Генетические маркеры репродуктивного здоровья крупного рогатого скота

Суть метода АС-ПЦР заключается впроведении независимых для каждого аллеля реакций с использованием специфического лишь для одного аллеля праймера в паре с общим праймером. Вывод о генотипе животного в случае двухаллельного признака делается на основании сравнения результатов двух реакций. Зиновьевой Н. А. с соавторами разработан однопробирочный («single tube») метод диагностикиточечных мутаций с использованием АС-ПЦР. Аналогичный метод, названныйBi-PASA (BidirectionalPCRAmplificationofSpecificAlleles) — двунаправленная ПЦР амплификация специфических аллелей былпредложен несколько позжеLiu с соавторами [По Зиновьевой и др., 2008]. Принцип выбора аллелеспецифических праймеров заключается вследующем: два аллелеспецифических"

внутренних" праймера (INT1, INT2), каждый из которых специфичен для одного из двух аллелей, ориентируются в противоположных направлениях и своими последниминуклеотидами на3' конце приходятся на точковую мутацию. При этомпоследний нуклеотид одного из праймеров соответствует нормальному, а другогомутантному аллелю. Предлагаемый дизайн праймеровпредполагает сочетание в одной реакции четырех различныхолигонуклеотидов. Общие для обоих аллелей"

наружные" праймеры (EXT 1, EXT2) локализуются на различном расстоянии от точковоймутации. Таким образом, специфический для одного из аллелей фрагментEXT1-INT1 отличается по длине от амплифицируемого с другого аллеляфрагментаINT2-EXT2 (рисунок 2).Зависимость длины фрагментов от аллеля делает возможнымнепосредственное определение генотипа животного по данному признакупо результатам одной одноступенчатой реакции. Метод лигазной цепной реакции (LCR) основан на использовании термостабильной ДНК-лигазы. Этот фермент способен сшивать одноцепочечные разрывы, если фланкирующие ник (разрыв) нуклеотиды комплементарны матрице. Внутренние специфические для двух различных аллелей праймерыINT1 и INT2 (показаны серыми прямоугольниками) своими последними нуклеотидами приходятся на точковую мутацию (показана звездочкой). В комбинации с наружными праймерами ЕХТ1 и ЕХТ2 (показаны черными прямоугольниками) они приводят к амплификации фрагментов длиной Х п.о. для одного из аллелей и Y п.о. для другого аллеля. Длина общего для обоих аллелей продукта амплификации «наружных» праймеров обозначена Z. Рисунок 2. Схема"single tube" метода аллелеспецифической ПЦР. В реакции используется четыре различных праймера: два аллелеспецифических и два LCR-праймера.

Аллелеспецифические праймеры оринтированы в противоположных направлениях и своими последними нуклеотидами на 3'-конце приходятся на точковую мутацию. LCR-праймеры примыкают с 3'-конца к аллелеспецифическим. Проводится несколько циклов денатурации и лигирования, после чего продукты реакции детектируются с помощью электрофореза в агарозном геле. При диагностике двух аллелей полиморфного локуса необходимо проведение двух независимых реакций со специфическими праймерами к каждому аллелю.

Реакции можно объединить и проводить в одной пробирке, если аллелеспецифические праймеры будут содержать флуоресцентные метки, различные для каждого аллеля. Метод SSCP — полиморфизма структуры одноцепочечной ДНК основан на различной подвижности одноцепочечной ДНК разного состава в неденатурирующем полиакриламидном геле. Традиционный анализ включает несколько стадий: амплификацию целевого фрагмента ДНК, содержащего точковую мутацию, денатурация продуктов ПЦР и разделение их в неденатурирующем полиакриламидном геле. Состав нуклеотидной последовательности определяет вторичную и третичную структуру фрагментов ДНК и, соответственно, различную подвижность при разделении. Оптимальный размер ампликона составляет менее 200 п.н. ПреимуществомSSCP-анализа является его высокаяпроизводительность.

