Синтез белка— сложный процесс, центральную роль в нем играет рибосомамолекулярная машина, задача которой декодировать матричную РНК (мРНК) в соответствующую последовательность аминокислот с помощью аминоацил-тРНК.
Рибосома состоит из рибосомной РНК (рРНК) и белков. В научном мире долго велись споры о функции рРНК, были выдвинуты гипотезы о том, что онаможет являться матрицей, определяющей последовательность синтезируемого белка, или г образует каркас, на который крепятся каталитически активные белковые компоненты. Накопление большого количества биохимических данных, свидетельствующих о том, что рРНК вовлечена в работу рибосомы, открытие каталитической активности-РНК в 80-х годах [1], и наконец, разрешение структуры рибосомы на атомарном уровне позволили установить, что главным компонентом, ответственным за функцию макромолекулярного комплекса является рРНК, а белки выполняют роль скорее структурных, чем функциональных составляющих.
Успехи в определении структуры различных функциональных комплексов рибосомы в сочетании с биохимическими методами, такими, каксайт-направленный мутагенез рРНК, химический пробинг, футпринтинг и фотоаффинная, химическая модификация открывают широкие возможности для установления механизма трансляции и динамики работы рибосомы на молекулярном уровне.
Данные полученные в результате рентгеноструктурного анализа позволили различить отдельные структурные компоненты рибосомы, которые вовлечены во взаимодействия как между собой, так и с основными участниками трансляциитрансляционными факторами и тРНК. Большой конформационной подвижностью в процессе биосинтеза обладают области контакта центрального протуберанца большой и головы малой субъединицы. Именно в этом регионе рибосомы располагаются высоко-консервативные структурные элементы — А-сайтовый палец и 5S рРНК, функциональному исследованию которых и посвящена данная работа.
1. Обзор литературы.
4. Выводы.
1. Укорочение спирали 38 23 S рРНК, приводящее к разрушению В1а «межсубъединичного мостика, замедляет рост клеток, влияет на ассоциацию субчастиц и понижает ОТРазную активность EF-G, индуцированную рибосомой или ее комплексом с деацилированной тРНК, при этом оно не летально для клеток и не вызывает изменений в принципиальных стадиях элонгационного цикла.
2. Пробинг структуры рибосом, содержащих мутацию в спирали 38 23S рРНК, показал, что В1а мостик, образованный спиралью 38 23 S рРНК, может влиять на формирование третичных контактов, соединяющих 5S рРНК со структурными компонентами пептидилтрансферазного центра и элементами, взаимодействующими с элонгационными факторами. Таким образом, локальные изменения структуры могут передаваться по цепям элементов рибосомы на 4 большие расстояния.
3. Среди 246 точечных мутаций в 5S рРНК Saccharomyces cerevisiae только 7 оказались нелетальными для клеток: А20С, C69U, A76U, A79U, U81C, A84G и C93U.
4. Структурные изменения в различных доменах 5S рРНК могут передаваться в район D-петли 5S рРНК и на центр связывания элонгационных факторов в 80S рибосомах Saccharomyces cerevisiae. т.
2.3.
Заключение
.
Удаление участка 872−905 консервативного структурного элемента рибосомыспирали 38 23S рРНК нарушает В1а мостик.. Результаты тестов мутантных ДВ1а рибосом /и vivo и in viro позволяют сделать выводы о роли этого межсубъединичного мостика в рибосоме. Мутация замедляет рост клеток, влияет на ассоциацию субчастиц и понижает СТРазную активность EF-G, индуцированную рибосомой или еекомплексом с деацилированной тРНК. При этом она не детальна для клеток, не вызывает изменений в принципиальных стадиях элонгационного цикла, а также не влияет на способность деацилированной тРНК, связанной в Р-участке, стимулировать ОТРазную активность EF-G. Похожие случаи были описаны в литературе. Так, замещение консервативного G2655 на, А не приводило к функциональным дефектам [91, 93]. Замещение консервативного С2475 на G [238] и мутация C2254U [239] не имели фенотипа, несмотря на то, что С2475 образует консервативную неканоническую обращенную Уотсон-Криковскую пару с основанием нуклеотида G2529 спирали 91 23S рРНК [26], а нуклеотид С2254 защищается тРНК, связанной в, А участке [97].
