Электронный парамагнитный резонанс в меланопротеиновых волокнах

Актуальность. Человеческий волос представляет собой природное органическое волокно, в состав которого входит белок кератин и биополимер меланин. Учитывая, что данные подсистемы имеют непосредственную связь с процессами, протекающими в организме, волос является важным объектом для научных исследований. Сегодня можно с полной уверенностью утверждать, что методика ЭПР-спектроскопии позволяет более детально изучить специфику этих процессов, проходящих как при формировании волоса (непосредственно в коже), так и процессов проходящих в организме человека в целом. До настоящего времени исследования волос традиционно проводились в двух основных направлениях: косметологическом и медицинском. Медицинское акцентируется не на самом волосе, а, как правило, на биохимических и цитобиологических явлениях, протекающих в волосяной луковице. Терминальные волосяные волокна, являющиеся с точки зрения биологии мертвым клеточным материалом, не рассматривались как объект для полномасштабных физических исследований. Несмотря на то, что волос обладает целым рядом уникальных свойств не отмечено систематического интереса к ним и со стороны специалистов по магнитному резонансу. В качестве исключения можно рассматривать серию работ по ЭПР при фотовозбуждении пигмента и по связи естественной пигментации волос со спектрами различных синтетических меланинов [1,2,3]. Отметим, что волос, представляя собой высокоупорядоченное биоволокно с постоянной скоростью роста, является, по существу, ретроспективным датчиком биохимических процессов в организме за период от недель до нескольких лет. Наглядный пример биоиндикации — седина, когда изменение цвета волос свидетельствует о прекращении синтеза меланинов. Разумно предположить, что современные резонансные методики в состоянии различить более тонкие изменения. Несомненным достоинством самого объекта с точки зрения ЭПР является, в отличие от других биологических тканей, отсутствие в его составе воды.

Мощным стимулом к дальнейшему изучению волоса явилась серия работ австралийских и американских исследователей [4, 5, 6]. Ими, в рентгеновских дифрактограммах волос пациентов с онкопатологией молочной железы, были обнаружены характерные диффузные кольца, свидетельствующие о структурных нарушениях в белках. Поздние эксперименты с использованием синхротронного излучения подтвердили наблюдаемую аномалию. Возникла задача о выявлении подобной аномалии методом ЭПР-спектроскопии.

Кроме того, в последние десятилетия значительно возрос интерес к использованию природных полимеров, в частности биополимеров. Материалы на их основе экологически безвредны и легко утилизируются. Меланопротеиновые волокна (шерсть, перо, волосы) являются широко распространенными природными полимерами, в которых существуют супрамолекулярные наноструктуры [7]. Такие материалы рассматриваются как перспективная база современной нанотехнологии [8]. В этом ряду человеческий волос представляет особый интерес. Химическое модифицирование протеиновых волокон открывает разнообразные возможности для создания новых биосовместимых материалов, которые в настоящее время уже востребованы медициной.

Таким образом, изучение магнитных свойств меланопротеиновых волокон является актуальным как с научной, так и с практической точки зрения.

Целью работы являлось разработка методологической основы и выявление информативных параметров для применения ЭПР в качестве метода медицинской диагностики онкологических заболеваний по изменениям парамагнитных свойств человеческого волоса. Для реализации поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи: 1. Поиск и идентификация всех вкладов в спектр ЭПР пигментной и белковой подсистем при нормальных условиях.

2. Исследование эволюции спектральных характеристик при внешних воздействиях (высокие, низкие температуры, механическое растяжение, ультразвуковое воздействие, у-облучение, растворение и д.р.).

3. Выявление диагностически перспективных спектральных характеристик, чувствительных к структурным изменениям меланопротеиновой системы, обусловленным онкопатологией.

Методы исследования, достоверность и обоснованность результатов. В работе использован известный и хорошо апробированный метод экспериментальных исследований — ЭПР-спектроскопия. Достоверность результатов работы определялась хорошим совпадением экспериментальных спектров с некоторыми данными других авторов.

Научная новизна диссертационной работы заключается в следующих оригинальных результатах:

1. Впервые показано, что ЭПР сигнал меланопротеинового волокна имеет дополнительные компоненты, обусловленные иерархической структурной организацией филаментов а-кератина. Проведено изучение эволюции параметров этих компонент при химическом и механическом воздействии и внешнем у-облучении.

2. Проведена идентификация ЭПР спектров белковой подсистемы волоса. Наряду с линией, характеризующейся неразрешенной тонкой структурой (ДВ=15-^70 Гс, gi=2,00, g2=2,03, g3=2,06), обусловленной цистеиновыми радикалами, выделены две дополнительные компоненты спектра: узкая — с ДВ (300К)=200−500 Гс, g=2,38 и широкая компонента с ДВ (300К)=400−1000 Гс, g=2,20, которые обусловлены комплексами с переносом заряда на базе аминокислотных остатков.

3. Впервые систематически изучена температурная эволюция сигала ЭПР белковой подсистемы волоса (серосодержащие радикалы и КПЗ). Из параметров спектров определены температуры стеклования, плавления, дегидратации и обугливания а-кератина.

4. Впервые проведено экспериментальное изучение зависимости спиновой концентрации в природном меланине при высокой температуре (30(Н550 К). Результаты исследования позволили определить энергию активации триплетного состояния Еа~0,15 эВ.

5. Предложен метод количественного определения относительной доли эумеланинов и феомеланинов в пигменте человеческого волоса с помощью ЭПР-спектроскопии.