Данный метод может быть легко автоматизирован засчет введения в амплифицируемый фрагмент флуоресцентной метки иприменения метода капиллярного электрофореза с последующейдетекцией фрагментов на капиллярном секвенаторе. Вэтом случае производительность метода может быть значительноповышена за счет одновременного анализа несколькихSNP’s. К недостаткамSSCP анализа следует отнести тот факт, что различияв подвижности фрагментов ДНК не коррелируют с различиями впоследовательности. Это означает, что последовательности двух болеедалеких в генеалогическом дереве видов могут иметь практическиодинаковую подвижность, в то время как ампликоны двух разных семействодного и того же вида могут расходиться в геле более далеко. Такимобразом, единственная информация, которая может быть получена наосновании результатовSSCP, это являются ли продукты ПЦРидентичными или не идентичными. При проведении гетеродуплексного анализа на первой стадии проводят амплификацию фрагмента ДНК, содержащего полиморфный локус.

Затем продукты реакции денатурируют и ренатурируют. Если индивид гомозиготен и обе последовательности коплиментарны, то образуются гомодуплексы. Если индивид — гетерозигота, то возможно образование гетеродуплексов. Гетеродуплексы и гомодуплексы имеют разную электрофоретическую подвижность в неденатурирующем геле. В результате анализа электрофореграмм возможно установление гомоили гетерозиготности индивида по выбранным аллелям[По Зиновьевой и др., 2008].

Метод масс-спектрометрии — относительно новый метод, основанный на ионизации молекул ДНК на матрице. В качестве матрицы используют вещества — доноры протонов. Ионизированные молекулы разгоняются в электрическом поле в вакуумной камере. При этом фиксируется время достижения молекулами детектора и вычисляется их скорость. Поскольку скорость движения молекул ДНК зависит от нуклеотидной последовательности, то данный метод позволяет детектировать однонуклеотидные замены в гомои гетерозиготном состояниях. Метод находит применение вследствие высокой чувствительности (для анализа достаточно нескольких нанолитров раствора ДНК), быстротыанализа (время, затрачиваемое на анализ каждого образца составляет всего несколько секунд), а также высокой производительности (одновременномогут анализироваться несколькоSNP’s).Секвенирование — определение нуклеотидной последовательности ДНК какого-либо гена или участка хромосомы. В настоящее время существует множество различных систем секвенирования: пиросеквенирование, нанопоровое секвенирование.

Преимущества данного метода заключаются в том, что данный метод обладает высокой точностью, толерантен к мутациям. С помощью секвенирования можно определить ранее неизвестные мутации путем секвенирования маркерного гена целиком. К недостаткам метода относят относительную трудоемкость анализа и высокую стоимость. В настоящее время наибольшее распространение получили методы ПЦР-ПДРФ анализа и аллелоспецифической ПЦР в связи с простотой исполнения и низкими временными затратами. Для подобных анализов необходимо малое количество изначальной ДНК, которая может быть выделена из крови, рогов, волос, копыт, спермы животных. Как правило, данные методы применяются для диагностики животных по уже известным генам-кандидатам. При выявлении новых генетических маркеров большое значение имеют методы секвенирования, поскольку они позволяют точно идентифицировать мутации в геноме.