Пробинг структуры рибосом, содержащих мутацию в спирали 38 23S рРНК подтверждает связь структурных элементов 23S рРНК и то, что локальные измененияструктуры могут передаваться по цепям элементов рибосомы на большие расстояния. Мутация ДВ1а, так же как и другие, описанные в литературе мутации [140, 216], скорее сдвигают равновесие между конформерами в рибосоме, а не полностью разрушают ее структурные элементы. Такой переход может осуществляться, например, при движении спирали 89 23S рРНК, расположенноймежду пептидилтрансферазным центром, и центром связывания элонгационных факторов.
Вероятно, рибосома может использовать множественные, альтернативные пути коммуникации' между функциональными центрами и потеря, одних взаимодействий компенсируется другими. Так, по-видимому, укорочение спирали- 38 23S рРНК, разрушающее В1 а мостик, приводит к тому, что его роль начинают выполнять мостики Bib и В 1с. Интересно, что недавние эксперименты по изучению способности субъединицрибосомы к ассоциации показали, что среди 12 межсубъединичных мостиков, которые были классифицированы Юсуповым и коллегами [28], только В2а и В4 абсолютно необходимы для ассоциации субчастиц [240]. Все мостики В 1а группы включают в себя структурные элементы большой субъсдиницы, связанные с 5S рРНК, а именно спираль 38 23S рРНК (В1а мостик), и белок L5 (Bib, Blc мостики), который взаимодействует с S13 [28, 36]. Для того, чтобы нарушить нормальное функционирование рибосомы, по-видимому, необходимо мутировать одновременно спираль 38 вместе с L5 или 5S рРНК.
Для ЗБ рРНК в литературе были предложены различные функцииТак полагают, что она увеличивает сродство аминоацил-тРНК к рибосоме [141, 142], помогает в формировании, правильной геометрии пептидилтрансферазного центра [144], или увеличивает пептидилтраисферазную активность [137, 141, 143]. Еще до получения структуры 50S субчастицы с высоким разрешением [26], возникла гипотеза о том, что 5S рРНК может связывать функциональные центры рибосомы и передавать между ними конформационный сигнал [145] и, в частности, соединять пептидилтрансферазный центр и центр, ассоциированный: с ОТРазной активностью. Методом мутагенеза и химического пробинга структуры рибосом, содержащих точечную мутацию в спирали 39 в 23S рРНК, показано, что нуклеотиды D-петли 5S рРНК вовлечены в образование третичных контактов, связывающих эти функциональные центры [140].
Структурные изменения в 80S рибосоме Saccharomyces cerevisiae, которые вызывают мутации в 5S pPHK скорее можно отнести к категории слабых. Однако, вместе с результатами о летальности большинства (239 из 246) мутаций в 5S рРНК дляклетки, они четко свидетельствуют о том, что 5S рРНК является высококонсервативной и высокоструктурированной! молекулой. При этом, даже незначительные структурные изменения — в ее доменах могут передаваться в район D-петли 5SрРНК, который взаимодействует с карманом, образованным спиралью 42 25S рРНК, поддерживающей центр, ассоциированный с ОТРазной активностью, спиралью 39 и 89 25S рРНК. Если идея об аллостерической связи структурных элементов рибосомы верна, то «голова» 5 S рРНК может влиять на конформацию «нижней» части молекулы. Таким образом, структурные изменения в области центрального протуберанца большой субъединицы, например, во время относительного поворота субчастиц при транслокации [135, 184] илипри переходе малой субъединицы из «открытого» состояния в «закрытое» при декодировании [112. 136], могут передаваться с «головы» 5S рРНК на D-петлю молекулы, а через нее на другие структурные элементы" рибосомы. Такое предположение подтверждается данными, полученными в этой работе, что мутации в различных доменах 5S рРНК могут потенциально влиять на третичные контакты между спиралями 25S рРНК в 80S рибосоме Saccharomyces cerevisiae, которые связывают структурные элементы пептидилтрансферазного центра и центра связывания элонгационных факторов.