6. Впервые представлен сравнительный анализ параметров ЭПР спектров белковой и пигментной подсистем волос здоровых доноров и доноров с клинически выявленным раком молочной железы. Экспериментально обнаружена корреляция между интегральной интенсивностью сигналов ЭПР меланина и кератина.

Практическая значимость результатов исследования состоит в:

1. Классификации спектральных компонент ЭПР сигнала и формулировании модели для парамагнитных центров на базе аминокислотных остатков.

2. Разработка метода подготовки образца человеческого волоса для ЭПР исследований и определения биологически информативных спектральных параметров.

3. Разработке оригинальной методики извлечения кератинового материала из кортекса человеческого волоса.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Утверждение о том, что белковая и пигментная подсистемы человеческого волоса обладают парамагнетизмом.

2. Утверждение о том, что данные подсистемы взаимодействуют и должны рассматриваться как единый меланопротеиновый полиассоциат.

3. Утверждение о том, что ЭПР характеристики надежно регистрируют морфологические состояния кератиновой подсистемы: температуры стеклования, плавления, дегидратации, карбонизации.

4. Утверждение о том, что парамагнитные центры, ответственные за широкий ЭПР сигнал от протеинового волокна, обусловлены иерархической филаментарной структурой а-кератина.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на следующих научных конференциях и школах: IX международный семинар -«Дислокационная структура и механические свойства металлов и сплавов» (Екатеринбург, 2002 г.), «Modern Development of Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy. Basic Physics and Applications in Medicine and ВюЬГр» (Kazan, 2001), Modern Development of Magnetic Resonance (Kazan, 2004), VIII международная школа молодых ученых «Актуальные проблемы магнитного резонанса и его применение» (г. Казань, КГУ, 2005 г.). Кроме этого, результаты данной работы докладывались на ежегодных итоговых научных конференциях УГТУ-УПИ.

Публикации. Основные результаты работы опубликованы в 11 печатных работах, включая: 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 5 статей в материалах международных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и списка цитируемой литературысодержит 131 страницу текста, включая 63 рисунка и 3 таблицы. Библиография содержит 60 наименований.

выводы.

1. Проведены систематические ЭПР исследования более 200 образцов человеческого волоса. Показано, что на всех образцах помимо сигнала меланина (ДВ"4+6 Гс, g=2,004), сигналов от ферросодержащих примесей Fe (III) (ДВ"70+500 Гс, g=4,3) и серосодержащих радикалов на основе цистеина.

ДВ=15ч-70 Гс, gi=2,00 g2=2,03 g3=2,06) зарегистрирован и выделен неразрешенный ЭПР спектр, включающий несколько линий: узкую симметричную компоненту (ДВ (300К)=200−500 Гс, g=2,38) и более широкую компоненту (ДВ (300К)=400−1000 Гс, g~2.2). В результате экспериментов установлено, что ЭПР-центры, ответственные за неидентифицированный сигнал, локализованы в кератиновых ассоциатах и не связаны с парамагнитными примесями.

2. Для ЭПР сигнала меланина проведены расчеты времён спин-решеточной Ть и спин-спиновой Т2, релаксации. Показано, что значение Т2, незначительно изменяется от образца к образцу и для паховых волос в среднем составляет 10″ 9с. Время Tj попадает в интервал от 10″ 4 до 10″ 6 с.

3. Предложен метод количественного определения относительной доли эумеланинов и феомеланинов в пигменте человеческого волоса с помощью ЭПР-спектроскопии. Показано, что в пигменте скальпового волоса здорового взрослого человека может присутствовать до 50% феомеланина, в светлом волосе эумеланин практически отсутствует.

4. Проведены детальные измерения температурных зависимостей основных характеристик ЭПР спектров волос в интервале 100-^550 К. Установлено, что для сигнала кератина лобкового волоса спиновая восприимчивость при низких температурах, с характерной температурой стеклования Т=148 К, соответствует закону Кюри. Методом деконволюции показано, что температурная зависимость 1эпр и ДВ узкой компоненты ЭПР сигнала кератина скальпового волоса в интервале Т>200 К также может быть описана зависимостью Кюри-типа. Установлена взаимосвязь широкого ЭПР.

125 сигнала (~10 Гс) с аминокислотными донорно-акцепторными комплексами (КПЗ). В результате исследования температурной эволюции параметров ЭПР сигнала меланина показано, что для пигмента в диапазоне ЮЗК<�Т<�ЗЗЗК наблюдается характерная частичная делокализация спинов, а при температурах 343К<�Т<523К магнитные моменты переходят в активированное триплетное состояние. Установлено, что материал пигментных гранул соответствует низкоразмерному органическому полупроводнику с Еа~0,15 эВ.

5. Проведены эксперименты по исследованию эволюции параметров ЭПР сигнала человеческого волоса в процессе механического растяжения кератиновых волокон. Показано, что величина нормированной интенсивности 1эпрНорм (е) полного ЭПР спектра устойчива к квазистатическому растяжению в интервале 0<�е<30%. Обнаружено, что вклад широкой компоненты, обусловленный КПЗ, чувствителен к деформации, так что при относительных удлинениях ?>10% становится неразрешим.

6. Проведен сравнительный анализ параметров ЭПР спектров белковой и пигментной подсистем лобковых волос доноров с клинически выявленным раком молочной железы и отсутствием онкопатологии. Установлено, наличие корреляции между интегральной интенсивностью сигналов ЭПР меланина и кератина. Проведенные исследования указывают на необходимость поиска взаимосвязи ЭПР-свойств и наличия онкопотологии среди парциальных вкладов в спектры ЭПР, обусловленных КПЗ.