2.2 Метод ПЦР-ПДРФ анализа в детекции маркеров репродуктивного здоровья

Для последующего практического анализа генетических маркеров фертильности нами были выбраны следующие маркеры: ген рецептора прогестерона как маркер женской фертильности и ген спермо-ассоциированнного антигена 11 (SPAG11) как маркер мужской фертильности. Белок SPAG11 играет важную роль в репродуктивных функциях быков. В недавних исследованиях показана ассоциация полиморфизмов данного гена с признаками качества спермы: объем эякулята, концентрация спермы, подвижность сперматозоидов (как свежих, так и после размораживания)[SixnovelSNPinSPAG11 gene …, 2011]. Ген находится на 27 хромосоме в кластере генов бета-дефензинов. Дефензины являются антимикробными молекулами, которые защищают организм от бактерий, грибов и вирусов. Пептиды экспрессируются на поверхности многих эпителиальных тканей, в том числе на поверхности клеток репродуктивных путей. Ген SPAG11 состоит из восьми экзонов и семи интронов, общей протяженностью около 20 000 н.п. Второй интрон содержит дваSNPg.1306G>A, g.1454G>A, восьмой экзон содержит SNPg.22696T>C [SixnovelSNPinSPAG11 gene …, 2011].

Нуклеотидные замены в перечисленных локусах ведут к изменению сайтов рестрикции для эндонуклеаз PsyI, PstI, Eco72I соответственно. В таблице 2 приведены последовательности праймеров, которые могут быть использованы в ПЦР с последующим ПДРФ-анализом.Рестрикция первого фрагмента, полученного в результате ПЦР, с помощью рестриктазы PsyIприведет к появлению фрагментов 124и 184 п.н. в случае генотипаGG, 124 п.н., 184 п.н., и 308 п.н. в случае генотипаAA. Рестрикция второго фрагмента, полученного в результате ПЦР, с помощью рестриктазы PstIприведет к появлению фрагмента в 308 п.н. в случае генотипаGG, 39 п.н., 269 п.н., и 308 п.н. в случае генотипаGA, 39 п.н. и 269 п.н. в случае генотипа АА. Таблица 2 — Характеристика праймеров для амплификации регионов гена SPAG11.№SNPПоследовательность праймеров, 5'-3'Длина ампликона, н.п.1g.1306G>AF:TAAGTGACAGAGCCCGGGATR:AGCAGGCAGACCACAGTATG308 2g.1454G>A 3g.22696T>C F: GAAGAGTCTCCACCACGAATR: CCTTTTGGCTAAGATCAC*G166 Для амплификации третьего фрагмента предлагается использовать обратный праймер с однонуклеотидной заменой (замена второго основания, А на С с 3'-конца праймера).

Данная замена ведет к появлению нового сайта рестрикции для Eco72). Рестрикция третьего фрагмента, полученного в результате ПЦР, с помощью рестриктазы Eco72Iприведет к появлению фрагментов в 17п.

н. и 149 п.н. в случае генотипа

ТТ, 17 п.н., 149 п.н., и166п.

н. в случае генотипа

ТС, 166 п.н. в случае генотипа СС. Ген рецептора прогестерона (PGR) был выбран как маркер женского репродуктивного здоровья у крупного рогатого скота, поскольку в исследованиях показана ассоциация между различными полиморфизмами гена и суперовуляцией у коров, общим числом яйцеклеток и числом эмбрионов, пригодных для трансплантации [Associationanalysisbetweenvariants …, 2011]. Прогестерон является важным регуляторов репродуктивных событий, связанных с наступлением и поддержанием беременности. Рецептор прогестерона является членом суперсемейства ядерных рецепторных транскрипционных факторов.

Его экспрессия повышается в ответ на действие лютеинизирующего гормона. Два известных полиморфизма гена рецептора прогестерона G59752C и T81637C находятся в третьем и четвертом интронах гена соответственно [YangW. C. etal., 2011]. В таблице 3 приведены нуклеотидные последовательности праймеров для амплификации локусов. Таблица 3 — Характеристика праймеров для амплификации регионов гена PGR.№SNPПоследовательность праймеров,, 5'-3'Длина ампликона, н.п.1G59752CF:GTGAATTTGCTCCAAGATTR: GCCCGACCTTCCCATAA8692T81637CF: CCCATCCCTTAGCATCTTCCR: TTACCAACGCTGACCCGAAG515Рестрикция первого фрагмента, полученного в результате ПЦР, с помощью рестриктазы AdeIприведет к появлению фрагмента в 869п.