3. Материалы и методы.
3.1. Исследование спирали 38 23S рРНК E.coli. 3.1.1. Выделение 70S рибосом E. coli несущих мутацию ДВ1а.
Выделение ДВ 1а мутантных рибосом проводили из штамма AVS69009 E. coli, в котором все семь рибосомных оперонов (ггп) удалены из хромосомы, а гены 16S, 23S, и 5S рРНК представлены в опероне ггпС на плазмиде pHK-rrnC+ [241]. После замещения, [140] данной плазмиды на плазмиду plkl 192U, несущей мутацию в спирали 38, был получен штамм, продуцирующий только мугантные рибосомы.
Рибосомы выделялись с использованием: модифицированной методики: реассоциации: субчастиц [242]. 500 мл среды LB инокулировали свежей ночной культурой клеток и инкубировали при 37 °C и перемешивании 160−170 грт до Л600 ~ 0,4−0,5. Клетки охлаждали на льду в течение 30 минут (все дальнейшие манипуляции• проводили при +4°С) и собирали центрифугированием при 7000 об/мин: 10 минут: при* 4°G в роторе: GSA. Осадок ресуспендировали в охлажденном буфере для диссоциации H20M1N200S4 (20мМ Hepes-KOH рН 7,5- 1 мМ MgOAc2- 200 мМ NH4C1-.4 мМ Р-меркаптоэтанол), снова осаждали, буфер декантировали и осадок хранили принеобходимости при -20°С.
Полученные осадки дальше ресуспендировали в 3−4 мл буфере для диссоциации H20M1N200S4 и разрушали клетки ультразвуком5 8−10 раз по 15 сек во льду, интенсивность около 5−6, с промежутками по 45 секунд во льду, контролировали лизат по вязкости, прозрачности и температуре.
От клеточного дебриса избавлялись центрифугированием в роторе SS34 при? 15 000 об/мин на. протяжении 30 мин в препаративной центрифуге Sorvall. Из полученного супернатанта отбирали объем, в котором содержалось 180 ОЕгбОпш и наносили на градиент сахарозы 10−40%. Центрифугирование в сахарозномградиенте проводили на: ультрацентрифуге Beckman L7−55 в роторе SW28! в течение 18 ч при 22 000 ¦ об/мин. Субъединицы собирали в одну общую фракцию, не разделяя по субчастицам, доводили до нужного объема буфером для диссоциации, доводили концентрацию ионов магния до 15−17 мМ и осаждали центрифугированиемпри 43 000 об/мин? в роторе Ti-60 в течение 22 часов.
После осаждения растворяли субъединицы в 700- мкл буфера для ассоциации H2oM2oN3oS4= (20мМ Hepes-KOH рН 7.5- 20 мМ MgOAc2- 30 мМ NH4C1- 4 мМ [)-меркаптоэтанол) и центрифугировали в настольной центрифуге в 1,5 мл пробирках Eppendorf при 7000 об/мин 10 минут. После чего проводили реассоциацию рибосомных субъедишш, проинкубировав субъсдиницы 15 мин при 42 °C. 70S частицы отделяли от 30S и 50S субъединиц путем центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10−40% в роторе SW28 в течение 18 ч при 22 000 об/мин. Из сахарозы рибосомы осаждали центрифугированием при 43 000 об/мин в роторе Ti-60 в течение 22 часов. Осадки растворяли в буфере для ассоциации H20M20N30S4. Концентрацию полученных рибосом оценивали спектрофотометрически: ТО.Е.260=24 пмоль 70S Е. coli/sm [243].
