10% к объему питательной среды. Во избежание утечки посевного материала в инокуляторах и биореакторах следует поддерживать избыточное давление.

Инокулятор должн отвечать следующим основным требованиям: конструктивные простота, удобство и надежность эксплуатации. Общий объем ферментатора заполняют инокулированной средой на 70 — 80%, 20−30% объема заполняют воздухом, так как культура аэробна.

Микроорганизм в виде суспензии подают из инокулятора в промышленный биореактор, в котором содержится стерильная жидкая питательная среда. При этом не должно произойти попадания каких-либо посторонних микробов в питательную среду вместе с продуцентом. Все соединения системы должны быть герметично закрытыми.

Стерильную питательную среду засевают с соблюдением правил асептики через запорно-регулирующее устройство (рис.9) с посевным материалом, выращенным в лаборатории, поддерживая оптимальный режим в аппарате (температуру, аэрацию и перемешивание) для развития культуры.

Рис. 9 Запорно-регулирующее устройство в системе трубопроводов для засева промышленного ферментатора (2) из инокулятора (1); 3−10 — клапаны; 11 — ловушки конденсатора; АБ — отрезок трубопровода

Рис. 8 Инокулятор: 1 — корпус; 2 — лаз; 3 — смотровое окно; 4 — аэратор; 5 — труба для перепуска посевной культуры в ферментатор; 6 — диффузор; 7 — рубашка; 8 — гильза для термометра; 9 — розетка аэратора; 10 — 12 — штуцера для манометра, гильзы термометра и трубы для передавливания; 13 — 17 — штуцера для загрузки среды, аэратора, выхода воздуха, отбора проб и выхода воды; 18 — штуцер для спуска жидкости

Последовательность операций стерилизации: открывают клапаны 4 и 7 (клапан 3 закрыт) и стерилизуют участок трубопровода АБ паром под давлением 1,055 кг/см 20 мин; конденсат собирают в ловушках 11; закрывают клапаны 7, 8, 9, 10 и открывают клапаны 4, 5, 6; ферментатор охлаждают под давлением очищенного стерильного воздуха, стерильная среда заполняет соединительный трубопровод; повышают давление в посевном аппарате до 0,7 кг/см² при его снижении в ферментаторе до 0,14кг/см, открывают клапан 3 и посевной материал переводят в ферментатор, после чего отключают инокулятор-ферментатор от системы подачи пара, закрыв клапаны 3 и 6; открывают клапаны 7 и 8, спускают пар и конденсат при частично открытых клапанах 4 и 5.

При достижении требуемых стадий развития и количества биомассы посевной материал передавливают стерильным сжатым воздухом по посевному коллектору в посевной аппарат большей вместимости.

На второй ступени выращивания посевного материала стремятся получать больше биомассы клеток, чтобы в ферментаторе можно было создать необходимую для данного штамма продуцента исходную плотность популяции. Если это требование выполнимо без второй ступени, то ферментационную среду засевают непосредственно из инокулятора.

Все ферментаторы цеха соединены между собой несколькими коллекторами: посевным, благодаря которому можно засевать среду в любом ферментаторе из любого посевного аппарата; коллектором подачи стерильной питательной среды; коллектором подвода стерильного сжатого воздуха к индивидуальным фильтрам; коллектором отработанного воздуха, выходящего из ферментатора; коллектором перекачивания культуральной жидкости из ферментатора. В случае проведения ферментаций в заведомо нестерильных условиях питательную среду и воздух для аэрации не стерилизуют, но посевной материал всегда выращивают на стерильных питательных средах в асептических условиях.

При микробиологическом синтезе рибофлавина используют ферментаторы периодического действия из групп ФЖГ (рис.10). Его конструкция обеспечивает стерильность ферментации в течение длительного времени (несколько суток) при оптимальных условиях для роста и жизнедеятельности продуцента.

Как видно из рисунка, это цилиндрический вертикальный аппарат со сферическим днищем, снабженный аэрирующим, перемешивающим и теплопередающим устройствами. Воздух для аэрации поступает в ферментатор через барботер, установленный под нижним ярусом мешалки.

Рис. 10 Ферментатор периодического действия: 1- турбинная трехъярусная мешалка, 2 — охлаждающий змеевик, 3 — секционная рубашка, 4 - отражательная перегородка, 5 — барботер, П-пар; IXI — материальные и вспомогательные трубопроводы с запорно-регулирующими устройствами (I — посевная линия, IIподача стерильного сжатого воздуха, III — подача пара, IV — удаление отработанного воздуха, V — загрузочная линия, VI — линия введения добавок, VII — подача пеногасителя, VIII — подача моющего раствора, IX — пробоотборник, X — выдача продукта, XI — выдача в канализацию через нижний спуск)

К концу процесса ферментации образуется около 5 — 6 г рибофлавина в 1 л питательной среды. Рибофлавин в культуральной жидкости находится в виде желтых кристаллов, которые легко отделяются центрифугированием.

5.3 Утилизация отходов Все отходы биотехнологических производств подлежат анализу на содержание патогенных микробов. Нетоксичные сухие остатки используются либо в качестве кормовых добавок, либо для приготовления компоста, получения биогаза при метановом брожении. При метановом брожении почти все органические вещества (кроме лигнина) с помощью микроорганизмов преобразуются до метана и углекислоты.

Метан используют в виде топлива, углекислоту — в виде сухого льда. Оставшийся плотный осадок после брожения представляет собой органическое вещество, содержащее гумусовые вещества, которые используют в качестве органического удобрения.

6.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе был описан наиболее рациональный метод производства рибофлавина культивированием Bacillus subtilis. Описаны наиболее благоприятные условия, среда и технологическое оборудование для получения высокого выхода витамина.

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бреслер С. Е., Калинин B.Л., Кривичский B.C., и др. Генетика.1969. -М.: Мир-138 с.

2. Громова Н. Ю., Косивцов Ю. Ю., Сульман Э. М. Технология синтеза и биосинтеза биологически активных веществ: Учебное пособие. Тверь: ТГТУ, 2006. -84 с.

3. Соколов А. К., Гучько М. А., Жданов В. Г. Новый микробиологический способ биосинтеза рибофлавина. Результаты и перспективы научных исследований по биотехнологии и фармакологии. Тез. докл. -М.: Мир, 1989. 22С.

4. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. -М.: Мир, 1978. -331 с.