н. в случае генотипаGG, 869 п.н., 662 п.н., и207п.

н. в случае генотипаCG, 207п.

н. и 662 п.н. в случае генотипа CC. Рестрикция второго фрагмента, полученного в результате ПЦР, с помощью рестриктазы Eco321приведет к появлению фрагмента в 515п.

н. в случае генотипаTT, 398 п.н., 117 п.н., и515п.

н. в случае генотипаTC, 398п.

н. и 117п.

н. в случае генотипа CC. заключение

Молекулярно-генетические маркеры — это гены или последовательности ДНК с известной локализацией на хромосоме. Различают маркеры двух типов для ядерной ДНК, а также маркеры митохондриальной ДНК. Маркеры всех типов могут быть использованы в маркер-зависимой селекции домашних животных, в том числе крупного рогатого скота. Признаки репродуктивного здоровья крупного рогатого скота обладают низкой наследуемостью, вследствие чего данные признаки сложно улучшить путем традиционной селекции по фенотипу. Использование ДНК-маркеров позволяет увеличить скорость генетического улучшения фертильности животных.

Комбинация диагностики генетических маркеров и использования репродуктивных технологий, таких как искусственное оплодотворение, забор спермы и ооцитов, интраплазматическая инъекция спермы и многих других, позволяет значительно улучшить интенсивность и точность селекции, снизить интервал генерации. В настоящее время предложено множество генов-кандидатов мужской и женской фертильности. Как правило, это гены, продукты которых задействованы во время образования и созревания половых клеток, гормональной регуляции цикла размножения, в протекании беременности и лактации у самок. Требуются дополнительные исследования маркеров, с целью выявить надежные корреляции генов с признаками репродуктивного здоровья крупного рогатого скота и подбора оптимальной комбинации генетических маркеров, которые могут быть затем использованы в маркер-зависимой селекции животных. Для выявления генетических маркеров используют следующие методы: метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов в сочетании с гибридизацией по Саузерну или полимеразной цепной реакцией, метод аллелеспецифической полимеразной цепной реакции, метод лигазной цепной реакции, метод полиморфизма структуры одноцепочечной ДНК, гетеродуплексный анализ, масс-спектрометрия, секвенирование. Наиболее широко используемыми из вышеперечисленных методов являются методы, основанные на полимеразной цепной реакции в силу невысокой стоимости, быстроты и простоты анализа. Мы предлагаем использовать ген спермо-ассоциированного антигена 11 SPAG11 и ген рецептора гормона прогестерона PGR как маркеры репродуктивного здоровья крупного рогатого скота.

Для детекции полиморфизмов в указанных генах будет использован метод полимеразной цепной реакции с последующим анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов.

библиографическийсписок1.Зиновьева Н. А., Кленовицкий П. М., Гладырь Е. А., Никишов А. А. Современные методы генетического контроля селекционных процессов исертификация племенного материала в животноводстве. М., 2008. 329 с.

2. Состояниевсемирныхгенетическихресурсовживотныхвсферепродовольствияисельскогохозяйства // Доклад ФАО.М., 2010. 52 с. 3. A ssociationanalysisbetweenvariantsinbovineprogesteronereceptorgeneandsuperovulationtraitsinChineseHolsteincows / W.

C. Y ang [et al.] //Reprod. D om. A nim. 2011. №

46. P. 1029−1034.

4. Association between IGF-IR gene polymorphisms and productive and reproductive traits in Holstein cows / W. S choenau[et al.] // Aq. B

ras. M ed. V et.

Z ootec. 2005. № 57.

P. 772−776.

5. Blood COX-2 and PGES gene transcription during the peripartum period of dairy cows with normal puerperium or with uterine infection /E.Silva [et al.] // Domest. Anim. Endocrinol. 2008. № 35. P. 314−323.

6. Candidate gene markers for sperm quality and fertility in bulls /C. Mishra [et al.] // Veterinary World.

2013. № 6(11). Р. 905−910.