3.1.2. Определение зависимости степени ассоциации рибосомных субчастицот, концентрации Mg2+.
Степень ассоциации рибосомных субчастиц рассчитывали по результатам центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы 10−40% (vv/v) в буфере H20M4N30S4 (20мМ Hcpes-KOH рН 7,5- х мМ MgOAc2- 30 мМ NH4C1- 4 мМ р-меркаптоэтанол), с различной концентрацией Mg2+ (5, 14, 21 мМ).
100 мкл 0.4 мкМ раствора рибосом в буфере H20MXN30S4 инкубировали в течение 10 мин при: 37 °C и наносили на градиент концентрации сахарозы 10−40%, который предварительно охлаждали до 4 °C. Центрифугирование проводили в течение 18 часовпри 22 000 об/мин и 4 °C в роторе SW28 (Beckman).
3.1.3. Эффективность polyU зависимого синтеза polyPhe.
Эффективность polyU зависимого синтеза polyPhe проводили согласно методике, описанной в [210].
Трансляцию проводили в два этапа. На первом этапе проводили связывание N-ацетил-фенилаланил-тРНКРЬе. Для чего 5 пмоль рибосом, 7,5 пмоль N-ацетил-фенилаланил-тРНКРЬе, 50 мкг полиуридиловой кислоты (polyU) в буфере, содержащем 10 мМ Hepes-KOH, рН 7,6- 6 мМ Mg (CH3COO):-150 mM NH4C1- 0,6 мМ спермина- 0,4 мМ спермидина- 4 мМ Р-меркаптоэтанола инкубировали 10 мин. при 37 °C после чего увеличивали объем: реакционной смеси с 25 мкл до 50 мкл, оставив: концентрацииионов неизменными, и инкубировали 25 мин. при 37 °C.
На втором этапе к исходной смеси для связывания добавляли 150 мкл смеси, включавшей 25 000 пмоль фенилаланина (Phe) с удельной активностью [I4C]Phe 50 cpm/пмоль. 3 мкг пируваткиназы, 30 мкл S100 экстракта, а также 30 мкл буфера. содержащего 40 мМ Hepes-KOH, рН 7,6- 750 мМ NH4CI: 16 мМ Р-меркаптоэтанола- 3 мМ спермина- 2 мМ спермидина- 10 мМ АТРТ мМ GTP- 50 мМ фосфоенолпирувата.
Для определения уровня ошибочного включения' лейцина в реакционную смесь добавляли также 250 пмоль лейцина (Leu) с удельной активностью [3H]Leu 10 000 cpm/пмоль и стрептомицин до конечной концентрации 5 мкМ, Конечная концентрация: солей на втором этапе трансляции была та же, что и при связывании, только количество.
76 ионов Mg2f было уменьшено до 3 мМ. Синтез проводили при 37 °C на протяжении 5 мин, после чего реакцию останавливали добавлением 1 мл раствора, содержащего 10% ТХУ и по 0,5% (w/v) фенилаланина и лейцина. Смеси инкубировали 10 мин при 100 °C, после чего фильтровали на стеклянных фильтрах (Schleicher-Schull), промывали десятикратным объемом раствора ТХУ/аминокислоты и десятикратным объемом изопропанола. Отрицательные контроли, без polyU или без рибосом, обрабатывали аналогично.
Подсушенные на воздухе в течение часа фильтры интенсивно встряхивали в сцинтилляторе OCS (Amersham) и радиоактивность обсчитывали на счетчике.
З.Г.4: Тестирование способности* мутантных рибосом ДВ1а осуществлять базовые стадии процесса трансляции in vitro:
3.1.4.1. Получение MFK-mPHK.
Для? получения MFK-mPHK был использован ПЦР-продукт, полученный при амплификации участка плазмиды рЕТЗЗВ+, несущей последовательность MFK-mPHK с клонированным с З'-конца гена промотором РНК-полимеразы бактериофага Т7.
Реакцию транскрипции проводили в течение ночи при 37 °C в объеме 300 мкл.
Реакционная смесь содержала 40 мМ Tris-HCl, рН 8,0- 6 мМ MgCb- 10 мМ ДТТ- 2 мМ спермидина, по 1 мМ каждого из рибонуклеозидтрифосфатов, 3 мМ ДТТ, 0,1 мг/мл.
BSA (New England Biolabs), 0,01 ед./мкл пирофосфатазы, от 1 до 5 мкг ПЦР-продукта,.
0,5 ед./мкл ингибитора РНКаз RNasin (Promega) и 1,7 ед./мкл Т7-РНК-полимеразы (New.
England Biolabs).
Продукт транскрипции очищали электрофорезом в 8% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии 7М" мочевины, проводили фенол-хлороформную экстракцию смесью фенол: хлороформ:изоамиловый спирт 125:24:1 рН. 4,5 (Ambion) и дважды осаждали этанолом. Концентрацию конечного препарата оценивали спектрофотометрически, измеряя поглощение аликвоты при 260 нм.
На 5'-коиец ДНК праймера, комплементарного З'-концевой области MFK-mPHK вводили радиоактивный фосфат Р при помощи реакции кинирования. Реакцию^ проводили в буфере, содержащем 50 мМ Tris-HCl рН 8,2- 10 мМ MgCb- 0,1 мМ EDTA- 5 мМ DTT, 0,1 мМ спермидина, 500 пмоль праймера, 20 ед. Т4-полинуклеотидкиназы (Roche, 10 ед./мкл) и 56 пмоль [уР]АТР (Amersham Biosciences Part of GE Healthcare удельная активность 220 ТБк/ммоль или 6000 Ки/ммоль). Кинирование проводили при 37 °C в течение 30 мин. после чего киназу инактивировали. нагреванием в течение 15 минут при 65 °C.
Далее производили отжиг полученного радиоактивного праймера на З'-конец MFK-mPHK для чего нагревали эквимолярные количества праймера и MFK-mPHK в буфере H-oM6Ni?oS4Spo.o5Spm2 (20мМ Hepes-KOH рН 7,5- 6 мМ MgOAc2- 150 мМ NH4CI- 4 мМ р-меркаптоэтанол- 0,05 мМ спермин- 2 мМ спермидин) до 75 °C с последующим охлаждением до 37 °C. Полученную MFK-mPHK с отожженным праймером использовали в последующих экспериментах.
3.1.4.2. Формирование комплексов.
Все реакции проводили в буфере H2oM6Ni5oS4Spo, o5Spm2. На первой стадии, формировали инициаторный комплекс, содержащий fMet-TPHKfMet в Р-участке. Реакцию проводили в 10 мкл. Концентрация 70S рибосом была 0, Г мкМ, MFK-mPHK -0,1 мкМ, fMet-TPHKfMct — 0,1 мкМ, IF-2 — 0,3 мкМ, IF-3 0,3 мкМ и GTP с общей концентрацией 0,2 мМ инкубировали 10 мин при 37 °C.
На втором этапе к исходной смеси прибавляли 5 мкл раствора? до конечных концентрации EF-Tu 0,2 мкМ, EF-Ts — 0,2 мкМ, Phe-TPHKphe 0,2 мкМ, и GTP с общей концентрацией 0,5 мМ. Добавляемую смесь предварительно инкубировали при 37 °C в течение 1 мин. Полученный раствор инкубировали 10 мин при 37 °C.
На третьем этапе в ту же смесь прибавляли 2 мкл смеси, до конечных концентраций EF-G — 0,1 мкМ и GTP общей концентрацией- 0,5 мМ, инкубировали в течение 10 мин при Ю мин при 37 °C.
На четвертом этапе следующем этапе в систему прибавляли 5 мкл раствора, до конечных концентраций EF-Tu — 0.2 мкМ^ EF-Ts — 0.2 мкМLys-TPHKLy5 — 0,2 мкМ и до концентрации 0,5 мМ. Полученный раствор инкубировали- 10 мин при 37 °C.