7. Cinar M.U., Tsujii H., Schellander K. Intracellular signaling cascades induced by relaxin in the stimulation capacitation and acrosome reaction in fresh and frozen-thawed bovine spermatozoa. // Animal Reproduction Science. 2011. № 125(1−4). Р.30−41.

8. Effects of novel single nucleotide polymorphisms of the FSH beta-subunit gene on semen quality and fertility in bulls / L.S. Dai [et al.]// Animal Reproduction Science. 2009. № 114. Р.14−22.

9. Expression of prolactin-related protein 1 at the fetomaternal interface during the implantation period in cows / O. Yamada [et al.] // Reproduction. 2002. № 124. Р. 427−437.

10. G eizert R.D., Yelich J.V. Regulation of conceptus development and attachment in pigs// J. R eprod. F ertil. 1997.

S uppl. 52. P. 133−149.

11. Glycolysis and mitochondrial respiration inmouse LDHC-null sperm / F. Odet [et al.]// Biology of Reproduction. 2013. № 88(4). Р.95−95.

12. Kirkpatrick B.W., Byla B.M., Gregory K.E. Mapping quantitative trait loci for bovine ovulation rate // Mammalian Genome. 2000. № 11. P. 136−139.

13. Mahmoud K.G.M., Nawito M.F. Molecular markers for fertility in farm animals // Iranian journal of applied animal science. 2012. № 2(3). Р. 203−222.

14. M annaertz B., Uilenbrock J., Schot P., De Leeuw R. F olliculogenesis in hypophysectomized rats after treatment with recombinant human follicle stimulating hormone // Biol.

R eprod. 1994. № 51. Р.72−81.

15. M olecular characterization and expression profile of uterine serpin (SERPINA14) during different reproductive phases in water buffalo (Bubalus bubalis) / S. K andasamy [et al.] // Anim. R eprod. S

ci. 2010. № 122. Р. 133−141.

16. M onget P., BondyC. I mportance of the IGF system in early folliculogenesis // Mol. C ell. E

ndorcrinol. 2000. № 163. Р.

89−93.

17. Moura A.A., Kos H., Chapman D.A., Killian G.A. Identification of proteins in the accessory sex gland fluid associated with fertility indexes of dairy bulls: a proteomic approach // Journal of Andrology. 2006. № 27.Р. 201−211.

18. P an, Q. PLC z functional haplotypes modulat ing promoter transcriptional activity are associated with semen quality traits in Chinese Holstein bulls. // PL oS ONE.

2000. № 8(3). e58795.

19. Sato H. Group III secreted phospholipase A2 regulates epididymal sperm maturation and fertility in mice // Journal of Clinical Investigation. 2010.№ 120. Р. 1400−1414.

20. S ix novel SNP in SPAG11 gene and their association with sperm quality traits in Chinese Holstein bulls / X. L iu[et al.] // Animal reproduction science.

2011. № 129. Р. 14−21.

21. Stormshak F., Bishop C.V. Estrogen and progesterone signaling: Genomic and nongenomic actions in domestic ruminants. // Journal of Animal Science. 2008. № 86. P. 299−315.

22. T he steroid receptor coactivator SRC-3 (p/CIP/RAC3/AIB1/ACTR/TRAM-1) is required for normal growth, puberty, female reproductive function, and mammary gland development/ J. Xu[et al.] // Proc. N atl. A

cad. S ci. 2000. №

97. Р. 6379−6384.

23. T wo novel missense mutations in 9 proteincoupled receptor 54 in a patient with hypogonadotropic hypogonadism /R.K. Semple[et al.] // J. C lin. E ndocrinol. M

etab. 2005. № 90. P. 1849−1855.

24. Z ygote arrest 1 (Zar1) is a novel maternaleffect gene critical for the oocyte-to-embryo transition/ X. W u[etal.]// Nat. G enet. 2003.

№ 33. P. 187−191.