3:1.4.3. Анализ комплексов:.
Эффективность отдельных стадий, элонгационного цикла бьша детектирована методом тупринтинга (от англ. toe-printing), который позволяет определять положение: рибосомы на мРНК и полноту образования комплекса [211]. Проводили 4 независимых одинаковых эксперимента каждый из которых останавливался на одном из этапов. Дляэтого в систему прибавлялись все четыре дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфата до концентрации 0,4 мМ, а также 0,5 мкл (10 ед.) AMV обратной транскриптазы (Roche). Обратную транскрипцию проводилив течение 15 мин при 37 °C. Затем смесь подвергали фенол-хлороформной экстракции и осаждали спиртом. Высушенные после осаждения образцы растворяли в краске, содержащей 10 мМEDTA, 95% [v/v] деионизованного формамида, 0,3% [w/v] бромфенолового синего, 0,3% [w/v] ксиленцианола. Анализ продуктов обратной транскрипции проводили электрофорезом в 10% полиакриламидном голе, содержащем 7 М мочевину. Протекание отдельных стадий трансляции идентифицировали методом радиоавтографии.
З.П5. Тестирование ОТРазной активности EF-G, индуцированной различными рибосомными комплексами.
Для реакции использовали 0,04 мкМ рибосом, polyU и тРНКр1к. Реакцию проводили в буфере 60 мМ Hepes-KOH (рН 7,6) — 6 мМ MgCl2- 80 мМ NH4C1- 8 мМ р—меркаптоэтанол при 37 °C. Рибосомы, тРНК и мРНК инкубировали 10 мин при 37 °C, после чего добавляли EF-G до концентраций 0,0- 0,1- 0,2- 0,4- 0,6- 0,8- 1,0 мкМ и 5−10 мкКи у-32Р-гуанозинтрифосфата до конечной концентрации 0,5 мМ. Реакцию останавливали через 20 минут добавлением равного объема 20% муравьиной кислоты. ОТРазную активность оценивали, исходя из данных тонкослойной хроматографии, которую проводили как: описано в [244]. Пластины с PEl-целлюлозным покрытием промывали буфером 50 мМ КН2РО4 рН 3.5, после высыхания наносили аликвоту образца, после высыхания нижний край пластины помещали в 50 мМ КН2РО4 рН 3.5 в хроматографической ванночке. После достижения фронтом уровня 1 см выше линии нанесения-образцов подвижную фазу заменяли на 500 мМ КЫ2РО4 рН 3.5. После окончания хроматографии пластины высушивали, распределение радиоактивности детектировали с помощью Phosphorlmager (Typhoon 8600, Molecular Dynamics), интенсивности рассчитывали на программе ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics).
3.1.6. Химический пробинг рибосомных структуры рибосом E. coli-несущих мутацию в спирали 38 23S рРНК.
В работе использовалась классическая5 методика пробингарибонуклеопротеидовреагентами, специфичными для азотистых оснований — диметилсульфатом, кетоксалем: (3-этоксибутанон-2-аль-1) и водорастворимым карбодиимидом (1-Циклогексил-3-(2-морфолиноэтил)-карбодиимидлге?то-/7-толуолсульфонат или СМСТ) [215].
3.1.6.1. Буферы и растворы.
Для приготовления буферов деионизованную воду (сопротивление^ 18 QOm,.
Millipore) инкубировали 12 часов припостоянном перемешивании с 1/1000 объема диэтилпирокарбоната (DEPC,. Sigma), — после чего автоклавировали 1 час на жидком цикле Весь пластик для? эксперимента был или одноразовый стерильныйили: автоклавированный.
Растворы и буферы, необходимые для пробинга структуры рибосомы приведены в таблице 3.1. Для обратной транскрипции с рРНК использовали набор олигодезокенрибонуклеотидных праймеров (Таблица 3.2). Конечная концентрация раствора котированного праймера была 0.19 — 0.20 пмоль/.мкл.
